identificazione identificazione biochimica

IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
Calsystem
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
La determinazione del profilo biochimico di un
microrganismo è il metodo più comunemente
utilizzato per l’identificazione
l identificazione microbiologica
microbiologica.
Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzano
le tecniche della microbiologia classica e non
prevedono l’impiego
l impiego di particolari attrezzature
attrezzature.
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
Il microrganismo da identificare viene coltivato su
substrati diversi costituiti da fonti di carbonio
specifici verificando la capacità del microrganismo
specifici,
di utilizzarli e trasformarli.
L’insieme di queste informazioni traccia un profilo
biochimico tipico di quell
quell’organismo
organismo che viene
confrontato con i profili noti arrivando così alla
sua identificazione.
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI
Principio
– Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per la
fermentazione degli zuccheri
Procedura
– Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di
pH (rosso fenolo)
Finalità
– Differenziare gli enterobatteri
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
UTILIZZAZIONE DEL CITRATO
Principio
– La utilizzazione del citrato come unica fonte di
carbonio determina una alcalinizzazione del terreno
Procedura
– Terreno liquido con l’aggiunta di citrato e un
indicatore di pH (blu di bromotimolo)
Finalità
– Differenziare Klebsiella o Enterobacter da Escherichia
o Salmonella
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
DECARBOSSILASI
Principio
– La decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammine
Procedura
– Terreno arricchito di amminoacidi ((lisina,, ornitina,,
arginina) con l’indicatore Porpora di bromocresolo che
vira al violetto se l’enzima è attivo
Finalità
– Determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
B-galattosidasi (ONPG)
Principio
– La B
B-galattosidasi
galattosidasi idrolizza ll’ONPG
ONPG (o-nitrofenil-b(o nitrofenil b
galattoside a nitrofenolo di colore giallo
Procedura
– Terreno contenente ONPG. Se l’enzima è presente il
pozzetto vira al colore giallo
Finalità
– Differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella
((-).
) Identificazione di alcune shigelle
g
e Pseudomonas
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
LIQUEFAZIONE DELLA GELATINA
Principio
– Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la
gelatina
Procedura
– Al brodo nutritivo si aggiunge gelatina al 12%. Se la
gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche
dopo raffreddamento.
Finalità
– Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
PRODUZIONE DI H2S
Principio
– LL’idrogeno
idrogeno solforato viene prodotto in seguito a
degradazione di amminoacidi contenenti gruppi solforici
o dalla riduzione del tiosolfato
P
Procedura
d
– Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come
solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H2S.
Finalità
– Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
INDOLO
Principio
– Il triptofano presente nelle proteine è convertito ad
indolo
Procedura
– La presenza di indolo è evidenziata dall’aggiunta al
terreno di dimetilaminobenzaldeide
Finalità
– Permette di differenziare Escherichia (+) da
Klebsiella /enterobacter
/
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
ROSSO METILE
Principio
– Batteri fermentanti che producono una miscela di acidi
sufficiente ad abbassare il pH al di sotto di 4.3
Procedura
– Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione
l’indicatore Rosso Metile
Finalità
– Permette di differenziare Escherichia (rossa) da
Klebsiella //enterobacter (g
(gialle))
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
RIDUZIONE DEL NITRATO
Principio
– Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione
anaerobia) riducendosi a nitrito o azoto
Procedura
– Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di
nitriti
i i i è evidenziata
id
i
dall’aggiunta
d ll’
i
di a-naftilammina/acido
f il
i / id
solfanilico che produce un colore rosso in presenza di nitriti
Finalità
– Aiuta a differenziare molti batteri enterici di solito positivi
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
FENILALANINA DEAMINASI
Principio
– La deaminazione produce acido piruvico.
