IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Calsystem IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA La determinazione del profilo biochimico di un microrganismo è il metodo più comunemente utilizzato per l’identificazione l identificazione microbiologica microbiologica. Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzano le tecniche della microbiologia classica e non prevedono l’impiego l impiego di particolari attrezzature attrezzature. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Il microrganismo da identificare viene coltivato su substrati diversi costituiti da fonti di carbonio specifici verificando la capacità del microrganismo specifici, di utilizzarli e trasformarli. L’insieme di queste informazioni traccia un profilo biochimico tipico di quell quell’organismo organismo che viene confrontato con i profili noti arrivando così alla sua identificazione. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI Principio – Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per la fermentazione degli zuccheri Procedura – Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di pH (rosso fenolo) Finalità – Differenziare gli enterobatteri IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA UTILIZZAZIONE DEL CITRATO Principio – La utilizzazione del citrato come unica fonte di carbonio determina una alcalinizzazione del terreno Procedura – Terreno liquido con l’aggiunta di citrato e un indicatore di pH (blu di bromotimolo) Finalità – Differenziare Klebsiella o Enterobacter da Escherichia o Salmonella IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA DECARBOSSILASI Principio – La decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammine Procedura – Terreno arricchito di amminoacidi ((lisina,, ornitina,, arginina) con l’indicatore Porpora di bromocresolo che vira al violetto se l’enzima è attivo Finalità – Determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA B-galattosidasi (ONPG) Principio – La B B-galattosidasi galattosidasi idrolizza ll’ONPG ONPG (o-nitrofenil-b(o nitrofenil b galattoside a nitrofenolo di colore giallo Procedura – Terreno contenente ONPG. Se l’enzima è presente il pozzetto vira al colore giallo Finalità – Differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella ((-). ) Identificazione di alcune shigelle g e Pseudomonas IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA LIQUEFAZIONE DELLA GELATINA Principio – Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la gelatina Procedura – Al brodo nutritivo si aggiunge gelatina al 12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche dopo raffreddamento. Finalità – Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA PRODUZIONE DI H2S Principio – LL’idrogeno idrogeno solforato viene prodotto in seguito a degradazione di amminoacidi contenenti gruppi solforici o dalla riduzione del tiosolfato P Procedura d – Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H2S. Finalità – Aiuta nell’identificazione di molti batteri enterici IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA INDOLO Principio – Il triptofano presente nelle proteine è convertito ad indolo Procedura – La presenza di indolo è evidenziata dall’aggiunta al terreno di dimetilaminobenzaldeide Finalità – Permette di differenziare Escherichia (+) da Klebsiella /enterobacter / IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA ROSSO METILE Principio – Batteri fermentanti che producono una miscela di acidi sufficiente ad abbassare il pH al di sotto di 4.3 Procedura – Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione l’indicatore Rosso Metile Finalità – Permette di differenziare Escherichia (rossa) da Klebsiella //enterobacter (g (gialle)) IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA RIDUZIONE DEL NITRATO Principio – Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione anaerobia) riducendosi a nitrito o azoto Procedura – Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di nitriti i i i è evidenziata id i dall’aggiunta d ll’ i di a-naftilammina/acido f il i / id solfanilico che produce un colore rosso in presenza di nitriti Finalità – Aiuta a differenziare molti batteri enterici di solito positivi IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA FENILALANINA DEAMINASI Principio – La deaminazione produce acido piruvico. Procedura – Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo p la crescita l’aggiunta di cloruro ferrico determina una colorazione verde Finalità – Caratterizza il genere Proteus e il gruppo Providencia IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA IDROLISI DELL’AMIDO Principio – La soluzione Iodio/iodurata (LUGOL) dà un colore bl in blu i presenza di amido. id Procedura – I batteri sono fatti crescere in un terreno agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale e e tua e zona o ad di cchiarificazione a ca o e intorno to o a alle e co colonie o e Finalità – Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare l’ id ad l’amido d esempio i Bacillus B ill IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA UREASI Principio – LL’urea urea viene scissa in ammoniaca e CO2 Procedura – Terreno contenente urea al 2% e fenolo come indicatore di pH Finalità – Permette di distinguere Klebsiella(+) da Escherichia (-) IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA VOGES-PROSKAUER (VP) Principio – LL’acetoina acetoina viene prodotta dalla fermentazione dello zucchero Procedura – Aggiunta del reattivo a-naftolo dopo incubazione. In caso di positività si sviluppa un colore rosso Finalità – Permette di distinguere Klebsiella(+) e Enterobacter ((+)) da Escherichia (-). ( ) Caratterizza i ceppi di Bacillus IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Questi metodi si sono evoluti nel tempo fino ad arrivare a sistemi semi-automatici, addirittura automatici che permettono di effettuare automatici, contemporaneamente un elevato numero di prove biochimiche e confrontarle con database molto ampi, mediante codici numerici. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA L’identificazione di ogni e qualsiasi batterio richiederebbe un elevato numero di test biochimici di faticosa esecuzione e di difficile interpretazione. interpretazione I pannelli (o gallerie) vengono organizzati a seconda dei gruppi batterici o lieviti da ricercare in funzione intanto funzione, intanto, dell’origine dell origine del campione e in funzione di prove preliminari di orientamento. Frequenza dei patogeni urinari i i Escherichia coli P t Proteus Klebsiella Enterobacter Serratia Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas 75% 10% 5% % 5% 3% 2% Gram – G Gram – Gram – G Gram – Gram – Gram + Gram + Gram – 90% IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Un pannello di identificazione per batteri urinari conterrà le prove biochimiche adatte a discriminare le specie elencate nella tabella precedente. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA Questa procedura richiede, però, un pannello per ogni tipologia di campione per la probabilità diversa della presenza di una determinata specie. L’orientamento attuale è di disporre di soli due pannelli con un numero più significativo di prove biochimiche (e non solo), uno per Grame uno per i Gram+. Un terzo pannello da dedicare esclusivamente ai lieviti ed ai funghi. Prove preliminari di orientamento 1. Colorazione di Gram • 2 2. Discrimina i batteri in Gram+ e Gram- T t KOH Test • 3. E’ alternativa alla colorazione di Gram. I lipidi presenti nella parete dei Gram- vengono disciolti dal KOH dando luogo ad una sostanza mucosa filante all’ansa. I Gram+ non mostrano alcun cambiamento. Catalasi • 4 4. La catalasi è un enzima capace di scindere l’acqua ossigenata in acqua ed ossigeno. Per distinguere Staphylococcus (+) da Streptococcus (-) Ossidasi • • 5. La ricerca dell’enzima citocromo-ossidasi si esegue aggiungendo una goccia di tetrametil-p-fenilendiammina sulla colonia o su una colonia trasferita su una striscia di carta. Si sviluppa un colore rosa>viola Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas Emolisi • Per distinguere gli alfa dai beta-emolitici L’evoluzione L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE L’evoluzione L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE L’evoluzione L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE