gen 02 met-genet - Sezione di Microbiologia
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Metabolismo Batterico Trasformazioni chimiche e chimico-fisiche il cui scopo finale è la creazione di una nuova cellula Per tutte le funzioni 1. energia ATP 2. precursori delle macromolecole (zuccheri, aa, acidi grassi) Funzioni genetiche replicazione trascrizione DNA traduzione RNA Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia riproduzione proteine http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Metabolismo Batterico Per produrre energia i batteri sfruttano : 1 Energia solare → batteri fotosintetici 2 Energia da sostanze chimiche → batteri chemiosintetici Processi di fosforilazione: ADP → ATP 1 fotosintesi 2 -fermentazione (ossidazione parziale del substrato), - -respirazione aerobia (accettore finale O2) ed anaerobia (accettore finale nitrati, solfati, CO2) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Classificazione Fotoautotrofi (fotosintesi) C da anidride carbonica Fotoeterotrofi (energia da luce) C da composti organici Chemoautotrofi (energia da ox-red) C da anidride carbonica Chemeoeterotrofi (energia da ox-red) C da composti organici Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO Peptidoglicano Punto di crescita della parete cellulare Membrana citoplasmatica Esterno Interno Pentapeptide Bactoprenolo Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO Transpeptidazione D-Ala D-Ala Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Protoplasti e sferoplasti La sintesi di parete può essere inibita (es. lisozima o antibiotici) Protoplasti assente Sferoplasti assente parete parete Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia totalmente parzialmente http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Le sintesi macromolecolari la replicazione del DNA Le due catene parentali non si separano completamente La polimerizzazione dei nucleosidi trifosfati avviene per opera della polimerasi Nei batteri: polimerasi I, II e III. Polimerasi III più importante La separazione delle due eliche è catalizzata da topoisomerasi I e girasi La duplicazione comincia dal sito oriC (V=40µm/min) ed è semiconservativa Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Cellula 1-1,5 µm; DNA lunghezza 1mm; Cellula 1mm, DNA 1m Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Le sintesi macromolecolari la sintesi proteica Codon di inizio m-RNA- 30S + t-RNA - f-Met + 50S Codon terminatore Sintesi di proteine costitutiva o inducibile. Regolazione della sintesi proteica Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Limiti dell’esistenza batterica pH 5-9: maggioranza batteri Thiobacillus thiooxidans pH 0.5 ox H2S → acido solforico E.faecalis, Bacillus circulans pH 10-11 Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE DI NaCl SULLA CRESCITA Alotollerante Velocità di crescita Alofilo estremo Alofilo Esempio: Esempio: Staphylococcus Vibrio fischeri Esempio: Halobacterium salinarum aureus Non alofilo Esempio: Escherichia coli 0.9% 7% Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 15% 30% http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONDIZIONI DI CRESCITA Ossigeno Anaerobiosi Co2 Ioni inorganici Temperatura pH NaCl Esoenzimi Terreni liquidi/solidi Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Limiti dell’esistenza batterica Umidità: è condizione favorente liofilizzazione Temperatura: 20-45°C mesofili 45-75°C termofili facoltativi 50-75°C termofili obbligati inibiti a 30°C psicrofili NO meccanismi di termoregolazione Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Limiti dell’esistenza batterica Pressione atmosferica: batteri barofili? adattati a crescere a pressioni elevate (fondali oceanici) Concentrazione sali: NaCl 0.85% fisiologica 7-8% Stafilococchi 15-25% alofili Pressione osmotica: pochissimi batteri osmofili crescono in presenza di pressione osmotica elevata Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Terreni di coltura solidi Agar:polisaccaride estratto da alcune alghe 1-2% gelificazione > 80°C → liquido < 45°C → solido Terreni sintetici Terreni di base addizionati con sostanze naturali Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Le colture isolanti Per disseminazione sul terreno Per diluizione nel terreno (agar-batteri) Mezzi selettivi di isolamento Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche isolamento Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Condizioni di incubazione Temperatura ottimale CO2, aerobiosi o anaerobiosi Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Terreni di coltura liquidi Stessa composizione dei terreni solidi (non contiene agar) Intorbidamento del terreno Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CURVA DI CRESCITA DI UNA POPOLAZIONE BATTERICA Fasi della crescita Latenza