Istruzioni

RNA Spin Clean C Kit
Retrotrascrizione di RNA
Cod. GD 206
40 TESTS
SOLO PER USO RICERCA
Istruzioni D’uso
INTRODUZIONE: La rivelazione di virus a RNA è una delle applicazioni che richiede maggior attenzione e cautela, poichè la eventuale infezione può
divenire in breve tempo letale per l’ organismo. Ne sono esempi il virus dell’ immunodeficienza umana (HIV-1/2) e dell’ epatite C (HCV). E’, quindi,
particolarmente rilevante stabilire la presenza del virus nella fase precoce dell’ infezione, in modo tale da intervenire al meglio con la terapia. La
reazione di amplificazione può essere applicata all’ RNA dopo retrotrascrizione di quest’ultimo a cDNA, ad opera di una Trascrittasi Inversa. Il kit è
stato realizzato per garantire la massima efficienza di sintesi di cDNA complementare al filamento positivo di RNA di HCV. Il processo di
Trascrizione,purtroppo, non ha un’efficienza elevata (generalmente, in condizioni ottimali, tale reazione ha una resa non superiore al 10%); è pertanto
necessario che i reagenti utilizzati e il protocollo di lavoro siano ottimizzati in modo tale da consentire all’ Enzima di Trascrizione inversa di lavorare
con la massima specificità ed efficienza. Tutti i componenti del Kit Rna SPIN-CLEAN C (GD206) sono stati selezionati per ottenere i massimi risultati,
così come i protocolli di lavoro sono stati sviluppati per la rivelazione di HCV-RNA. La specificità è garantita dal fatto che il riconoscimento della
regione 5'-UTR del genoma virale viene ottenuto con l’ ausilio di un Primer Antisenso (GDHCV-A) appositamente disegnato. L’ RNA virale viene,
inoltre, opportunamente protetto da un inibitore di Ribonucleasi (compreso nel Kit) che non interferisce con l’ attività della Trascrittasi Inversa. Tutti i
reagenti sono sterili e strettamente privi di Ribonucleasi.
Applicabilità:
Volume del campione:
Numero di test:
Tempi di esecuzione:
Conservazione:
Stabilità:
Reagenti richiesti:
non compresi nel kit
Caratteristiche dei reagenti:
Materiali richiesti:
Strumenti richiesti
su RNA estratto e purificato per mezzo del kit RNA-ISOPUR (GD215) da campioni di siero.
8 µl di estratto
40 trascrizioni
75 minuti
-20°C..
Superiore a 12 mesi se correttamente conservato
• dNTPs
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High Purity, DNAsi-RNAsi Free
Portaprovette Refrigerato
Puntali con barriera anti-aerosol
Tubi No-Oil
TERMOCICLATORE programmabile oppure INCUBATORE 42°C-100°C
• Set di pipette pre PCR
1) da 0.5-10 µl
2) da 5-50 µl
Avvertenze:Per il completo utilizzo del kit e per limitarne il rischio di contaminazione, si suggerisce l’esecuzione simultanea di almeno 10 campioni.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter disporre di un set di micropipette dedicate. Si suggerisce
di eseguire tutte le operazioni in cappa biologica ed in ghiaccio. E’ tassativo l’uso di guanti durante la manipolazione di campioni e reagenti.
CONTENUTO DEL KIT E SUO UTILIZZO:
1) PRIMER GDHCV-A:
Conservazione:
2) H2O-DEPC:
Conservazione:
3) TAMPONE DI TRASCRIZIONE:
Conservazione:
4) R.I.: (1000 U.I.)*
Conservazione:
5) TRASCRITTASI INVERSA: (250 U.I.)**
Conservazione:
6) SOLUZIONE DI MgCl2 (25MM):
Conservazione:
7) CONTROLLO POSITIVO***:
Conservazione:
8) CONTROLLO NEGATIVO****:
Conservazione:
*ATTENZIONE:
Preparazione:
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codice colore GIALLO
-20° C
codice colore TRASPARENTE
-20° C
codice colore VIOLA
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore TRASPARENTE
-20° C (prelevare solo prima dell’uso)
codice colore NERO
-20°C
codice colore GIALLO
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore ROSSO
-20°C
codice colore VERDE
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
Il numero di Unità per test è di 20 U.I.L’enzima viene fornito ad una concentrazione più elevata onde
garantirne una migliore conservazione. In etichetta è riportata la concentrazione espressa in U.I./µl.: il
volume per test da utilizzare va calcolato in funzione della concentrazione indicata sul tubo.
Preparazione:
Il numero di Unità consigliato per test è di 5 U.I. L’enzima viene fornito alla concentrazione madre onde
**ATTENZIONE:
garantirne una migliore conservazione. Il volume per test da utilizzare va calcolato in funzione della
concentrazione indicata sul tubo.
Conservazione:
-80° C per uso non continuativo , -20° C per uso entro la settimana (prelevare solo prima dell’ uso).
***ATTENZIONE: a) IMPORTANTE: come prevenire la contaminazione dei campioni con il Controllo Positivo che è un potenziale mezzo di
contaminazione e va trattato, pertanto, osservando scrupolosamente le seguenti cautele:
b) adoperare sempre guanti monouso e scartarli dopo aver trattato il controllo
c) non toccare la parte inferiore del tappo di chiusura del tubo contenente il controllo positivo (adoperare questa precauzione
per ogni tubo trattato).
d) preparare il controllo positivo per la reazione di amplificazione solo dopo aver ultimato la preparazione di tutti i campioni.
e) usare per la dispensazione micropipette dedicate e munite di puntali provvisti di barriera anti-aerosol.
****ATTENZIONE: IMPORTANTE: il kit contiene materiale sufficiente per l’esecuzione di un controllo positivo ed un controllo negativo per ogni
set di 10 campioni reali.
ESECUZIONE DELLA RETROTRASCRIZIONE:
Il campione da sottoporre a retrotrascrizione è costituito da RNA estratto.
1)
PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX:
Importante: tutte le operazioni di preparazione e distribuzione vanno eseguite in ghiaccio.
Dispensare i singoli componenti per campione rispettando i volumi e l’ordine indicati nella tabella:
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
H2O DEPC:
q.b a 12 µl finali
TAMPONE TRASCRIZIONE:
2 µl
AMPLI-POLYMER**
1 µl
R.I.
0.5 µl (20 U.I.)
PRIMER GDHCV-A
2 µl
dNTPs (10 mM/DEPC)*
2 µl
MgCl2 25 mM
4 µl
TRASCRITTASI INVERSA:
0.5 µl (5 U.I.)
VOLUME TOTALE
12 µl x (n. test)
*I dNTPs sono normalmente disponibili in soluzioni singole 100 mM (Pharmacia e Boeringher) o
nell' "DNA TAQ kit" GeneDia (GD213). Poichè il processo di scongelamento e ricongelamento può
provocare la defosforilazione, è opportuno preparare una mix 10 mM da conservare a -20°C in
aliquote da 25 µl e da utilizzare per ogni singolo set di campioni. Scongelare solo prima dell'uso ed
eliminare eventuali residui.
** Utilizzare l'Ampli-Polymer contenuto nel kit C-AmpliSet (GD202).
2) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI CONTROLLI:
• Distribuire 12 µl di Master Mix in ciascun tubo da riporre nel Termocilatore.
• Campioni: distribuire 8 µl di Campione in ciascun tubo.
• Controllo Positivo: aggiungere al tubo predisposto 8 µl di Controllo Positivo.
• Controllo Negativo: aggiungere al tubo predisposto 8 µl di Controllo Negativo.
• Incubare come da seguente protocollo:
1 ciclo
42° C
STORAGE 4°C
Istruzioni D’Uso:
RNA Spin Clean C Kit
Cod. GD 206
Retrotrascrizione di RNA
40 TESTS
SOLO PER USO RICERCA
Rev. 2 Mag 2001
60 min.
Dopo l'incubazione i campioni trascritti in cDNA saranno pronti per essere sottoposti a
reazione di Amplificazione con il kit "AmpliSet C Kit" (GD202).
PRODOTTO E DISTRIBUITO DA:
G ENE D IA S. . .
R L
VIA LOMBARDA 169 LAMMARI LU
TEL/FAX 0583962672
EMAIL [email protected]
REFERENZE:
- PNAS 1992;89:187-191
- Journal of Virological Methods 1994;47:95-102