l`analisi di SNP mediante AB7900 E. Porcu

QUALITA’ DELL’ASSISTENZA: LE TECNICHE ISTOLOGICHE:
DALLA FORMAZIONE DI BASE ALLA SPECIALIZZAZIONE NEL
LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA
L’analisi di SNP mediante
AB7900
Emanuele Porcu
Laboratorio di Genetica Molecolare, Patologia
Cardiovascolare e dei Trapianti Fondazione I.R.C.C.S.
Policlinico S. Matteo - Pavia
Polymerase Chain Reaction
Primers and DNA
Strand denaturation and
primer annealing
PCR
Primer extension
Dreischrittreaktion
Denaturation 95°C
Annealing 50-60°C
Cycling:
Exponential amplification
of PCR products
Extension 72°C
Polymerase Chain Reaction
PCR Product
Plateau phase
Linear phase
End point analysis
on agarose gels
Exponential phase
Cycles
Time Point of PCR Analysis
96 Replicas
PCR Product
Variable plateau phase
High precision during
exponential phase
Cycles
La Tecnologia TaqManTM
• UTILIZZA DUE OLIGONUCLEOTIDI E UNA SONDA
INTERNA
• LA SONDA E’ LEGATA AD UNA MOLECOLA FLUORESCENTE
ALL’ESTREMITA’ 5’ E AD UN “QUENCHER” ALL’ESTREMITA’
3’.
• LA SONDA E’ BLOCCATA AL 3’ IN MODO CHE NON POSSA
FUNZIONARE COME PRIMER PER LA PCR
• LA SEQUENZA DELLA SONDA E’ COMPLEMENTARE AD UNA
REGIONE DEL TRATTO DA AMPLIFICARE
• DURANTE LA PCR LA SONDA SI APPAIA AL DNA E VIENE
DEGRADATA DALL’ATTIVITA’ 5’ ESONUCLEASICA DELLA
Taq POLIMERASI PROVOCANDO IL RILASCIO DELLA
MOLECOLA FLUORESCENTE.
Signal Generation
TaqMan® Probe
The 5′-Nuclease Assay
This method uses 2 principles:
• FRET Technology
• 5′- Nuclease Activity of the Taq Polymerase
5’ Nuclease Assay
using TaqMan® probes
FAM™, VIC®
5’
3’
Forward
Primer
R
TAMRA™
TaqMan®
Probe Q
p
5’
5’
Reverse
Primer
• PCR specificity (primer)
• Hybridization specificity (probe)
3’
5’
5’ Nuclease Assay
using TaqMan® probes
Q
R
5’
3’
5’
p
5’
3’
5’
5’ Nuclease Assay
using TaqMan® probes
R
Q
R
p
p
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Displacement
5’ Nuclease Assay
using TaqMan® probes
R
Q
5’
3’
p
5’
3’
5’
5’
• Displacement and Cleavage
• FRET disabled
5’ Nuclease Assay
using TaqMan® probes
R
Q
p
5’
3’
5’
5’
3’
5’
• Polymerization completed
• Signal generation
Quenching process
n
t io
ta
ci
Ex
FAM™
Reporter emission spectra
and quencher excitation
spectra overlap
FRET
Fluorescence Resonance
Energy Transfer
TAMRA™
Emission
TaqMan® MGB probes
R
R
NFQ
MGB
MGB
MGB: Minor Groove Binder
NFQ: Non-Fluorescent Quencher
Stabilization of last 5-6 bp on 3‘ end
Shorter and more specific probes for a given Tm
SNP: Single Nucleotide
Polymorphism
•Gli SNP sono variazioni polimorfiche a
livello del singolo nucleotide con una
frequenza > 1%
•Rappresentano la classe più comune di
varianti del DNA
•Possono essere associati a malattie
monogeniche o a polimorfismi molecolari
Allelic Discrimination
AD
What is a SNP?
