ANALISI DEL CONTENUTO DEI GENI RIBOSOMIALI IN ALCUNE

Biol. Mar. Mediterr. (2009), 16 (1): 384-385
L. Galluzzi, F. Perini, E. Bertozzini, E. Garcés*, M. Magnani, A. Penna
Dipartimento di Scienze Biomolecolari, Sez. Biologia Ambientale, Università di Urbino,
Viale Trieste, 296 - 61100 Pesaro, Italia.
[email protected]
*Institut de Ciències del Mar, Barcelona, Spagna.
ANALISI DEL CONTENUTO DEI GENI RIBOSOMIALI
IN ALCUNE SPECIE DI DINOFLAGELLATE: IMPLICAZIONI
PER L’APPLICAZIONE DEI METODI DI REAL-TIME PCR
ANALYSIS OF r DNA GENE CONTENT IN DINOFLAGELLATE SPECIES:
IMPLICATIONS FOR THE QUANTITATIVE
REAL-TIME PCR-BASED METHODS
Abstract - Quantitative real-time PCR has shown to be a valid method for monitoring harmful algae
in environmental samples. In this study, we analyzed the rDNA gene content variability in dinoflagellate
species using a real-time PCR-based approach. Based on our studies we can take out some considerations
on the achievement and limits of this molecular technique applications in marine based ecosystems.
Key-words: Alexandrium, HAB, real-time quantitative PCR, ribosomal genes.
Introduzione - Circa 70 specie di dinoflagellate producono tossine dannose per
pesci e uomo, e spesso questo fenomeno è associato ad un’abbondante proliferazione
di tali specie che prende il nome di HAB (Harmful Algal Bloom). Recentemente è
stato dimostrato che le analisi basate sul metodo di real-time PCR sono in grado
di individuare e quantificare specie microalgali potenzialmente tossiche come A.
minutum e Prymnesium parvum in campioni ambientali (Galluzzi et al., 2004, 2008).
Il numero di copie di geni ribosomiali può essere usato per determinare il numero di
cellule target in campioni ambientali (Penna e Galluzzi, 2008; Tevfik Dorak, 2006).
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la quantità di geni ribosomiali
nelle specie Alexandrium catenella e A. taylori e l’applicabilità del metodo a campioni
ambientali per l’identificazione ed enumerazione di questi taxa micralgali HAB.
Materiali e metodi - Colture di A. taylori CBA-1 e A. catenella ACATS1sono state
mantenute in terreno f/2 (Guillard, 1975) a 20±1 °C e sottoposte ad un fotoperiodo
di 12:12 (luce:buio). I campioni ambientali sono stati raccolti nei pressi dell’isola
Vulcano, Italia, durante una fioritura di A. taylori e nel porto di Tarragona, Spagna,
durante una fioritura di A. catenella nell’estate 2003. Le cellule sono state contate
con metodo Utermöhl. Le colture e i campioni ambientali sono stati processati
secondo il metodo di Galluzzi et al. (2004) ed una diluizione del lisato è stata usata
direttamente in real-time PCR. Le regioni ITS1-5.8S-ITS2 dei geni ribosomiali di
A. catenella ACATS1 e A. taylori CBA-1 sono state clonate nel vettore plasmidico
pCR2.1 (Penna e Magnani, 1999). Tale plasmide è stato utilizzato per la costruzione
della curva standard in real-time PCR.
