Vitrificazione - Technogenetics

Vantaggi dei kit per vitrificazione di Irvine Scientific
Un sistema di vitrificazione ottimizzato
I kit Vit di Irvine Scientific contengono una combinazione di due crioprotettivi permeanti (DMSO e EG) e saccarosio come
crioprotettivo non permeante. Queste soluzioni forniscono una concentrazione ottimale e un protocollo riconosciuto che
richiede un tempo di esposizione ridotto a temperature anch’esse ottimali. Di conseguenza permettono una rapida vitrificazione
se immerse in azoto liquido evitando la formazione di cristalli di ghiaccio e aumentando così la possibilità di
sopravvivenza degli ovociti e dunque di gravidanza rispetto al congelamento lento.
• Sistema di riconoscimento flaconi semplice e rapido.
• Soluzioni disponibili separatamente.
• Disponibili sia Cryotip® o HSV Straw Device.
• Data di scadenza più lunga rispetto ai concorrenti.
(Figura 2 – Confronto tra protocollo A
(con DMSO) e B (senza DMSO)
nel topo (Kartberg et al., 2008)
• MEDIA - marcato CE/approvato FDA.
• Cryodevices:
r Cryotip® - marcato CE/approvato FDA.
r
HSV Straws - marcato CE
Versatilità
Semplicità
• Metodica di facile utilizzo.
Supporto al cliente
• Staff a disposizione per risolvere i vostri problemi
• Assistenza per l’inoltro degli ordini
• Professionisti seri che si impegnano per costruire
relazioni commerciali consolidate
• Il kit può essere utilizzato per più pazienti
• Meno sprechi e più risparmio rispetto ai kit
che vengono utilizzati per un solo paziente
Figura 2. Confronto fra protocollo A (con DMSO)
e B (senza DMSO) nel topo (Kartberg et al., 2008)
% di sopravvivenza (raggiungimento dello stadio di blastocisti dopo 49 h)
La formazione di cristalli di ghiaccio associata al
congelamento lento può essere letale per gli ovociti e gli
embrioni. I crioprotettori, sia permeanti che non permeanti,
vengono utilizzati per ridurre la formazione di cristalli di
ghiaccio disidratando le cellule prima del processo di
vitrificazione. Tutti i crioprotettori sono potenzialmente
pericolosi. Il rischio associato ai crioprotettori può
essere ridotto al minimo usando una combinazione di
crioprotettori a concentrazioni ridotte, limitando il tempo di
esposizione ed utilizzando un metodo testato che permette
la vitrificazione rapida. Il dimetilsulfossido (DMSO) ed il
glicole etilenico (EG) sono i crioprotettori permeanti
maggiormente utilizzati per la vitrificazione di ovociti ed
embrioni umani mentre il saccarosio è il piu’ diffuso tra
i non permeanti. Uno studio sui danni chimici legati alla
vitrificazione ha evidenziato che le soluzioni per vitrificazione
contenenti DMSO riducono i rischi di danneggiamento dovuto
ad esposizione prolungata rispetto alle soluzioni che non lo
contengono. Ciò è probabilmente dovuto alla rapida capacità
di penetrazione del DMSO (5).
100
Bibiliografia:
Kit disponibili
1. Conaghan et al., (2010) - Human blastocyst vitrification
and warming: 3 years experience using the Cryotip.
Vit Kit® - Congelamento (per ovociti ed embrioni in tutte le fasi)
2. Tucker M., Liebermann J., (2007) - Vitrification in assisted
reproduction, United Kingdom, Informa Healthcare.
Protocollo A (con DMSO)
Protocollo B (senza DMSO)
90
80
3. Smith et al., (2010) - Prospective randomized comparison
of human oocytes cryopreservation with slow-rate freezing
or vitrification, Fertility and Sterility, Feb. 18, 2010.
70
60
50
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
Tempo di vitrificazione (minuti)
Codice: 90133 - Starter
Contenuto: ES 1x1 mL, VS 2x1 mL, 10 Cryotips
Codice: 90133 – HSV
Contenuto: ES 1x1 mL, VS 2x1 mL
Codice: 90133-SO
Contenuto: ES 1x1 mL, VS 2x1 mL
4. Cobo et al., (2008) - Effect of different
cryopreservation protocols on the metaphase
II spindle in human oocytes, Reproductive
Medicine Online, Volume 17, 16 July.
40
5. Kartenberg A-J. et al, (2008) - Vitrification with DMSO protects
embyo membrane integrity better than solution without DMSO,
reproductive BioMedicine Online, Volume 17, 3 September.
Vit Kit® –Scongelamento (per ovociti ed embrioni in tutte le fasi)
Codice: 90137 – SO
Contenuto: TS 4x1 mL, DS 1x1 mL, WS 1x2 mL
6. Dati su file
7. Dati su file
Terreni per vitrificazione
La composizione di queste soluzioni è stata
studiata sulla base di metodi pubblicati e
con il supporto del Dr. Masashige Kuwayama
utilizzando una combinazione di EG e DMSO
come crioprotettivi permeanti. Il medium basale
usato è l’M199 (che contiene 21 mM di HEPES in
soluzione tampone) supplementato con il 20%
di DSS (HSA e dextrano, contenente 10 mg/mL
di proteina) e 35 µg/mL di gentamicina come
antibiotico.
