La dimostrazione dell`essenzialit dei sistemi di trasporto per

PROGRAMMA DI RICERCA
Titolo
Caratterizzazione funzionale del sistema di trasporto di carnitina di membrana plasmatica OCTN2: studi
funzionali sulla proteina estratta da cellule renali di ratto e sulla proteina umana ricombinante ricostituite
in liposomi.
Background
La carnitina svolge funzioni essenziali per la cellula (Reda et al. 2003):
1. la β ossidazione, il più importante processo attraverso il quale acidi grassi a lunga catena vengono
ossidati nei mitocondri, dipende dalla carnitina, in quanto responsabile dell’ingresso degli stessi,
sottoforma di acilcarnitine, all’interno dei mitocondri;
2. il processo di detossificazione da metaboliti di scarto, da residui acilici tossici, da farmaci (è il caso ad
esempio dell’acido valproico, eliminato a livello del tubulo prossimale renale sottoforma di
valproilcarnitina (Ohashi et al 1999));
3. la β-ossidazione nei perossisomi;
4. il trasferimento di acetili o altri gruppi acilici a catena corta dai perossisomi ai mitocondri
5. la regolazione del bilancio acilcoenzimaA-coenzimaA (acilCoA-CoA);
6. la riesterificazione del triacilglicerolo nel reticolo endoplasmico prima della secrezione sottoforma di
lipoproteine a densità molto bassa (VLDL);
7. la stimolazione del metabolismo ossidativo del piruvato e degli amminoacidi a catena ramificata;
8. il ruolo determinante nella regolazione da parte dell’insulina della velocità del metabolismo dei grassi e
del glucosio nel muscolo scheletrico;
9. la sintesi e l’allungamento di acidi grassi poliinsaturi.
Questi ruoli metabolici coinvolgono la funzione della carnitina in concerto con un sistema di proteine
dipendenti dalla carnitina stessa, si parla pertanto del sistema delle carnitine, i cui costituenti sono
rappresentati da diverse proteine di trasporto ed isoenzimi carnitina aciltransferasi, localizzati nei vari
compartimenti cellulari. Fra questi, OCTN2, un trasportatore di membrana plasmatica presente a livello
intestinale e renale è adibito, rispettivamente, all’assorbimento e riassorbimento di carnitina ossia al
mantenimento dell’omeostasi di carnitina. Il pool cellulare di carnitina infatti è solo in parte dovuto alla
sintesi endogena della molecola, che avviene nel fegato, che non è sufficiente al fabbisogno dell'
organismo (Bieber et al 1988; Ramsay et al 2001; Vaz et al 2002). Quindi, una quota significativa di
carnitina proviene dall’alimentazione (dall’assorbimento a livello intestinale) e dal riassorbimento a
livello renale. OCTN2 appartiene alla sottofamiglia degli OCTN, trasportatori implicati nei processi di
assorbimento e riassorbimento nelle cellule intestinali e renali; la distribuzione della carnitina ai vari
tessuti è mediata dagli stessi trasportatori presenti nelle membrane di quasi tutte le cellule. Questi
trasportatori sono inoltre coinvolti nei processi di escrezione; infatti nel lume del tubulo renale la
carnitina, non essendo metabolizzata, può essere escreta come tale, o essere utilizzata come vettore di
eliminazione di molecole di scarto sottoforma di acilderivati. OCTN2 catalizza il trasporto di
carnitina/Na+ in scambio con acil-derivati. Il ruolo svolto da OCTN2 è duplice in quanto, realizzando
l’ingresso di carnitina nel citosol, ne consente la distribuzione nei vari organuli e nei vari tessuti.
Negli ultimi anni l’interesse per lo studio, nel campo biomedico, di sistemi di trasporto di membrana
cellulare è aumentato notevolmente in seguito all’identificazione di connessioni fra patologie, spesso
gravi o addirittura incompatibili con la vita, e alterazioni genetiche o acquisite della funzione dei sistemi
di trasporto. Ad es., mutazioni che interessano il gene che codifica per il trasportatore della carnitina di
membrana plasmatica OCTN2 causano una patologia nota come deficienza di carnitina primaria,
(Lahjouji et al 2001), caratterizzate da encefalopatia, problemi respiratori causati da cardiomiopatia,
ipoglicemia ipochetotica, coma.
