Lezione n.13.4 Funzioni cognitive Basi neurali della memoria © G. Cibelli, 2006 Fisiologia del Sistema Nervoso Lezione n.13.4 The mollusk Nervous System Pre- and post-synaptic cells identified by morphological, electrophysiological and immunological criteria can be plated in culture where they form active chemical synapses showing the same biochemical and electrophysiological features as in vivo © G. Cibelli, 2006 Fisiologia del Sistema Nervoso Lezione n.13.4 Immunocytochemistry and electrophysiology In order to establish an in vitro neuronal network, Helix pomatia metacerebral giant cell (C1) and the B2 target neuron were cocultured B2 Chemical connection between C1 and B2 neurons in culture was tested by electrophysiologic measurements © G. Cibelli, 2006 C1 Fisiologia del Sistema Nervoso Le forme semplici dell’apprendimento implicito determinano modificazioni nell’efficacia della trasmissione sinanptica Questo circuito semplificato presenta gli elementi chiave interessati nel riflesso di retrazione delle branchie ed i siti del circuito a livello dei quali si manifesta il processo dellʼabitudine. Nel circuito ci sono circa 24 neuroni sensitivi (meccanocettori) localizzati nel ganglio addominale che innervano la cute del sifone. Queste cellule sensitive utilizzano come neurotrasmettitore il glutammato e vanno a terminare su un gruppo di 6 motoneuroni che innervano le branchie e su parecchi gruppi di interneuroni eccitatori (Ecc) ed inibitori (in) che contraggono sinapsi con i motoneuroni. La stimolazione ripetuta del sifone determina una depressione della trasmissione sinaptica tra i neuroni sensitivi e motori, nonché fra alcuni interneuroni e le cellule effettrici L’abitudine determina una depressione della trasmissione sinaptica Lʼabitudine a lungo termine del riflesso di retrazione delle branchie trova un corrispettivo a livello cellulare in una notevole depressione dellʼefficacia delle sinapsi interposte fra i neuroni sensitivi ed i motoneuroni Confronto dei potenziali sinaptici di un neurone sensitivo e di un motoneurone in un animale di controllo (non addestrato) ed in un animale sottoposto ad abitudine a lungo termine. Nellʼanimale abituato il potenziale sinaptico del motoneurone non è più rilevabile anche una settimana dopo lʼaddestramento. Percentuale media delle connessioni fisiologicamewnte attive in tempi diversi negli animali abituati dopo un addestramento che ha determinato la comparsa di abitudine a lungo termine La sensibilizzazione determina un’esaltazione della trasmissione sinaptica La sensibilizzazione a breve termine del riflesso di retrazione delle branchie in Aplysia comporta la facilitazione presinaptica La sensibilizzazione del riflesso si può ottenere applicando uno stimolo nocivo ad una parte del corpo, come la coda. Gli stimoli portati sulla coda attivano i neuroni sensitivi che eccitano gruppi di interneuroni facilitanti. Le cellule facilitanti, alcune delle quali impiegano la serotonina come neurotrasmettitore, prendono contatto sinaptico con le terminazioni dei neuroni sensitivi che innervano la cute del sifone e vi determinano unʼesaltazione della liberazione del neurotrasmettitore per facilitazione presinaptica Lʼazione della 5-HT e di altri neurotrasmettitori facilitanti determina un aumento della liberazione del neurotrasmettitore, modulando direttamente il processo di liberazione e provocando la chiusura di canali per il K+, che determina infine un aumento della durata del potenziale di azione ed un conseguente aumento dellʼingresso di Ca2+ attraverso un canale specifico. La 5-HT provoca questi effetti interagendo con un recettore che si lega ad una proteina-G capace di aumentare lʼattività dellʼadenilil-ciclasi (via 1). La 5-HT aumenta anche la disponibilità del neurotrasmettitore mobilizzando le vescicole sinaptiche dal pool stazionario a quello facilmente liberabile a livello delle zone attive ed aumenta anche direttamente del dispositivo molecolare preposto alla liberazione del neurotrasmettitore per esocitosi (via 2). La 5-HT provoca altresì lʼapertura dei canali Ca2+ di tipo L (via 3). La seconda e la terza cia sono espressione dellʼattività congiunta della proteinchinasi AMPc-dipendente e della protein-chinasi C che è una seconda chinasi attivata dalla 5-HT. La sensibilizzazione a lungo termine comporta una facilitazione delle connessioni fra neuroni sensitivi e motoneuroni Tipici potenziali sinaptici di un neurone sensitivo del sifone e di un motoneurone delle branchie in un animale di controllo ed in un animale sottoposto ad addestramento per lʼacquisizione di una sensibilizzazione a lungo termine attraverso stimolazione della coda I dati rappresentano la mediana della durata della retrazione del sifone, che viene utilizzata per valutare lʼintensità del riflesso Valori della mediana dellʼampiezza dei potenziali postsinaptici (PSP) di un motoneurone delle branchie isolato dal gruppo degli animali di controllo e di un altro motomneurone isolato dagli animali sensibilizzati Diagramma schematico dei due principali gruppi di modificazioni che hanno luogo nei neuroni sensitivi del riflesso di retrazione delle branchie e che accompagnano lo sviluppo di una memoria a lungo termine dovuta a sensibilizzazione in Aplysia: (1) attività persistente della protein-chinasi A e (2) modificazioni morfologiche. La facilitazione a breve termine comporta la modificazione covalente di proteine preesistenti (vie 1 e 2). Queste proteine così modificate determinano la chiusura di canali k (via 2) e aumentano sia la disponibilità che la liberazione del neurotrasmettitore (via 1). La facilitazione a lungo termine richiede la sintesi di nuove proteine. L’abitudine a lungo termine e la sensibilizzazione comportano modificazioni strutturali nelle terminazioni presinaptiche dei neuroni sensitivi Lʼabitudine a lungo termine determina la perdita di contatti sinaptici mentre la sensibilizzazione porta ad un loro aumento Gli istogrammi mettono a confronto il numero delle terminazioni presinaptiche osservate negli animali di controllo con quelli che si osservano negli animali di controllo con quelli che si osservano negli animali che hanno acquisito unʼabitudine ed una sensibilizzazione a lungo termine Condizionamento classico del riflesso di retrazione delle branchie in Aplysia Il diagramma illustra le vie nervose interessate nel condizionamento. Un colpo applicato alla coda (SI) eccita i neuroni facilitanti che entrano in contatto con le terminazioni presinaptiche dei neuroni sensitivi che innervano il mantello ed il sifone. Ciò configura il fenomeno della sensibilizzazione. Tuttavia, quando la via che proviene dal mantello viene attivata da uno SC immediatamente prima di uno SI, nei neuroni sensitivi del mantello insorgono modificazioni che li inducono a rispondere in maniera amplificata a successive stimolazioni che provengono dagli interneuroni facilitanti della via SI. Questo è il meccanismo del condizionamento classico; esso amplifica la risposta della via SC e la limita a questa stessa via. Il condizionamento classico modifica l’attività di singole cellule Due neuroni sensitivi vengono stimolati lʼuno indipendentemente dallʼaltro. La stimolazione del neurone sensitivo che innerva il mantello (SC+) è accompagnata con lʼSI (un colpo applicato alla coda), mentre la stimolazione del neurone sensitivo che innerva il sifone (SC-) non è accoppiata con lʼSI. Dopo lʼaddestramento il potenziale postsinaptico eccitatorio evocato dal neurone sensitivo accoppiato era molto più ampio di quello evocato dal neurone non accoppiato Modello molecolare delle attività sinaptiche che stanno alla base del condizionamento classico Nella via non accoppiata (SC-) il neurone sensitivo non è attivo prima che lo SC venga presentato e, di conseguenza, i suoi canali Ca2+ sono chiusi quando viene presentato lo stimolo incondizionato (SI) Nella via accoppiata (SC+) il neurone sensitivo è già attivo per via di SC e perciò i suoi canali Ca2+ sono aperti quando viene presentato lʼSI. Il Ca2+ intracellulare si lega alla calmodulina ed interagisce con lʼadinilil-ciclasi, che va incontro ad una modificazione di conformazione che ne esalta la capacità di sintetizzare lʼAMPc in risposta alla serotonina liberata dalla via che media lʼSI. Le aumentate quantità di AMPc attivano una quantità maggiore di protein-chinasi AMPc-dipendente, il che conduce ad una liberazione di neurotrasmettitore che è molto maggiore di quella che sarebbe stata liberata se gli stimoli non fossero stati accoppiati. Potenziamento a lungo termine (LTP) nell’ippocampo Lʼippocampo possiede tre vie afferenti principali. La via perforante (1) che proviene dalla corteccia entorinale, forma connessioni eccitatorie con i granuli presenti nel giro dentato. Gli assoni dei granuli formano le fibre muscoidi (2). Questa via entra in connessione con le cellule piramidali dellʼarea CA3 dellʼippocampo. Le cellule CA3 proiettano alle cellule piramidali di CA1 attraverso le collaterali di Schaeffer (3). Gli effetti del potenziamento a lungo termine di una cellula del campo CA1 dell’ippocampo Nel grafico è riportato lʼandamento (velocità di sviluppo) di un potenziale postsinaptico eccitatorio della cellula. Lʼandamento del potenziale è un indice dellʼefficacia sinaptica. I potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) sono stati registrati extracellularmente. Ogni 10 secondi veniva erogato uno stimolo test. Per evocare il potenziamento a lungo termine venivano applicati, alle collaterali di Schaeffer, due treni di stimoli della durata di un secondo, alla frequenza di 100 Hz, separati lʼuno dallʼaltro da un intervallo di 20 secondi. LʼLTP che veniva generata aveva una durata di parecchie ore. Il potenziamento a lungo termine nel campo CA1 dell’ippocampo presenta i caratteri della cooperatività, dell’associatività e della specificità Nella figura è rappresentata una cellula piramidale che riceve afferenze sinaptiche rispettivamente deboli e forti da due fascetti di fibre collaterali di schaeffer. A. La stimolazione tetanica delle sole afferenze deboli non determina la comparsa di potenziamento a lungo termine in questa via. B. La stimolazione tetanica congiunta sia delle afferenze deboli che di quelle forti determina la comparsa di potenziamento a lungo termine in entrambe le vie. C. La stimolazione tetanica delle sole afferenze forti determina la comparsa del, potenziamento a lungo termine in questa via ma non in quella delle afferenze deboli Il modello dell’induzione del potenziamento a lungo termine: trasmissione sinaptica normale Nel corso della normale trasmissione sinaptica a bassa frequenza, il glutammato liberato dalle terminazioni presinaptiche agisce sia sui recettori NMDA che su quelli non.NMDA (Q/K). Na+ e K+ tuttavia passano soltanto attraverso i recettori-canali non-NMDA in quanto, a livello di riposo del potenziale di membrana, i canali-recettori NMDA non bloccati dal Mg2+. Il modello dell’induzione del potenziamento a lungo termine: induzione di LTP Quando la membrana postsinaptica viene depolarizzata dallʼazione dei recettori-canali nonNMDA, come accade nel corso della stimolazioni tetaniche che danno origine al potenziamento a lungo termine . La depolarizzazione toglie il blocco degli Mg2+ ai canali NMDA. Ciò consente il flusso di Na+, K+ e Ca2+ attraverso questi canali. Lʼaumento di Ca2+ che ne consegue a livello delle spine dendritiche attiva le chinasi calcio-dipendenti (calcio-calmodulina e la chinasi C) che determinano la comparsa di LTP. Quando è stato indotto un LTP, la cellula postsinaptica libera un segnale retrogrado , che probabilmente agisce sulle chinasi presenti nella terminazione presinaptica, e da origine al persistente aumento della liberazione di neurotrasmettitore che è alla base del prolungarsi nel tempo dellʼLTP. Sezione trasversa di ippocampo di cervello di ratto LTP nelle sinapsi delle fibre muscoidi dell’ippocampo di ratto Varietà di relazioni sinaptiche in funzione della modificazione dell’attività Eventi responsabili dell’induzione della LTP e della LTD