Esponenziale Stazionaria Morte Conta vitale Torbidità Densità ottica Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Rappresentazione schematica della divisione di cellule bastoncellari o coccoidi I batteri si dividono per scissione binaria Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre 20 generazioni (circa 500 anni per un uomo) M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche In un sistema chiuso, la crescita esponenziale non può continuare per un tempo indefinito. Una singola cellula batterica con un tempo di generazione di 20 minuti produrrebbe, se continuasse a crescere in modo esponenziale per 48 ore, una popolazione il cui peso sarebbe circa 4000 volte il peso della terra, dato particolarmente impressionante se si considera che il peso di una singola cellula batterica è circa 10-12 g. Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche RIPRODUZIONE PER SCISSIONE SEMPLICE DNA Replicazione del DNA Allungamento della cellula Formazione del setto Generazione cellulare Completamento del setto con formazione di pareti distinte Separazione della cellula Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche LE BASI FISICHE DELL’EREDITARIETA’ Eredità: stabilità e la variabilità nel vasto assortimento di funzioni fisiologiche che formano le proprietà dei microorganismi. Gene: sequenza di DNA che codifica per un prodotto funzionale o controlla le proprietà di un microorganismo (caratteristiche biochimiche, di patogenicità, di resistenza agli antibiotici, ecc.,). I geni sono localizzati sul cromosoma. Il cromosoma è duplicato prima della divisione cellulare così le cellule figlie ricevono un corredo identico di geni. I geni nel loro insieme costituiscono il genoma e formano il cosiddetto genotipo. Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche LE BASI FISICHE DELL’EREDITARIETA’ La replicazione del cromosoma è un processo preciso, molto raramente si hanno errori durante la sintesi, (mutazioni, cioè variazioni permanenti della sequenza originale del gene). Nell’Escherichia coli è oltre 3 miliardi di Daltons (>4000 Kbp). E’ una doppia elica fatta da due sequenze complementari di basi puriniche e pirimidiniche tenute insieme da legami idrogeno (GC) (T-A). Struttura circolare (lunghezza ~ 1mm) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Mutazioni Mutazione: modifica permanente della sequenza nucleotidica di un gene. Gli alleli sono diverse forme di un gene mutato. Mutageni Agenti chimici e fisici che aumentano la frequenza di mutazione. Fisici: radiazioni, UV, calore Chimici: diretta reazione col DNA, composti nitrosi, agenti alchilanti, analoghi delle basi e composti che richiedono l’attivazione di enzimi cellulari. Mutazioni indotte: molti agenti chimici causano mutazione perché aumentano gli errori di appaiamento tra le due catene di DNA. Altri composti si intercalano tra le eliche (acridine), creano distacchi e complementazioni intracatenarie. Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Mutazioni • Riparazione dei danni: sistema senza errori (error-free) e sistema con errori (error-prone). Una lesione sul DNA scatena nella cellula la produzione di enzimi deputati alla riparazione (sistema SOS). Gli errori sono rimossi da nucleasi e la catena è riformata sulla base di quella complementare ancora intatta (template). Se anche l’altra catena è danneggiata allora il sistema ripara ma causa errori. • Sequenze non senso (UAG, UAA e UGA) sono il segnale di fine traduzione del mRNA, quando per mutazione si crea un non senso la traduzione si interrompe in quel punto. Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche RICOMBINAZIONE DEL DNA Due tipi di ricombinazione • Generalizzata (mediata dal gene recA) • Specializzata (recA-indipendente) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASFERIMENTO DI MATERIALE GENETICO NEI BATTERI • CONIUGAZIONE • mediata da F o altri plasmidi coniugativi sexduzione • TRASDUZIONE • generalizzata o specializzata • TRASFORMAZIONE Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONIUGAZIONE Scambio di materiale genetico mediante contatto tra due cellule DONATORE > RICEVENTE Plasmide F (o altro coniugativo, produce un pilo tipico) Apparato coniugativo per trasferire se stesso – spesso ad alta frequenza Il plasmide F può integrarsi sul cromosoma >> Hfr* *High frequency of recombination Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONIUGAZIONE F (o simile) codifica per un pilo sessuale che identifica un recettore (ompA) sulla superficie esterna del ricevente molti plasmidi codificano per un repressore che blocca la formazione del pilo (espresso temporaneamente) dopo contatto con il ricevente il pilo si ritrae e le due cellule sono in comunicazione per via di un ponte citoplasmatico Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASFERIMENTO DI DNA PLASMIDICO PER CONIUGAZIONE Cromosoma plasmide batterico F Pilo Cellula F+ Cellula F- Nella cellula ricevente comincia la sintesi dell’elica complementare Il Pilo si ritrae Coppia di cellule stabilizzata Il plasmide F è tagliato su un’elica Compimento del trasferimentodel DNA e sintesi le cellule si separano Trasferimento di un’elica di DNA di F F+ da una cellula F+ a una F-. Il plasmide F si replica simultaneamente nelle cellule F+ Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Cellula F+ http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONIUGAZIONE • I geni sono trasferiti in ordine fisso • Esiste un gradiente di trasmissione • Hfr diversi hanno origine diversa • Attraverso le frequenze di ricombinazione circolarità del cromosoma • Distanze dei geni sul cromosoma (tempo) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONIUGAZIONE F’ Originano da F che nel distacco dal cromosoma catturano segmenti di DNA può replicarsi autonomamente può ricombinarsi nel ricevente può integrarsi sul cromosoma Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche CONIUGAZIONE Gram-positivi il donatore forma una proteina sulla superficie della cellula (adesina) che media l’aggregazione con le cellule riceventi le riceventi liberano nell’ambiente dei peptidi (PM 1000) che stimolano la produzione di adesina fusione di protoplasti naturale o mediante glicole etilenico Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Trasduzione E' un meccanismo di scambio di materiale genetico mediato da batteriofagi I virus batterici o batteriofagi sono classificati in tre grossi gruppi: Virulenti autonomi: infettano le cellule batteriche e si sviluppano senza richiedere alcuna funzione cellulare (vi sono fagi che al semplice assorbimento con la cellula la uccidono). Virulenti dipendenti: per il loro sviluppo necessitano di funzioni cellulari e quindi la cellula non muore sino a che il virus non giunge a maturazione Temperati: sono virus che solo occasionalmente uccidono la cellula spesso entrano in simbiosi con essa come fanno alcuni plasmidi duplicandosi insieme alla cellula. Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche The T4 infectious cycle Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Lysogeny Temperate phages can convert host to lysogen Establishment likely with high level of infection of bacterial culture, starvation Stable association of phage DNA with bacterial cell (prophage) Normal growth and division of lysogen Environmental cues may induce lytic cycle Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASDUZIONE generalizzata Cellula batterica Ciclo litico Fago Cellula trasdotta Fago Particella trasducente Particella trasducente (DNA dell’ospite dentro l’involucro virale) Cellula batterica Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Trasduzione Ricombinazione genetica con il DNA dell’ospite http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASDUZIONE specializzata gal gal Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia bio bio http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASFORMAZIONE • • • • • Tre meccanismi distinti Pneumococchi legano DNA doppia elica non specifico entra un solo filamento • Haemophilus • DNA doppia elica specifico • artificiale • sferoplasti • elettroporazione Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRASFORMAZIONE Cromosoma batterico DNA trasformante Proteina di legame al DNA Proteina specifica della competenza che lega il DNA a singola elica Nucleasi Nucleotidi liberi Proteina RecA Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche TRANSPOSIZIONE Sequenza bersaglio Elemento Transponibile inserito Sequenza bersaglio duplicata Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Elemento transponibile http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Specificità d’ospite del DNA (Enzimi di restrizione modificazione del DNA) Il materiale genetico (DNA) sintetizzato dai batteri subisce un processo di metilazione che è specifico di ogni specie batterica La modificazione del DNA è come un’ identità del materiale genetico che è riconosciuto da enzimi (nucleasi) detti di restrizione, in quanto degradano ogni DNA che è stato prodotto in altre specie batteriche (estraneo) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche Specificità d’ospite del DNA (Enzimi di restrizione e modificazione del DNA) Ogni volta che una cellula batterica riceve DNA da altre specie questo è riconosciuto come estraneo e quindi degradato L’efficienza di questo meccanismo varia da specie a specie (0- 1x10-4) Gli enzimi di restrizioni sono utilizzati in Biologia Molecolare (ingegneria genetica, mappe di restrizione ecc) Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm Dinamica delle Popolazioni Batteriche