Finora, studi funzionali sui sistemi di trasporto OCTN sono stati realizzati in vescicole di brush border o
in sistemi cellulari che over-esprimono la proteina (Tamai et al 1998; Tamai et al 2000, Wu et al 1999,
Lahjouji et al 2002; Tamai et al 2001; Ohashi et al 1999; Stieger et al 1995; Friedrich et al 2003; Ohashi
et al 2001). Attraverso questi approcci sono state chiarite alcune proprietà dell’OCTN2: ad esempio,
questo trasportatore catalizza un trasporto di carnitina sodio dipendente attraverso un meccanismo di
antiport; substrati come le acilcarnitine, la betaina, la colina e il tetraetilammonio inibiscono il trasporto di
carnitina. Nonostante i molti studi realizzati nei sistemi cellulari, mancano ancora molte informazioni
relative alla funzione ed alla struttura di questo sistema di trasporto; non è chiaro il ruolo dell’OCTN2
nella secrezione dei cationi organici. E’ stata documentata la dipendenza del trasporto di carnitina dalla
presenza dello ione Na+ sul versante luminale del trasportatore, ma non esistono dati relativi alla Km, ad
un’eventuale regolazione da parte di Na+ sul sito citoplasmatico della proteina. Non esistono dati relativi
alla stechiometria del trasporto carnitina:Na+, ne è noto se si tratti di symport o antiport. Molti dati
funzionali disponibili sono fra loro contraddittori o comunque non chiari. E’ il caso, ad esempio, della
dipendenza del trasporto di carnitina dalle condizioni di pH: i dati riportati in letteratura mostrano come la
variazione del pH non influenza il trasporto di carnitina (Lahjoiuji 2002), al contrario, altri dati riportati
mostrano una riduzione dell’attività di trasporto in condizioni di acidità. Tale risultato sarebbe in
contraddizione con quanto ci si aspetterebbe, considerato che, in condizioni fisiologiche, il lume tubulare
è notoriamente acido (Tamai et al. 2000).
Recentemente abbiamo realizzato la ricostituzione in membrane artificiali di alcuni sistemi di trasporto di
membrana plasmatica, fra cui il trasportatore OCTN2 (Pochini et al 2004, Oppedisano et al 2004) estratto
da rene di ratto. La ricostituzione è una tecnica avanzata per lo studio del trasporto di membrana che
consiste nell'inserimento di proteine di trasporto in sistemi di membrana artificiali, i liposomi, vescicole
sferiche costituite da bilayer fosfolipidici simili a quelli delle membrane cellulari. Nei liposomi il
trasporto viene studiato seguendo il passaggio, dall’esterno all’interno delle vescicole o viceversa, di
molecole marcate con radioisotopi. I vantaggi dello studio del trasporto nel sistema ricostituito sono
molteplici: assenza di interferenze che, nelle cellule, sono causate dalla presenza di altri sistemi di
trasporto ed enzimatici; controllo delle condizioni sperimentali in entrambi i compartimenti, interno ed
esterno; migliore risoluzione della cinetica del trasporto; possibilità di modificare la composizione
lipidica della membrana, che spesso influenza l'attività di trasporto. Grazie a tale tecnica abbiamo rivelato
importanti proprietà funzionali del trasportatore OCTN2 di ratto non ancora note dagli studi in cellule
intatte, fra cui l’asimmetria funzionale del trasportatore, la regolazione da pH, ecc.
I dati relativi alla regolazione da pH ottenuti nel sistema ricostituito (Pochini et al. 2004) sono differenti
da quelli riportati per OCTN2 di topo studiata nei sistemi cellulari (Tamai et al 2000); la dipendenza
trovata nel sistema ricostituito è in buon accordo con il contesto fisiologico; quindi siamo portati a
ritenere che la dipendenza dal pH trovata nei liposomi sia quella più probabile per il sistema di trasporto.