Allele 1
Allele 2
5’-GTCGTACGTCAGTCCG-3’
5’-GTCGTACTTCAGTCCG-3’
3’-CAGCATGCAGTCAGGC-5’
3’-CAGCATGAAGTCAGGC-5’
• Single Nucleotide Polymorphism
• Allelic frequency of minor allele > 1%
• Usually two alleles present („bi-allelic markers“)
Why investigating SNPs?
• SNPs with biological effect
– Drug metabolism („Pharmacokinetics“)
e.g. Cytochrome p450
– Direct cause of disease
e.g. Factor V Leiden, sickle-cell anaemia
• SNPs used as genetic markers
– Association studies
– Linkage mapping
AD
R
Q
MGB
P
R
Q
MGB
P
R
Q
Presence
of
Allele 1
MGB
P
R
Q
P
MGB
Presence
of
Allele 2
Q
MGB
Presence
of
Allele 1
G
M
Q
P
B
Q
R
G
M
P
B
Presence
of
Allele 2
Q
R
MG
B
Allele Calling
End Point Analysis
Genotype
Allele
Signal
FAM
Homozygous 1/1
Homozygous 2/2
Heterozygous 1/2
VIC
AD
ABI
®
PRISM
7900HT SDS
Inside the instrument
Data Acquisition
• one data point per well each
all 7 to 10 seconds
• important: data acquisition
only in defined wells
• Size of run files:
approx. 20 MB for 384 well block
approx. 4 MB for 96 well block
Side view
Front view
Dyes:
SYBR® Green 1 Dye 528 nm
FAM™
530 nm
TET™
540 nm
VIC®
554 nm
JOE™
554 nm
NED™
576 nm
TAMRA™
582 nm
ROX™
610 nm
Spectral Overlap
500 nm
660 nm
Amplification Plot View
Reporter Signal
Semilog and linear
Quantificazione assoluta: campione omozigote
Quantificazione assoluta: campione eterozigote
Discriminazione allelica: i risultati
Mutati
Eterozigoti
Wt
Applicazioni della Tecnologia
TaqMan
•PCR quantitativa
Assoluta (es. viremie)
Relativa (es. espressione genica)
•“End point” (es. genotipizzazione)
I supporti dell’ABI7900
•Blocco da 96 pozzetti
•Blocco da 384 pozzetti
•MFC: Micro Fluidic Card
384 spots
TaqMan® Assays
pre-loaded
384 spots
1 to 8 Samples
12 to 380 Genes
(per
(per one
one array)
array)
No. of Replicates
I geni modificatori
Utilizzo del sistema ABI7900
per lo studio di polimorfismi nei
geni ADRB1 e ADRB2 in pazienti
affetti da Sindrome di Marfan
Marfan Syndrome
• Malattia genetica del tessuto connettivo,
a trasmissione autosomica dominante
• Incidenza: circa 1 di 5000
• 25-30%dei casi: mutazioni de novo
• Outcome e l’attesa di vita: legati al
coinvolgimento cardiovascolare
• Malattia monogenica causata da difetti
del gene della fibrillina 1
Il gene della Fibrillina 1: uno dei nostri geni più grandi
Deduced pre-fibrillin: 2.871 AA
Ex 11-63: 49 cys-rich repeats
1
Title
64,65
aminoter.
carboxyter.
EGF
EGFcb
TGFbeta1 binding protein
hybrid motif
proline-rich
La diagnosi si ottiene
combinando insieme i segni
clinici, criteri maggiori e
minori
• La diagnosi molecolare è un criterio
maggiore:
– Diagnosi molecolare significa identificare il
difetto del gene che causa la malattia
– Spesso i difetti sono “privati”: questo
dipende dalla limitata diffusione della
diagnostica molecolare
Beta-1-Adrenergic Receptor
Gene Map Locus 10q24-q26
Ser49Gly (A → G)
Arg389Gly (G → C)
Beta-2-Adrenergic Receptor
Gene Map Locus 5q32-q34
T -19C
Arg16Gly (A→G)
Gln27Glu (C → G)
Thr164Ile (C → T)
Ser220Cys (C → G)
Ser49Gly Arg389Gly
Exon 1
-19 C/T Arg16Gly Gln27Glu Thr154Ile Ser220Cys
Exon 1
EMOCROMATOSI
EREDITARIA (HH):
basi genetico-molecolari
EMOCROMATOSI EREDITARIA
(HH)
• Malattia
genetica caratterizzata da
sovraccarico di ferro da iperassorbimento
intestinale
• OMIM # 235200 (Online Mendelian
Inheritance in Man,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/)
• E’ una delle malattie autosomiche recessive
più comuni nella popolazione caucasica
(prevalenza: 2-5/10000).
