Il Genoma mitocondriale (mtDNA) umano
Il genoma umano
23 coppie di cromosomi + mtDNA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guid
e/
Nucleo della cellula
1
Autosomi
Localizzato nei
mitocondri
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
DNA
mitocondriale
mtDNA
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
DNA nucleare
3,2 x 109 bp
Y
16569 bp
Cromosomi
sessuali
(sequenziato “completamente” nel 2001)
(sequenziato completamente nel 1981)
• Genoma circolare extra-nucleare di 16569 coppie di basi (bp)
DNA mitocondriale umano (mtDNA)
DNA mitocondriale umano (mtDNA)
di controllo
1 Regione
(16024-00576)
• Filamento leggero-L
– ricco in citosine
• Filamento pesante-H
– ricco in guanine
• Regione codificante (37 geni)
– 2 rRNA (12S e 16S)
– 22 tRNA
– 13 proteine (OXPHOS)
•
•
•
•
ND1-ND6 e ND4L (complesso I: NADH-Ubichinone ossidoreduttasi)
Cyt b (complesso III: ubichinolo-citocromo b ossidoreduttasi)
COI-COIII (complesso IV: citocromo c ossidasi)
ATP 6, ATP 8 (complesso V: ATP sintetasi)
I complessi della catena respiratoria nel mitocondrio
Regione di controllo (16024-00576)
ITH1
tRNA Phe
ITL
HSP1
LSP
nt 500
–
–
–
–
TFAM
TFAM TFAM
nt 400
CSB 3 CSB 2
CSB 1
TFAM
nt 300
TFAM
OH
OH
nt 200
tRNA Pro
nt 100
nt 16000
HVS-III
HVS-II
HVS-I
(438–576)
(44–340)
(16024–16400)
HVS-I (16024 - 16400)
HVS-II (00044 - 00340)
HVS-III (00438 – 00576)
CSB1, CSB2, CSB3
• sequenze conservate
– Origine di replicazione filamento H
Replicazione dell’mtDNA
•
La replicazione è semi-conservativa ed indipendente dalla
fase del ciclo cellulare
– il turn-over dei mitocondri richiede sintesi del DNA anche in
cellule in G0 mentre l’nDNA si replica solo in fase S
•
Coinvolte:
– DNA polimerasi g, Fattori TF, RNA primers
– no proofreading
•
•
Il modello classico della replicazione del DNA mitocondriale
(Clayton) descritta nell’Uomo (valido per tutti i Vertebrati)
La modalità di replicazione secondo il modello è asincrona
– entrambi i filamenti si replicano come leading strand, ma in
tempi diversi, formando una struttura detta D-loop (ansa)
– dapprima inizia a replicarsi il filamento pesante (da OH)
– l’origine del filamento leggero entra in funzione quando la
replicazione del filamento H giunge a tre quarti, dove incontra
una struttura a forcina che viene riconosciuta dalla DNA
polimerasi, attivando una particolare primasi ->inizio replicaz.
•
Modello alternativo: nei mammiferi è stata proposta una
modalità bidirezionale sincrona di replicazione, che parta
contemporaneamente dalla regione OriH, oppure nelle
immediate vicinanze (Holt et al.2000; Bowmaker et al.2003).
Replicazione dell’mtDNA (basi molecolari)
• La replicazione di entrambe le eliche richiede la presenza di
RNA primer di innesco. A livello dell' OH i primer sono
prodotti dall'RNA polimerasi mitocondriale, mentre
a livello dell'OL sono prodotti da una RNA primasi specifica.
• L’RNA polimerasi ha bisogno di TFAM per aprire il DNA, e due fattori TFBM.
• Si può formare una struttura ibrida a tripla elica (R-loop), su cui agisce una
endoribonucleasi (Mitochondrial RNA-processing, MRP) che la processa a livello
delle CSB (conserved sequence blocks). La proteina MRP lascia un primer per la
DNA polimerasi γ (POLG)
– Questa è formata da due subunità, quella maggiore ha attività polimersica ed esonucleasica 3’5’, che
inizia la replicazione del filamento pesante. La subunità minore aumenta la processività
• Intervengono proteine accessorie, come un’importante DNA elicasi (TWINKLE) e
una Topoisomerasi che mantiene aperto il DNA – che deve rimanere svolto a lungo
dato il sistema di replicazione – chiamata mtSSB (single strand binding protein), che
presenta un’elevata similarità di sequenza con l’omologa in E. coli.
Replicazione dell’mtDNA (basi molecolari)
Regione di controllo (16024-00576)
ITH1
tRNA Phe
ITL
HSP1
LSP
nt 500
–
–
–
–
TFAM
TFAM TFAM
nt 400
CSB 3 CSB 2
CSB 1
TFAM
nt 300
TFAM
OH
OH
nt 200
nt 100
nt 16000
HVS-III
HVS-II
HVS-I
(438–576)
(44–340)
(16024–16400)
HVS-I (16024 - 16400)
HVS-II (00044 - 00340)
HVS-III (00438 – 00576)
CSB1, CSB2, CSB3
• sequenze conservate
–
–
–
–
–
tRNA Pro
LSP promotore filamento L
HSP1 primo promotore filamento H
ITL sito d’inizio della trascrizione per L
ITH1 sito maggiore d’inizio della trascrizione per H
TFAM siti di legame per fattore di trascrizione mitocondriale A
•
•
Si osservano deviazioni dal codice genetico universale in molti gruppi tassonomici. Il codice
genetico universale è mantenuto nei protisti (es. Reclinomonas americana) e nelle piante.
La deviazione più frequente si osserva per in codone UGA che invece di essere un codone
di stop codifica per il Triptofano.
Variazione nel codice genetico
barriera al trasferimento ulteriore di geni dal genoma mitocondriale a quello nucleare
Mutazione e Fissazione
• Gli “errori” nella trasmissione genetica
–
–
–
–
Mutazioni puntiformi
Inserzioni
Delezioni
Riarrangiamenti di vario tipo
sono alla base dei processi evolutivi che da una forma di vita
primitiva hanno prodotto la diversità delle forme di vita attuali
• La fissazione all’interno di una popolazione può risultare da:
– selezione naturale
• capacità differenziata di riproduzione di individui geneticamente distinti (o
genotipi) all’interno di una popolazione determinata dal proprio livello di
adattamento all’ambiente rispetto ad altri individui della stessa specie
• contrasta la fissazione di mutazioni svantaggiose; favorisce la fissazione di
mutazioni vantaggiose e non ha alcuna influenza sulle mutazioni neutrali
– deriva genica casuale (neutral genetic drift)
• può produrre la fissazione di mutazioni neutrali attraverso un processo
stocastico per cui la frequenza dell’allele mutato può aumentare nel tempo in
seguito ad un processo di tipo esclusivamente casuale
Mutazioni del DNA mitocondriale
Il DNA mitocondriale può andare incontro a mutazioni genetiche
di due categorie
riarrangiamenti strutturali o mutazioni puntiformi.
I riarrangiamenti strutturali osservati riguardano spesso delezioni
più raramente duplicazioni derivate da eventi di ricombinazione fra
molecole diverse
Per quanto riguarda le delezioni, il D-loop viene sempre
conservato, in quanto indispensabile per la replicazione.
Si possono avere mutazioni puntiformi, generalmente sostituzioni
o delezioni di singoli nucleotidi. Singole mutazioni possono
causare la perdita di funzionalità del tRNA.
Mutazioni del DNA mitocondriale
Somatiche
Numerose, non vengono trasmesse alla generazione successiva
Rilevanti per la salute solo quando si accumulano in grande
quantità
Aumentano con l’età
Sia mutazioni puntiformi che delezioni
Conseguenze differenti nei diversi tessuti (cervello, muscolo)
Germinali
Rare e vengono trasmesse alla generazione successiva
Polimorfismi o mutazioni patogene
Mutazioni della linea germinale
Mutazioni neutrali
Possono essere perse per deriva genetica
Possono fissarsi e raggiungere frequenze polimorfiche
• Secondo la definizione classica di polimorfismo l’allele più raro
dovrebbe avere una frequenza minima pari a 1%
Esistono da molto tempo
Omoplasmia
Mutazioni “lievi”
Non riducono significativamente la fitness dell’individuo
Possono fissarsi
Mutazioni lievi + Mutazioni somatiche Effetti clinici
Mutazioni “gravi”
Effetti clinici
Eliminate per selezione
Eteroplasmia Eventi recenti
PATOLOGIE ASSOCIATE ALL’mtDNA
1555A->G
DEAFNESS (aminoglycosides)
D-loop
T
F
D
cyt. b mutations
MYOGLOBINURIC
MYOPATHY
Cyt.b
L
12S
P
V
3243A->G
MELAS
CPEO
DDM
E
ND6
tRNA-Ile mutations
CARDIOPATHY
ND5
16S
3460G-A
