Istruzioni

AMPLISET IOC
Identificazione della mutazione (C-T)
per l’enzima Metilentetraidrofolato Reduttasi
Cod. GD 303
40 TESTS
SOLO PER USO RICERCA
Istruzioni D’uso
INTRODUZIONE: L’accumulo di omocisteina può dipendere da un blocco metabolico a livello della trasformazione dell’omocisteina in cistationina
oppure, da una mancata rimetilazione dell’omocisteina in metionina. La forma classica di severa iperomocisteinemia è causata da una deficienza di
cistationina sintetasi che catalizza la formazione di cistationina a partire da omocisteina e serina. L’enzima MTHFR catalizza, invece, la riduzione del
5,10-metilentetraidrofolato a 5-metiltetraidrofolato, la forma predominante di folato circolante e donatore di carbonio nel processo di rimetilazione della
omocisteina a metionina. Una mutazione C-T, che inserisce una Valina al posto di una Alanina, è stata correlata con una ridotta attività ed una aumentata
termolabilità di questo enzima. Ciò determina in soggetti omozigoti per la mutazione, un signicativo aumento dei livelli plasmatici di omocisteina
circolanti, a causa della sua mancata trasformazione in metionina. La deficienza severa di 5,10-metilentetraidrofolato Reduttasi (MTHFR) è il più
comune difetto legato ai processi metabolici dei folati con conseguente iperomocisteinemia, omocistinuria e bassi livelli di metionina. I soggetti portatori
della patologia presentano nell’infanzia o nell’adolescenza severi disturbi legati allo sviluppo motorio, disturbi psichiatrici ed altre anormalità
neurologiche. La iperomocisteinemia a digiuno (elevati livelli plasmatici di omocisteina circolante) è stata correlata, inoltre, con un aumentato rischio di
malattie vascolari cerebrali, periferiche e coronariche. La ricerca della mutazione MTHFR (C-T) viene eseguita previa amplificazione con primer
specifici di un frammento di 198 bp, con successivo taglio di restrizione ad opera dell’enzima HinfI. La mutazione introduce un sito di restrizione
riconosciuto dall’enzima HinfI. In altri termini l’allele normale non viene tagliato e, pertanto non produce alterazioni del frammento amplificato, mentre
l’allele mutato produce due frammenti di 175 e 23 bp.
Applicabilita’:
Volume del campione:
Numero di test:
Tempi di esecuzione:
Conservazione:
Stabilità:
Reagenti richiesti:
non compresi nel kit
su campioni di DNA genomico estratto con GD205 DNA-EXTRA Kit o GD241 Micro Extra DNA Kit
da 5 a 20 µl di sangue intero
40 amplificazioni
4 ore in funzione del protocollo di amplificazione e del tipo di termociclatore in uso
a - 20 °C (spedizione refrigerata)
Superiore a 12 mesi se correttamente conservato
• Kit DNA TAQ polimerasi GD213
• AGAR Kit GD212
• Kit DNA EXTRA o Kit DNA MICRO GD205- GD241
Caratteristiche dei reagenti: • High Purity,DNAsi-RNAsi Free
Materiali richiesti:
• Portaprovette refrigerato
• Puntali con barriera anti-aerosol
• Tubi NO-Oil
Strumenti richiesti
• Termociclatore
1) da 0.5-10 µl
• Set di pipette pre PCR
2) da 5-50 µl
3) da 50-200 µl
Avvertenze: Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter disporre di un set di micropipette dedicate
esclusivamente alla reazione di amplificazione. Si suggerisce di eseguire tutte le operazioni in cappa biologica ed in ghiaccio. E' tassativo l'uso di guanti
durante la manipolazione di campioni e reagenti.
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE:
Vengono sottoposti ad analisi, campioni di sangue estratti con il Kit DNA MICRO GD-241. La risospensione dell’estratto avviene in 50 µl di acqua sterile.
CONTENUTO DEL KIT E SUO UTILIZZO:
1) PRIMER IOC-1 :
Conservazione:
2) PRIMER IOC-2 :
Conservazione:
3) SOLUZIONE AMPLI-1:
Conservazione:
4) SOLUZIONE di MgCl2 25mM:
Conservazione:
5) AMPLI POLYMER
Conservazione:
6) ENZIMA Hinf1°
Conservazione:
7) NE BUFFER 10X
Conservazione:
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codice colore GIALLO
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore TRASPARENTE
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore VIOLA
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore GIALLO
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore BIANCO
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore NERO
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore ARANCIONE
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
NOTA BENE Preparazione: centrifugare i tubi su microcentrifuga per 1 minuto alla massima velocità, prima di rimuovere il tappo.
