02-Elettroforesi

TECNICHE ELETTROFORETICHE
Aree di applicazione:
- Purificazione di molecole: elettroforesi preparativa
- Controllo della purezza di una molecola in un campione
- Determinazione quantitativa di una molecola
- Determinazione del P.M. di una molecola
- PROTEOMICA
Le tecniche elettroforetiche sono applicabili ad un’ampia serie di
sostanze:
- Proteine
- Acidi nucleici
- Peptidi
- Amminoacidi
- Acidi e basi organiche
- Farmaci
- Pesticidi
- Anioni e cationi inorganici
N.B.: Nei campioni da sottoporre a elettroforesi non devono
essere presenti sostanze insolubili o grassi in sospensione
Le tecniche elettroforetiche sono influenzate da una serie di
fattori legati alla natura del campione e non:
- carica del campione
- forma del campione
- dimensioni del campione
- pH del “mezzo” (tampone)
- forza ionica del “mezzo”
- concentrazione del “mezzo”
- tipo di supporto
- elettroendosmosi
MOBILITA’
ELETTROFORETICA
Principali gruppi chimici coinvolti nel fenomeno
dell’elettroendoosmosi:
- gruppi carbossilici
(carta,……..)
- gruppi solfato
(agarosio,…)
- gruppi silanolici
(vetro,….….)
parete del capillare
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
parete del capillare
+
+
+
I gruppi silanolici del vetro possono assumere carica
negativa attraendo così i cationi dell’elettrolita. Si
forma una sorta di doppio strato di cariche elettriche
(regione di separazione di carica). Al momento in cui
viene applicato un campo elettrico, i cationi
dell’elettrolita, presenti nella regione di separazione
di carica, migrano verso il catodo trascinando con sé
la soluzione elettrolita (flusso elettroendoosmotico).
LEGGE DI OHM
V = I x R
La resistenza R dipende da:
- supporto
- tampone
- temperatura
V = voltaggio (V, Volts)
I = intensità (A, Ampere)
R = resistenza (Ω, Ohms)
Durante una corsa elettroforetica, il passaggio di corrente porta ad un
aumento della temperatura
W è la potenza generata nel mezzo di resistenza R dal passaggio della
corrente I
W = I2 x R
La maggior parte di questa potenza viene dissipata sotto
forma di calore
EFFETTI DEL CALORE
- Il calore aumenta la velocità di diffusione
dei campioni e degli ioni del tampone
- Il calore determina comparsa di correnti convettive
che portano al mescolamento dei campioni
- Il calore può danneggiare i campioni (denaturazione
di proteine, perdita di attività di enzimi)
- Il calore può far diminuire la viscosità del tampone
con riduzione della resistenza
Sono necessari alimentatori stabilizzati e sistemi di refrigerazione
del gel durante la corsa
ELETTROFORESI
E’ un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di
migrazione di molecole cariche sottoposte ad un campo
elettrico.
Il gradiente di potenziale (E) generato da una differenza di
potenziale (V) applicata tra due elettrodi, posti ad una distanza d
l’uno dall’altro, è espresso dalla relazione:
E =
V
d
La forza F applicata su una molecola con carica q in risposta al
potenziale applicato risulta essere:
F = E x q
La velocità v con cui la molecola si muove sarà data da:
v =
E x q
f
con f, coefficiente frizionale, che dipende da:
-
dimensioni della molecola
forma della molecola
viscosità del mezzo (tampone) usato
dimensione dei pori del “supporto” in cui migra la molecola
Solitamente si preferisce parlare di mobilità elettroforetica (µ):
q
µ =
f
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE
(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis)
Per l’analisi di proteine si usano di solito concentrazioni che vanno dal:
8% per grosse proteine o anche frammenti cellulari
(es. agglomerati di proteine di membrana)
20% per proteine più piccole (fino a 1600 Da)
Spesso vengono utilizzati gel preparati con un gradiente di concentrazione di
poliacrilammide (es. 9 - 16%).
La reazione di polimerizzazione avviene secondo un meccanismo
radicalico che richiede uno starter ed un catalizzatore.
TEMED
(tetrametilendiammina)
S2 O82- + eSO4 2- + SO42-
.
radicale con un e- spaiato
R° + M
RM°
+
M
(R°)
RMM° + M
RMMM°............