Cause genetiche
dell’Emocromatosi
Ereditaria
Gene responsabile della forma più comune: HFE
• localizzato sul braccio corto del cromosoma 6, si
trova molto vicino ai geni HLA, cioè ai geni che
determinano
l'istocompatibilità.
Contiene
l'informazione per la produzione di una proteina
importante nella regolazione dell'assorbimento del
ferro, anche se la sua funzione esatta è ancora
oggetto di studio. Nelle persone affette da EC, questo
gene presenta delle alterazioni (mutazioni) che ne
alterano la funzione.
Gene HFE
(Totaro et al, Genomics 1996)
• Mappato nel 1996 ha
fornito notevoli progressi
nella comprensione della
patofisiologia dell’HH.
• Localizzato sul braccio
corto del chr 6 (6p21.3),
in prossimità dei geni HLA
Mutazioni del gene HFE
Le due mutazioni più
frequenti del gene
HFE sono:
• C282Y
• H63D
L’identificazione del gene
HFE:
•
Ha permesso lo sviluppo di
un valido test genetico su
prelievo
di
sangue
periferico, che consente in
molti casi, di diagnosticare
la malattia senza indagini
invasive (biopsia epatica).
Malattie cardiovascolari e
genetica
• M. monogeniche
–
–
–
–
–
Con coinvolgimento di un singolo organo
Sindromi
“Fenotipi criptici”
Eterogeneità fenotipica e genotipica
I geni modificatori
• Malattie multifattoriali o tratti complessi
Le tecniche di diagnostica molecolare
hanno trovato applicazione in quasi tutti i
campi della patologia:
•Ricerca di mutazione ereditarie alla base
dello sviluppo di malattie genetiche pre o
post-natali
•Ricerca di mutazioni acquisite che
provocano lo sviluppo dei tumori
•Diagnosi e classificazione delle neoplasie,
specialmente quelle che originano dal
sistema emopoietico
•Farmacogenetica
•Determinazione di relazione ed identita’
nei trapianti, prove di paternita’ e
medicina forense
Genetica del cancro
•Eziologia multifattoriale, causate
quindi dall’interazione tra fattori
genetici ed ambientali
•Il cancro è una malattia genetica
della cellula somatica perché riguarda
alterazioni del genoma, dovute
all’accumulo di mutazioni di specifici
geni che promuovono la selezione
clonale delle cellule ad elevato ritmo
di crescita.
Conclusioni
Vantaggi
•Possibilità di effettuare su di un
unico sistema studi di profili di
espressione genica e di
genotipizzazione
• Possibilità di effettuare 96 o 384
test per esperimento
• Velocità di esecuzione del test
•Sensibilità > 95%
• Traslazione efficace delle
metodiche dalla ricerca alla pratica
diagnostica
Conclusioni
Svantaggi
• Costo del sistema e dei
reagenti
• Necessità di avere dei sistemi
per la validazione dei casi dubbi
(sequenziamento automatico
diretto)
• Necessità di un contesto con
una adeguata strumentazione di
supporto genetico-molecolare
Laboratorio di Genetica Molecolare,
Patologia Cardiovascolare e dei
Trapianti
Eloisa Arbustini
Maurizia Grasso
Marta Diegoli
Eliana Disabella
Marilena Tagliani
Nicola Marziliano
Silvia Ansaldi
Claudia Lucchelli
Andrea Pilotto