1) Importante: come prevenire la contaminazione dei Campioni :
a) adoperare sempre guanti monouso e scartarli dopo aver trattato il campione
b) non toccare la parte inferiore del tappo che copre i tubi
c) preparare eventuali controlli positivi per la reazione di amplificazione solo dopo aver ultimato la preparazione di tutti i campioni.
d) usare per la dispensazione micropipette dedicate e munite di puntali provvisti di barriera antiaerosol.
2) Utilizzare TAQ Polimerasi commercializzata dalla P.E. o il kit “Dna TAQ Kit” GD 213
3) I dNTPs sono normalmente disponibili in soluzioni singole 100 mM (Pharmacia e Boeringher) o nel "Dna TAQ Kit", pronti all'uso.
Poichè il processo di scongelamento e ricongelamento può provocarne la defosforilazione, è opportuno preparare una mix 10 mM da conservare a -20°C in aliquote da 25 µl e da
utilizzare per ogni singolo set di campioni. Scongelare solo prima dell'uso ed eliminare eventuali residui.
ESECUZIONE DELLA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE:
1) PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX:
IMPORTANTE: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in
ghiaccio. Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine
indicati nella tabella:
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
H2O sterile
q.b. a 80 µl finali
tampone AMPLI-1 10X
10 µl
Ampli-Polymer
10 µl
dNTPs (10 mM)
2 µl
Primer IOC-1
2 µl
Primer IOC-2
2 µl
MgCl2 25 mM
8 µl
DNA TAQ
0,5 µl (2,5 U.I.)
VOLUME TOTALE
80 µl x (n. test)
2) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI CONTROLLI:
• Distribuire 80 µl di Master Mix in ciascun tubo.
• Campioni: distribuire 20 µl di Campione in ciascun tubo (1-10 ng di DNA).
• Porre in termociclatore preriscaldato a 94°C.
AMPLISET IOC
Cod. GD 303
3) AMPLIFICAZIONE:
Identificazionedellamutazione (C-T)
perl’enzimaMetilentetraidrofolatoReduttasi
• Eseguire il seguente protocollo di amplificazione :
1 ciclo
2 cicli
33 cicli
1 ciclo
STORAGE
Istruzioni D’Uso:
94° C
95° C
92° C
72° C
4° C
5 min.
20 sec.
20 sec.
10 min.
40 TEST
60° C
60° C
30 sec.
30 sec
72° C
72° C
30 sec.
30 sec.
SOLO PER USO RICERCA
Rev. 3 Mag 2001
PROTOCOLLO DI TAGLIO CON ENZIMA HINF1°:
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
1,9 µl
H2O sterile
NE Buffer 10X
3,0 µl
Enzima Hinf1°
0,1 µl
VOLUME TOTALE
5 µl
Campione
20 µl
• Porre in termociclatore a 37°C per 3 ore
Eseguito il taglio con l’enzima di restrizione,i campioni devono essere rivelati mediante
separazione in Gel di Agarosio al 4% colorato con Bromuro di Etidio
Interpretazione dei risultati
Rivelare il prodotto di digestione su gel di Agarosio 4% utilizzando il kit GD 212 “AGAR
kit”.
Fig 1 Esempio di Gel di Agarosio al 4%
1 = Prodotto di amplificazione da DNA di soggetto Omozigote
Recessivo (c1)
2 = Taglio di restrizione con Hinf1° del campione n°1
3 = Prodotto di amplificazione da DNA di soggetto Eterozigote (c2)
4 = Taglio di restrizione con Hinf1° del campione n°2
5 = Taglio di restrizione su Controllo Eterozigote
6 = Taglio di restrizione su Controllo Omozigote
7 = Marker VIII
PRODOTTO E DISTRIBUITO DA:
G ENE D IA
S. R . L .
AMM. E PROD.: Via Lombarda,169 55013 LAMMARI LU
TEL/FAX 0583962672 - EMAIL: [email protected]
RIC. E SVIL.: Trav. M. Pietravalle, IIa 80100 NAPOLI
TEL/FAX 0815465026 – EMAIL : [email protected]
PRODUZIONE: Email: [email protected]
WEB: www.genedia.it