CH2
CH2 CH
CH
C
O
C
+
CH2 CH
O
C
TEMED
NH
NH2
CH2 CH
O
NH2
C
CH2
O
NH2
CH CH2
CH
C
C
C
O
NH
CH2
O
NH2
NH2
CH CH2
CH
C
C
O
CH2
S2O82-
NH
C
CH CH2
NH
O
C
CH2 CH
CH CH2 CH
CH2
C
O
NH
CH2
NH2
O
NH2
O
NH2
NH
C
O
CH2
CH
CH2
O
NH2
CH2 CH
CH
C
O
NH2
C
NH2
CH2
O
CH
C
O
NH
NH
C
O
C
CH2
CH
CH
C
O
CH CH2
CH2
C
CH2
C
CH2
CH2 CH
O
CH2
O
CH
O
NH2
NH2
La dimensione dei pori dipende da due parametri:
T= concentrazione totale in %
T=
(a + b) × 100
%
V
C=
b × 100
%
a+b
a: massa in grammi di acrilammide
b: massa in grammi di metilenebisacrilamide
V: il volume in ml
C= reticolazione %
- valutazione della purezza di un campione
- determinazione della massa molecolare
- seconda dimensione in 2-DE
Detergente Anionico
PROCEDURA GENERALE
Il campione viene solubilizzato in tampone contenente SDS e mercaptoetanolo
100°C per 5 min
La proteina è così denaturata e presenta carica negativa proporzionale alla sua massa
(~ 1 SDS ogni 2 aa)
Il campione viene applicato al gel
Applicazione campo elettrico
(Il campione migra nello stacking gel)
Il campione migra nel separating gel, separandosi nelle sue componenti
I campioni sono sciolti in una soluzione
contenente:
¾Tampone Tris pH 6.8
¾SDS
¾ Glicerolo (per aumentare la densità)
¾ 2-mercaptoetanolo o DTT (per ridurre
eventuali ponti disolfuro)
¾ Blu di bromofenolo (indicatore della
corsa)
¾Eventuali detergenti
Miscela
standard
di proteine con
peso
molecolare
noto
stacking gel
separating gel
• Stacking gel
tampone
tris-glicina pH 6.8 : Gly
bassa mobilità (PI 6.1)
• Separating gel
tampone tris-glicina pH 8.8 :
Gly alta mobilità
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2-DE)
PRIMA DIMENSIONE (IEF)
Le proteine si separano in funzione
del loro punto isoelettrico
SECONDA DIMENSIONE
(SDS-PAGE)
La
seconda
corsa
elettroforetica separa
le
proteine
(già
separate e distribuite
sulla strip in base al
proprio PI) in funzione
del
loro
PESO
MOLECOLARE.
3
pI
10
kDa
- 500
- 200
- 50
- 10
Isoelettrofocalizzazione
(IEF)
Sfrutta come parametro di separazione il diverso punto
isoelettrico (pI) delle proteine
La carica netta di una
proteina
dipende
dal
valore di pH del mezzo.
Richiede l’uso di gradienti di pH:
- anfoline
- immobiline
CH2
N
(CH2)n
(CH2)n
NR2
Dove R = H o
N
CH2
(CH2)n
COOH
(CH2)n
COOH
n=2 o 3
Diagramma della formazione di un gradiente di pH
mediante anfoline in un campo elettrico.
Gel di poliacrilammide da copolimerizzazione di:
- acrilammide derivatizzata con gruppi tamponanti
acidi deboli in genere con due gruppi carbossilici (pK1 e pK2)
basi deboli in genere ammino gruppi terziari (pK1, pK2, pK3 e
pK4)
- monomeri di acrilammide
Poliacrilammide copolimerizzata con
immobiline
PROBLEMI :
9 Presenza di componenti insolubuli
9 Proteine di membrana
9 Proteine nucleari
9 Proteine poco abbondanti
9 Proteine basiche
9 Necessità di applicare una quantità di campione “elevata”
9Quantificazione del campione
La preparazione del campione è il vero “passaggio critico” della 2-DE
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
E’ una fase fondamentale per la buona riuscita di un’ E-2D
PREVEDE DI:
- conoscere le caratteristiche del campione
- evitare degradazioni nel campione
- evitare precipitazioni nel campione
- evitare contaminazioni del campione
REGOLE GENERALI
- Usare soluzioni pure
- Usare inibitori di proteasi
- Usare nucleasi o ultracentrifugazione
- Eliminare componenti lipidiche
(es. precipitazione con TCA o acetone)
- Non superare livelli massimi di concentrazione proteica
TIPOLOGIA DEL CAMPIONE
TESSUTO
animale
vegetale
COLTURE CELLULARI
fase di lisi
animali
vegetali
lieviti
batteri
FLUIDI BIOLOGICI
ALTRO
fase di lisi
sangue
saliva
urina
ecc.
terreno
alimenti (farine, latte, ecc.)
ecc.