11778G->A
14484T->C
LUUR
LCUN
SAGY
H
LHON
ND1
Q
I
M
ND4
A
N
ND4L
R
ND3
G
C
ND2
Y
SUCN
W
COIII
COI
tRNA-Ser mutations
DEAFNESS
D COII K
E
PEO, KSS, Pearson
E
T
I
O
N
ATPase6/8
8344A->G
MERRF
8993T->G
NARP/MILS
I meccanismi associati sono tuttora spesso sconosciuti
Mutazioni nei geni coinvolti nella sintesi proteica
A1555G nel gene per l’rRNA 12S
Sordità neurosensoriale non sindromica di tipo familiare
A3243G nel gene per il tRNALeu(UUR)
MELAS - Encefalomiopatia mitocondriale con acidosi lattica ed
episodi di ictus
CPEO - Sindrome esterna progressiva cronica di oftalmoplegia
(paralisi dei muscoli oculari)
Cardiomiopatia (elevata % mutante)
Diabete senile e sordità (bassa % mutante)
A8344G nel gene del tRNALys
MERRF - epilessia mioclonica con le fibre rosse “stracciate” e
progressivo indebolimento muscolare
T4291C nel gene tRNAIle
Vasta gamma di disordini metabolici quali epilessia,
ipercolesterolemia e ipomagnesemia (Wilson et al. 2004)
Mutazioni missenso
ND1-G3460G; ND4-G11778A e ND6-T14484C
LHON - neuropatia ottica di Leber
ND6-G14459A:
Distimia (nevrosi depressiva) in associazione con la LHON
ATP6-A8993G in funzione del livello di eteroplasmia:
NARP – sindrome con neuropatia, atassia e retinite pigmentosa
Degenerazione maculare, ritardo mentale etc.
MILS - sindrome di Leigh ad eredità materna (grave forma di NARP)
DELEZIONI
CPEO - oftalmoplegia (paralisi dei muscoli oculari) esterna cronica
progressiva
KSS - sindrome di Kearn-Sayre (oftalmoplegia, retinite pigmentosa e
miopatia cardiaca)
Sindrome di Pearson (anemia sideroblastica, pancitopenia ed insufficienza
del pancreas esocrino con malassorbimento intestinale)
Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON)
colpisce generalmente uomini tra i venti e i trent’anni
fu descritta nel 1871 da Theodore Leber (oculista tedesco)
colpisce prima un occhio con comparsa di uno scotoma
centrale in poche settimane, poi l’altro, dopo 1-2 mesi
dopo alcune settimane di peggioramento nella fase acuta, la
funzione visiva si stabilizza e soltanto in rari casi la vista
può migliorare o riprendersi in buona parte
in alcuni casi si ha un esordio più fulmineo
descritte mutazioni mitocondriali associate alla LHON
solo tre sono comuni: la G3460A-ND1, la T14484C-ND6 e
la G11778A-ND4 del complesso I
altre mutazioni, inizialmente associate alla patologia, sono in
realtà dei polimorfismi popolazionistici
tra i fattori ambientali predisponenti la malattia, o che
possono determinare una certa variabilità clinica:
• forte consumo di tabacco e di alcolici
Trasmissione materna
Modelli di studio della genetica mitocondriale
“CIBRIDI” di cellule di mammifero in coltura
• È interessante studiare le interazioni tra genoma mitocondriale e nucleare
• A questo scopo vengono prodotte e analizzate linee transmitocondriali, in cui il
DNA mitocondriale proviene da un’altra linea cellulare
• Giuseppe Attardi ottenne linee ρ0, ovvero prive di mtDNA trattando
con etidio bromuro (concentrazione nanomolare) cellule in coltura.
– Questo è un forte inibitore della DNA polimerasi mitocondriale (γ), e porta
pertanto nel tempo a completa deplezione di mtDNA
• Non tutti i tipi cellulari rispondono allo stesso modo con trattamento con etidio
bromuro, alcune DNA polimerasi γ sono meno sensibili a questo inibitore
– cellule ρ0 hanno nuove esigenze nutrizionali
• richiedono un maggiore apporto di glucosio, di piruvato per riossidare il NADH
ridotto durante la glicolisi, e pirimidine – specialmente Uracile (nucleotide Uridina
monofosfato UMP)– neosintetizzate nel mitocondrio.
Citoplasto
• Piastrine
• Sinaptosomi (terminali presinaptici isolati da tessuto omogeneizzato)
• Enucleazione fisica o chimica (es. actinomicina D, un antibiotico prodotto
dallo Streptomyces, si lega alla doppia elica del DNA)