Procedura
– Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo
p la crescita
l’aggiunta di cloruro ferrico determina una
colorazione verde
Finalità
– Caratterizza il genere Proteus e il gruppo
Providencia
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
IDROLISI DELL’AMIDO
Principio
– La soluzione Iodio/iodurata (LUGOL) dà un colore
bl in
blu
i presenza di amido.
id
Procedura
– I batteri sono fatti crescere in un terreno
agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si
inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la
eventuale
e
e tua e zona
o ad
di cchiarificazione
a ca o e intorno
to o a
alle
e co
colonie
o e
Finalità
– Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare
l’ id ad
l’amido
d esempio
i Bacillus
B ill
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
UREASI
Principio
– LL’urea
urea viene scissa in ammoniaca e CO2
Procedura
– Terreno contenente urea al 2% e fenolo come
indicatore di pH
Finalità
– Permette di distinguere Klebsiella(+) da
Escherichia (-)
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
VOGES-PROSKAUER (VP)
Principio
– LL’acetoina
acetoina viene prodotta dalla fermentazione
dello zucchero
Procedura
– Aggiunta del reattivo a-naftolo dopo incubazione.
In caso di positività si sviluppa un colore rosso
Finalità
– Permette di distinguere Klebsiella(+) e
Enterobacter ((+)) da Escherichia (-).
( ) Caratterizza i
ceppi di Bacillus
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
Questi metodi si sono evoluti nel tempo fino ad
arrivare a sistemi semi-automatici, addirittura
automatici che permettono di effettuare
automatici,
contemporaneamente un elevato numero di prove
biochimiche e confrontarle con database molto
ampi, mediante codici numerici.
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
L’identificazione di ogni e qualsiasi batterio
richiederebbe un elevato numero di test biochimici
di faticosa esecuzione e di difficile interpretazione.
interpretazione
I pannelli (o gallerie) vengono organizzati a
seconda dei gruppi batterici o lieviti da ricercare in
funzione intanto
funzione,
intanto, dell’origine
dell origine del campione e in
funzione di prove preliminari di orientamento.
Frequenza dei patogeni
urinari
i i
Escherichia coli
P t
Proteus
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Staphylococcus
Streptococcus
Pseudomonas
75%
10%
5%
%
5%
3%
2%
Gram –
G
Gram
–
Gram –
G
Gram
–
Gram –
Gram +
Gram +
Gram –
90%
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
Un pannello di identificazione per batteri urinari conterrà le
prove biochimiche adatte a discriminare le specie
elencate nella tabella precedente.
IDENTIFICAZIONE
BIOCHIMICA
Questa procedura richiede, però, un pannello per
ogni tipologia di campione per la probabilità
diversa della presenza di una determinata
specie.
L’orientamento attuale è di disporre di soli due
pannelli con un numero più significativo di
prove biochimiche (e non solo), uno per Grame uno per i Gram+.
Un terzo pannello da dedicare esclusivamente ai
lieviti ed ai funghi.
Prove preliminari di
orientamento
1.
Colorazione di Gram
•
2
2.
Discrimina i batteri in Gram+ e Gram-
T t KOH
Test
•
3.
E’ alternativa alla colorazione di Gram. I lipidi presenti nella parete dei
Gram- vengono disciolti dal KOH dando luogo ad una sostanza mucosa
filante all’ansa. I Gram+ non mostrano alcun cambiamento.
Catalasi
•
4
4.
La catalasi è un enzima capace di scindere l’acqua ossigenata in acqua
ed ossigeno. Per distinguere Staphylococcus (+) da Streptococcus (-)
Ossidasi
•
•
5.
La ricerca dell’enzima citocromo-ossidasi si esegue aggiungendo una
goccia di tetrametil-p-fenilendiammina sulla colonia o su una colonia
trasferita su una striscia di carta. Si sviluppa un colore rosa>viola
Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas
Emolisi
•
Per distinguere gli alfa dai beta-emolitici
L’evoluzione
L
evoluzione dei sistemi
ENTEROTUBE
L’evoluzione
L
evoluzione dei sistemi
ENTEROTUBE
L’evoluzione
L
evoluzione dei sistemi
ENTEROTUBE