Scopo della ricerca
Fino ad ora soltanto alcuni trasportatori di membrana plasmatica sono stati ricostituiti in liposomi per
affrontare studi funzionali (è il caso ad esempio del trasportatore del glucosio GLUT1 (Kasahara et al
1996). Ciò ha determinato un ritardo nelle conoscenze di tali sistemi che rivestono un ruolo molto
importante nel metabolismo cellulare ed in molte patologie diffuse nella popolazione.
Lo scopo di questo progetto è di utilizzare il sistema ricostituito al fine di:
-approfondire e chiarire molti aspetti ancora discordanti o non noti del sistema di trasporto di membrana
plasmatica OCTN2, comprese eventuali alterazioni funzionali che causano patologie;
- valutare l'effetto di alcuni farmaci sul trasportatore;
- approfondire la regolazione dal pH e la modalità con cui si realizza questa regolazione, ossia se avviene
attraverso interazione dei protoni a livello di un particolare sito del trasportatore o se si tratta di
cotrasporto; sarà inoltre importante valutare le alterazioni che subiscono i parametri cinetici della
proteina;
-mettere a punto il sistema sperimentale per lo studio della funzione della corrispondente proteina umana
(OCTN2) ottenuta mediante tecniche di DNA ricombinante sia per la conoscenza funzionale che per le
successive applicazioni nello studio della causa di patologie del loro trattamento farmacologico. Al fine
di poter studiare la proteina umana, OCTN2 sarà overespressa in cellule batteriche o di lievito, partendo
dal cDNA che codifica per la proteina umana di trasporto. Il cDNA verrà amplificato a partire da una
library di cDNA di fegato umano, 10 ng/μl, utilizzando opportuni primer forward e reverse contenenti, a
monte della sequenza del cDNA, siti di restrizione per specifici enzimi, selezionati tenendo conto della
sequenza del cDNA presente in Banca Dati. Questi enzimi saranno scelti sulla base della sequenza del
cDNA che vogliamo clonare, al fine di non frammentarlo. Successivamente, sfruttando i siti di restrizione
da noi inseriti all’esterno del cDNA, quest’ultimo ed un vettore plasmidico verranno digeriti con gli stessi
enzimi di restrizione. Sfruttando le estremità coesive generate dal taglio, sarà possibile inserire il cDNA
nel plasmide. Il costrutto ricombinante, così ottenuto, verrà utilizzato per trasformare il ceppo batterico E.
Coli TG1 specializzato nell’amplificazione del plasmide ricombinante. Il passo successivo sarà quello di
estrarre il costrutto amplificato ed inserirlo in altri ceppi batterici, quali E. Coli JM109 ed E. Coli C0214,
in cui avverrà l’over-espressione del prodotto proteico corrispondente, indotta da IPTG (isopropil-β-Dtiogalatto-piranoside). OCTN2 potrebbe contenere una porzione glicosidica in quanto presenta nella
sequenza amminoacidica potenziali siti di glicosilazione. Qualora la proteina ottenuta non presentasse
attività di trasporto, a causa dell’assenza della porzione glicosidica, che i batteri non possono produrre, il
costrutto ricombinante verrà inserito in cellule di lievito in grado di glicosilare le proteine. La proteina
ricombinante umana sarà ricostituita nei liposomi, analogamente alla proteina estratta dalle cellule renali,
al fine di valutare le proprietà funzionali. Questa fase sperimentale sarà realizzata mediante lo studio e
l'ottimizzazione dei parametri della ricostituzione, precedentemente ottimizzati per la proteina estratta da
tessuto (Pochini et al 2004). La realizzazione del sistema di rivelazione dell'attività di trasporto della
proteina ricombinante umana permetterà successive applicazioni nello studio di proteine derivanti da geni
alterati, che potranno essere prodotte mediante le stesse tecniche di over-espressione utilizzate per la
proteina nativa. I dati sulla funzione e regolazione delle proteine mutate daranno informazioni sulle cause
molecolari della patologia e quindi permetteranno di realizzare test diagnostici e di ottimizzare gli
eventuali trattamenti farmacologici.
Bibliografia
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