plasmide chimera

Tecniche per il sequenziamento
degli acidi nucleici
Nel 1965 viene determinata la prima sequenza completa
di un Acido Nucleico: il tRNA dell’alanina di lievito (78
nucleotidi)
1971: prima mappa di restrizione (individuazione della
disposizione dei geni sul genoma mediante enzimi di
restrizione) del DNA circolare di SV40
(11 frammenti di restrizione).
Nel 1975 viene sequenziato il primo genoma completo:
l’RNA del fago MS2 (3568 nucleotidi).
3 geni separati da pochi nucleotidi
Alle estremità 2 lunghe (129 e 174 basi) regioni non tradotte
Il Progetto Genoma (inizio 1990 - fine 2003)
“Department of Energy and the National Institutes of Health”
Scopi del Progetto

determinare

identificare
le sequenze delle circa 3x109 coppie di
basi di cui é costituito il DNA umano
tutti i circa ~105 geni geni del DNA umano

registrare
tutta l’informazione in Banche Dati

sviluppare
strumenti per l'analisi dei dati raccolti

trasferire
le tecnologie sviluppate ai settori privati

indirizzare
le questioni etiche, sociali e legali che
originino dallo svolgimento del progetto
Operazioni preliminari al sequenziamento
• Molecola troppo grande
taglio in punti definiti
 DNasi  completamente aspecifiche
 impossibile tagliare in punti specifici
 RNasi  specificità strutturale
 Enzimi di restrizione
La scoperta degli enzimi di restrizione
DNA E.coli di ceppo B in E.coli di ceppo C  digestione
1966: si osserva la “sopravvivenza” di un DNA virale in E.coli
enzima di modificazione  basi metilate
enzima di restrizione
sono stati identificati più di 150 siti di restrizione specifici
sequenze specifiche di 4-8 basi
casuale  1/256 – 1/65536
5’ GTPy PuAC 3’
3’ CAPu PyTG 5’
I frammenti di DNA tagliati dagli REs (restriction enzymes)
possono essere separati, in base alle loro dimensioni relative,
utilizzando l’lettroforesi su gel di agaroso
taglio al centro del sito di riconoscimento  frammenti ad estremità piatte
taglio sfalsato  frammenti ad estremità coesive
CCGC
GG
GG
CGCC
CCGC
CGCC
DNA ricombinante
moltiplicazione genica
clonaggio molecolare
DNA ricombinante
utilizzando plasmidi e fagi come vettori
Molti batteri contengono uno o piú plasmidi
v Molecole di DNA circolare a doppia-elica
v # coppie di basi (bp): da 3000 a 100000
v unitá autonoma di replicazione
v opzionale per la cellula ospite (resistenza agli antibiotici)
Plasmidi come vettori di clonaggio
un frammento di DNA, proveniente da altra sorgente, é integrato
nel plasmide (plasmide chimera)
plasmide modificato é inserito in una cellula di E.coli
le cellule con il plasmide chimera sono individuate dalla loro
resistenza ad un farmaco
l’insieme dei discendenti di queste cellule é un clone
I plasmidi sono utilizzati come vettori d’espressione
esprimendo il gene inserito si può produrre una proteina
di interesse medico (es: insulina)
Vedi cap.8 the cell
I plasmidi sono utilizzati come vettori di clonaggio
un frammento di DNA, proveniente da altra
sorgente, é integrato nel plasmide (plasmide chimera)
+
DNA estraneo
Plasmide vettore
Plasmide chimera
 Il plasmide chimera viene introdotto, mediante
trasformazione o per infezione virale, nell’ospite che
deve duplicarlo
 Il plasmide conferisce all’ospite resistenza a qualche
antibiotico  selezione e clonazione degli individui
contenenti il plasmide
Fotografie al microscopio elettronico
Il plasmide pSC101: il primo usato per clonare DNA
Il fago filamentoso M13
Fago lambda come vettore di clonaggio
Nota bene: Amplificazione di DNA mediante PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Si può amplificare una sequenza di DNA di qualsiasi
origine (virus, batteri, organismi superiori) centinaia
di milioni di volte in un’ora (con la tecnica del DNA
ricombinante ci sarebbero voluti molti giorni).
Polymerase Chain Reaction, PCR
K.Mullis 1985
1º Ciclo
2º Ciclo
3º Ciclo
A partire dal 3º ciclo, ad
ogni ciclo il numero di
molecole di DNA a doppia
elica
raddoppia.
All’nesimo ciclo ci saranno
quindi N=2n-2 molecole di
DNA a doppia elica
Metodo di Maxam e Gilbert (o metodo del taglio chimico)
• marcatura del DNA ad una estremità con 32P
• taglio a livello di uno dei 4 nucleotidi
• elettroforesi
• autoradiografia
polinucleotide chinasi  inserisce 32P al terminale 5’
Esempio
Sequenza marcata  5’-32P- GCTACGTA-3’
Frammenti radioattivi
Taglio a livello di A:
32P- GCT
32P- GCTACGT
Taglio a livello di G: 32P- GCTAC
Taglio a livello di C: 32P- G
32P- GCTA
Taglio a livello di T: 32P- GC
32P- GCTACG
Diagramma schematico di un’autoradiografia su gel
dei frammenti radioattivi prodotti dai tagli specifici
A
7
6
5
4
3
2
1
G
C
T
Autoradiografia di gel che mostra frammenti
marcati prodotti dal taglio chimico
Metodo di Sanger (o dell’interruzione controllata)
• copiatura della sequenza a singolo filamento
• blocco della crescita ad opera di una miscela di incubazione contenente
•i 4 nucleosidi 3P marcati
P-P-POCH2
• un analogo 2’,3’-dideossi di uno di essi
H
• elettroforesi
DNA polimerasi I e primer
• autoradiografia
O
H
2’
H
base
H
H
3’
H
Variante del metodo di Sanger
• marcatura dei primer di ciascuna delle 4 miscele con sonde
fluorescenti a l diversi
•spettri di fluorescenza
• elettroforesi
blu
verde
giallo
viola
Batteri: ospiti ideali per l’amplificazione di molecole di DNA
 produzione di numerose proteine procariotiche ed eucariotiche
Molti geni eucariotici sono espressi correttamente solo
in cellule eucariotiche
L’introduzione del DNA ricombinante in cellule eucariotiche
permette di studiare, per esempio, in che modo i geni vengono
attivati e disattivati durante lo sviluppo dell’embrione
(differenziazione)