Risultati - L’esclusiva specificità dei primers per A. catenella e A. taylori è
stata dimostrata su BLAST e successivamente con una PCR qualitativa su diverse
specie HAB. La sensibilità della real-time PCR è stata valutata usando il plasmide
contenente le regioni ITS1-5.8S-ITS2 del gene ribosomiale di A. taylori, dimostrando
che il saggio è in grado di rilevare fino a 10 copie di DNA target in 35 cicli di
amplificazione. Il numero di copie di geni dell’rDNA presenti nella reazione di
PCR è stato calcolato riportando il valore dei Ct per ogni campione contenente il
lisato di un numero noto di cellule sulla curva standard. Poi, considerando il fattore
Analisi del contenuto dei geni ribosomiali in alcune specie di dinoflagellate
385
di diluizione, è stato calcolato il numero di copie di geni dell’rDNA per cellula
ottenendo rispettivamente 1.345±780 e 462.900±120.760 copie in A. taylori CBA-1 e
A. catenella ACATS1. Successivamente, sono stati utilizzati questi dati per stimare il
numero di cellule di A. catenella e A. taylori in campioni ambientali prelevati durante
una fioritura algale monospecifica delle due specie in questione. Dal confronto delle
stime ottenute con l’analisi real-time PCR e il metodo di conta Utermöhl sono
emerse notevoli differenze. Per questo motivo è stato determinato il numero di geni
dell’rDNA anche in altri ceppi: 8 ceppi di A. catenella e 3 ceppi di A. taylori. I risultati
hanno dimostrato una notevole variabilità tra ceppi diversi della stessa specie, e per
quanto riguarda A. taylori si è osservata variabilità nel numero di copie di geni
ribosomiali anche in relazione alle fasi di crescita della coltura. Il numero di copie
dei geni 5.8S-ITS rDNA di A. catenella variava da 189.570±99.558 del ceppo ACATS3
a 2.489.800±550.967 del ceppo CSIC-C7; mentre per A. taylori il numero di copie
variava da 1.345±780 del ceppo CBA-1 a 33.930±4.820 del ceppo CSIC-AV8. Infine,
si è osservato che la quantità di geni del rDNA di A. taylori VGO-703 diminuiva
notevolmente durante le fasi di crescita della coltura passando da circa 14.000 copie
per cellula durante la fase di lag a 3.000 copie per cellula durante la fase stazionaria.
Questa osservazione è in accordo con la variazione del contenuto di DNA genomico
della cellula durante le fasi di crescita della coltura misurato attraverso la citometria
a flusso (Figueroa et al., 2006). Il numero di copie di rDNA in A. catenella invece
rimaneva costante duranti le fasi di crescita della coltura, pertanto le analisi di realtime PCR relative a questa specie sono state effettuate su cellule prelevate da colture
in fase esponenziale.
Conclusioni - È stato dimostrato recentemente che la real-time PCR è un
metodo valido per la rilevazione e la quantificazione di alcune specie di microalghe
potenzialmente tossiche. Tuttavia, l’elevata variabilità del contenuto di geni dell’rDNA,
osservata in questo studio in diversi ceppi di A. catenella e A. taylori isolati nel Mar
Mediterraneo, dimostra che il metodo non può essere applicato per la rilevazione e
quantificazione di questi due taxa algali in campioni ambientali.
Bibliografia
FIGUEROA R.I., BRAVO I., GARCÉS E. (2006) - The multiple routes of sexuality in Alexandrium
taylori (Dinophyceae) in culture. J. Phycol., 42: 1028-1039.
GALLUZZI L., PENNA A., BERTOZZINI E., VILA M., GARCÉS E., MAGNANI M. (2004) Development of a real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Alexandrium
minutum (a dinoflagellate). Appl. Environ. Microbiol., 70: 1199-1206.
GALLUZZI L., BERTOZZINI E., PENNA A., PERINI F., PIGALARGA A., GRANELI E.,
MAGNANI M. (2008) - Detection and quantification of Prymnesium parvum (Haptophyceae)
by real-time PCR. Lett. Appl. Microbiol., 46: 261-266.
GUILLARD R.R.L. (1975) - Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith
W.L., Chanley M.H. (eds), Culture of marine invertebrate animals. Plenum, New York: 26-60.
PENNA A., MAGNANI M. (1999) - Identification of Alexandrium (Dinophyceae) species using
PCR and rDNA targeted probes. J. Phycol., 35: 615-621.
PENNA A., GALLUZZI L. (2008) - PCR techniques as diagnostic tools for the identification and
enumeration of toxic marine phytoplankton species. In: Evangelista V., Barsanti L., Frassanito
A.M., Passatelli V., Gualtieri P. (eds), Algal toxins: nature, occurrence, effect and detection.
NATO Book. Springer, Netherlands: 261-283.
TEVFIK DORAK M. (2006) - Real Time PCR. Taylor and Francis, Cornwall, U.K.