Data di scadenza (8 settimane)
Conformità
Selezionare i crioprotettori
Composizione della soluzione
Convenienza
Soluzione
DMSO (v/v) EG (v/v) Saccarosio
Soluzione di equilibrio (ES) 7.5%
7.5%
0
Soluzione per
vitrificazione (VS)
15%
15%
0.5M
Soluzione per
scongelamento (TS)
0%
0%
1.0M
Soluzione di
diluizione (DS)
0%
0%
0.5M
Soluzione di lavaggio (WS) 0%
0%
0
TECHNOGENETICS SRL
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Tel +39 02262891 Fax +39 0226221305
E-mail:[email protected] Web: www.technogenetics.it
Vitrificazione
Perchè la velocità conta
La vitrificazione è migliore del congelamento lento
Vantaggi
della vitrificazione
nei confronti del congelamento lento
Reasons
to Choose Vitrification
Numero di gravidanze significativamente più alto con la
vitrificazione degli ovociti.
Percentuali di sopravvivenza degli ovociti molto maggiori
con la vitrificazione
Migliori probabilità di gravidanza con un minor numero di
embrioni trasferiti
Uno studio pubblicato sulla rivista “Fertility and Sterility” ha messo a
confronto la crioconservazione degli embrioni umani maturi mediante
lento raffreddamento e vitrificazione (Vit kits di Irvine Scientific
e CryoTip®) per definire quale metodo potesse essere il migliore in
funzione del successo di una gravidanza (3).
Il risultato di uno studio sulla vitrificazione, condotto presso l’Unità
di Criobiologia dell’Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI) è stato
pubblicato su RBMonline per valutare l’efficacia di quattro diversi
protocolli per la crioconservazione utilizzando embrioni appena
prelevati (4).
Le gravidanze multiple sono la complicanza più significativa nei
trattamenti di IVF e per molte pazienti sarebbe consigliato l’impianto di
un solo embrione. La scelta di impiantare un solo embrione comporta il
rischio di una ridotta incidenza di gravidanza per ciclo in confronto alla
scelta di impiantare più embrioni. L’introduzione della vitrificazione nella
pratica clinica ha il vantaggio di un recupero molto efficace degli embrioni
crioconservati, offrendo a pazienti e medici una maggiore possibilità di
successo anche impiantando un minor numero di embrioni.
Sopravvivenza di ovociti e loro funzionalità dopo crioconservazione con
congelamento lento e scongelamento oppure vitrificazione e riscaldamento.
(Smithet Al., 2010)
100
Vitrificazione
Congelamento lento
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
# Cicli di congelamento
% sopravissuti
P < 0.001
% fecondati
P < 0.03
100
Vitrificazione
Congelamento lento
90
80
70
60
50
Protocollo di
Crioconservazione
30
20
Tasso di clivaggio
% gravidanze biochimiche/
cicli di scongelamento
o riscaldamento
P < 0.01
% gravidanze cliniche/
cicli di scongelamento
o riscaldamento
P < 0.02
La vitrificazione/riscaldamento è risultata molto migliore per quanto
riguarda la crioconservazione, la fecondazione, il clivaggio e lo sviluppo
degli embrioni e la percentuale totale di gravidanze.
N° di ovociti
sopravis. (%)
36
Congelamento lento +
0.3 mol/l saccarosio
34
25
(73.5)b
36
20
(74.1)
27
20
(86.9)a,b
Congelamento lento
+ aggiunta di colina
Vitrificazione
con metodo CryoTip®
Totale
10
N° di
ovociti
Congelamento lento +
0.2 mol/l saccarosio
Controllo (ovociti
freschi)
40
0
Tabella 1. Sopravvivenza degli ovociti dopo vitrificazione
(Cobo et al., 2008).
23
(63.8)a
34
In confronto con la tecnica del congelamento lento, il passaggio di
ovociti ed embrioni attraverso l’intervallo dove le temperature sono
critiche (da 15 a -5°C) è estremamente veloce, e l’esposizione ridotta a
temperature pericolose diminuisce radicalmente la possibilità di danno
alle strutture cellulari più sensibili (2).
Irvine Scientific offre due sistemi chiusi per vitrificazione: Cryotip® (6) e HSV Straw (7).
Cryotip®
Cryotip è una cannula per maneggiare gameti ed embrioni durante le
procedure di crioconservazione e congelamento a lungo termine. Questo
strumento è largamente utilizzato in tutto il mondo.
Figura 3. Dati clinici sulla vitrificazione utilizzando i Media di Irvine
Scientific e CryoTip® (Conaghan et al., 2010)
1200
100
1100
90
1000
80
900
Anche il tempo conta
70
800
60
700
La possibilità di ridurre il tempo di congelamento, che con la tecnica della
vitrificazione passa da parecchie ore a soli 10 minuti, permette di ottimizzare i tempi di laboratorio.
Minuti per completare il processo
200
600
50
500
40
400
• Guaina metallica per proteggere puntali e campioni
• Approvato FDA
• Marcato CE
• Sistema chiuso
30
300
20
200
10
100
0
# cicli
# Blastocisti
# Embrioni
trasferiti
160
HSV Straw
HSV Straw è uno strumento a sigillo termico che viene utilizzato per
contenere i campioni vitrificati.
120
1200
100
90
80
900
70
800
80
60
60
40
La qualità degli embrioni appare inalterata
dopo la vitrificazione
Evitando la formazione di cristalli intracellulari associata alla
tecnica del congelamento lento, la vitrificazione minimizza il
danneggiamento degli embrioni.
I blastocisti scongelati dopo vitrificazione appaiono identici
a quelli freschi suggerendo che gli embrioni umani tollerano
molto bene il processo di vitrificazione.
Blastocisti umani freschi
Blastocisti umani vitrificati/riscaldati
Photos Courtesy of Juergen Liebermann, PhD, Fertility Center of Illinois.
50
0
Vitrificazione Congelamento
Ragioni per scegliere la vitrificazione
“Quando (e non se) i programmi di IVF supereranno la paura della novità e raccoglieranno la sfida della vitrificazione
come miglioramento significativo, allora la vitrificazione diventerà lo standard clinico per la crioconservazione
di embrioni ed ovociti umani”.
Juergen Liebermann, PhD
Direttore del Laboratorio
Centro di fertilità dell’Illinois
Chicago, USA
“Qui alle HRC Laguna Hills abbiamo adottato la vitrificazione (Vit/kit-Freeze/Thaw e Cryotips
di Irvine) dal Marzo del 2007. Da allora abbiamo osservato un aumento significativo sia della
sopravvivenza embrionaria (+ 35%) sia delle gravidanze cliniche (+23%). I blastocisti
biopsizzati tollerano la vitrificazione meglio di quelli raffeddati lentamente mediante
criopreservazione”.
Charlotte Khoury
Direttore Scientifico
Huntington Reproductive Center
Laguna Hills, California
40
400
20
La vitrificazione ottenuta utilizzando Cryotip® ha evidenziato una maggiore
sopravvivenza degli ovociti rispetto alla tecnica di congelamento lento
con lo 0.2 e lo 0.3 mol/l di saccarosio (p < 0.05). Ciò suggerisce che
la vitrificazione con Cryotip ® è migliore del congelamento lento nel
mantenere la capacità degli ovociti di svilupparsi in embrioni completi.
Migliorata sopravvivenza degli embrioni
con la vitrificazione
600
500
a,b: I valori con gli stessi apici a e b sono significativamente differenti (P<0.05).
Tasso
% di gravidanze
d’impianto
cliniche
100
1100
1000
122
% di
sopravvivenza
Figura 4. Dati clinici sulla vitrificazione utilizzando i Media di Irvine
Scientific e HSV Straw (Liebermann el al., 2010)
700
167
0
180
140
34
Dimostrazione visiva della sopravvivenza post-vitrificazione
Photo Courtesy of Juergen Liebermann, PhD, Fertility Center of Illinois.
Sebbene il numero di gravidanze e di impianti effettuati con embrioni
congelati possa essere sovrapponibile a quello di gravidanze e impianti
effettuati con embrioni freschi, in questo modo si riduce notevolmente la
necessita di impiantare un alto numero di embrioni. I dati confermano che
è possibile ottenere un elevato tasso di gravidanza utilizzando blastocisti
vetrificati in pazienti di tutte le età mediante cicli di impianto di embrioni
congelati, permettendo ai clinici di optare per l’impianto di un singolo
embrione come tecnica elettiva (1).
Riduzione dei danni dovuti al raffreddamento
Strumenti per vitrificazione
• C omposto di resina ionomerica di alta qualità
• Disponibile in 6 colori diversi
• Marcato CE
• Sistema chiuso
Controllo Qualità
Ciascun lotto viene sottoposto ad un test completo nei laboratori di
Irvine Scientific che include un test su embrioni di topo e un test dei livelli di
endotossina, del pH, di osmolalità e di sterilità. Tutti i risultati sono
riportati nel certificato di Analisi fornito.
La dedizione di Irvine Scientific all’eccellenza è dimostrata dall’alta
qualità dei suoi prodotti e dal rispetto dei più alti standard di qualità. È
stata la prima azienda statunitense nel campo della riproduzione assistita
a conformarsi agli standard ISO 13485:2003 per i dispositivi medici.
I prodotti di Irvine Scientific vengono fabbricati seguendo le norme
guida per la produzione di diagnostici in vitro e le procedure di buona
fabbricazione (GMPs) per i dispositivi medici.
30
300
20
200
10
100
0
# cicli
# Blastocisti
# Embrioni
trasferiti
0
% di
sopravvivenza
Tasso
% di gravidanze
d’impianto
cliniche