METODI DI LISI DEL CAMPIONE
FISICI
8 trattamento al calore
8 congelamento e scongelamento
8 lisi osmotica
CHIMICI
8 detergenti (anionici, cationici e neutri)
8 solventi organici
ENZIMATICI
MECCANICI
8 enzimi che rompono le pareti
di batteri, lieviti e cell. vegetali
8 ultrasuoni (sonicatori)
8 dispersori meccanici (ultraturrax, frullatori)
8 sferette di vetro (glass beads)
8 mortaio (sabbia di quarzo, abrasivi)
8 potter
8 celle a pressione (pressa francese)
CARATTERISTICHE DEL TAMPONE DI LISI PER
CAMPIONI DA SOTTOPORRE A 2D-E
NECESSITA’ DI: SOLUBILIZZARE, DENATURARE, RIDURRE E
RIMUOVERE LE COMPONENTI INSOLUBILI NON-PROTEICHE
SOLUZIONE STANDARD PER 2-DE
DENATURANTI: 8M Urea o 2M Thiourea & 7M Urea
DETERGENTI: 4% CHAPS o 2% CHAPS & 2% Sulfobetaine 3-10
AGENTI RIDUCENTI: 100mM DTT o 2mM TBP (Tributyl phosphine)
and/or 65mM DTT
ANFOLITI (range di pH variabile): 0.5 – 2 %
(TAMPONE (DEBOLE FORZA IONICA): Tris HCl 10 mM)
AGENTI DENATURANTI
(UREA E TIOUREA)
- rompono legami a idrogeno e interazioni idrofobiche
- non hanno effetto sulla carica intrinseca delle proteine
- possono formare cianati ⇒ carbamilazione dei gruppi amminici delle proteine
(la carica netta delle proteine cambia)
PRECAUZIONI
- Evitare il riscaldamento delle soluzioni
- Deionizzare le soluzioni
- Usare reattivi purificati
- Usare soluzioni “fresche” o conservate a -20°C
AGENTI RIDUCENTI
(DTT, DTE, MERCAPTOETANOLO, TRIBUTILFOSFINA)
- rompono i ponti disolfuro intra e intercatena
- completano il processo di denaturazione delle proteine
Il DTT è forse il più usato.
DIFETTO: migra verso l’anodo durante la IEF, lasciando “scoperta” la
zona basica del gel.
AGENTI DETERGENTI (NEUTRI)
(CHAPS, sulfobetaina, octilglucoside…..)
™ facilitano il processo di distruzione delle membrane
™ solubilizzano i lipidi e le sostanze poco solubili in mezzo acquoso
™ rompono le interazioni proteina / proteina
PRECAUZIONI:
Non superare concentrazioni limite:
4% CHAPS
2% sulfobetaina
60 mM octilglucoside
………
ANFOLITI
Miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici.
Esistono in vari intervalli di pH. La scelta dipende dal campione
che si vuole analizzare.
™ facilitano la solubilizzazione delle proteine
™ funzionano come scavanger per i cianati
™ facilitano la precipitazione degli acidi nucleici
™ inibiscono le interazioni fra proteine del campione e le
immobiline usate nel gel della prima dimensione
DOSAGGIO DELLE PROTEINE TOTALI DEL CAMPIONE
Fase fondamentale per:
™ buona riproducibilità
™ buona visualizzazione dei risultati
™ corretta analisi comparativa dei dati ottenuti da due esperimenti
N.B.
Le proteine dei campioni trattati per l’E-2D sono difficili da
quantificare a causa della presenza di discrete quantità di
riducenti, detergenti, anfoliti e tiourea
Metodi comunemente usati per il dosaggio delle proteine totali e
loro interferenze:
™ Bradford (Coomassie)
Æ detergenti, anfoliti
™ BCA (ac. Bicinconinico)
Æ riducenti, anfoliti, tiourea
™………………
Talvolta può essere necessario prevedere una precipitazione selettiva delle proteine!!