controllo interno di qualità dell`RNA estratto

RECK
controllo interno di qualità dell'RNA estratto
ELIT ech Gro u p S.p .A.
C.so Svizzera, 185
10149 Torino ITALY
Uffici: Tel. +39-011 976 19 Fax +39-011 936 76 11
E. mail: [email protected]
sito WEB: www.elitechgroup.com
RK100
Nella prima fase il CPE-RNA, una soluzione stabilizzata di RNA genomico di fago MS2, è aggiunto
dopo il campione al sistema di estrazione in modo da fornire il controllo interno. Il CPE-RNA è estratto e
retrotrascritto insieme all'RNA del campione.
Nella seconda fase il RECK, utilizzato come diluente dell'enzima Taq DNA polimerasi, è aggiunto
alla reazione di amplificazione per il parametro in analisi. Il RECK fornisce gli oligonucleotidi di innesco per
la coamplificazione della regione genomica che codifica per la proteina di assemblaggio del cDNA di fago
MS2.
La presenza del prodotto specifico della reazione di amplificazione del CPE-RNA indica la
correttezza dell'esecuzione dell'estrazione, della trascrizione inversa e dell'amplificazione.
RECK
Il RECK permette inoltre di verificare visivamente l'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di
amplificazione grazie alla sua colorazione e di caricare direttamente il prodotto della reazione di
amplificazione su gel di agaroso grazie alle sue caratteristiche di densità e di colorazione.
controllo interno di qualità dell'RNA estratto
CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO
-20°C
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Il RECK può essere utilizzato sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di una sola reazione di
amplificazione (single round) sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni di
amplificazione (nested).
Il RECK può essere utilizzato in reazioni di amplificazione il cui prodotto specifico sia una molecola
di DNA di dimensioni inferiori a 500 bp.
SOMMARIO
USO PREVISTO
PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO
CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO
ALTRI PRODOTTI RICHIESTI
MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO
MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
PROCEDURA
PROBLEMI E SOLUZIONI
LEGENDA DEI SIMBOLI
pag. 1
pag. 1
pag. 2
pag. 2
pag. 3
pag. 3
pag. 3
pag. 5
pag. 9
pag. 10
Il RECK può essere utilizzato in reazioni di amplificazione la cui temperatura di ibridazione degli
oligonucleotidi di innesco (annealing) sia compresa tra i 50°C e i 60°C .
Il RECK è calibrato in modo da non modificare la sensibilità della reazione di amplificazione.
Quando utilizzato con i prodotti della serie OligoMIX, la sensibilità della reazione di amplificazione rimane di
circa 10 molecole di cDNA bersaglio nei 10 µL di prodotto della reazione di trascrizione inversa aggiunti
alla provetta «monotest».
Il prodotto consente di effettuare il controllo di idonetà di 50 estrazioni e di 100 reazioni di
amplificazione totali (100 single round o 50 nested), controlli positivi e negativi compresi.
ALTRI PRODOTTI RICHIESTI
USO PREVISTO
Il prodotto trova impiego nel controllo di idoneità dell'RNA estratto da campioni biologici nei
saggi di trascrizione inversa ed amplificazione.
Il prodotto inoltre facilita le procedure analitiche nei saggi di trascrizione inversa ed
amplificazione.
L'identificazione dei campioni non idonei nei saggi di amplificazione per la ricerca di un cDNA
bersaglio nel prodotto della reazione di trascrizione inversa ottenuto dall'RNA estratto da campioni biologici
può essere utilizzata per l'accertamento dei campioni veri negativi.
I reagenti per l'estrazione dell’RNA dai campioni da analizzare, per la trascrizione inversa dell’RNA,
per l'amplificazione, per il controllo positivo di amplificazione e per la rivelazione del DNA amplificato non
sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l’impiego dei seguenti
prodotti accessori prodotti da ELITechGroup S.p.A.:
«EXTRAgen» (codice EXTG01), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni non cellulari; il kit
consente di effettuare 50 estrazioni;
«EXTRAzol» (codice EXTR01), kit di estrazione dell’RNA da campioni cellulari e non cellulari; il kit
consente di effettuare 50 estrazioni;
«RT-kit plus» (codice BRK200), kit di trascrizione inversa dell’RNA con “random primer”; il kit
consente di effettuare 50 reazioni;
PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO
Il prodotto fornisce il controllo positivo di estrazione di RNA CPE-RNA e la miscela di controllo
RECK, aliquotati in provette e pronti all'uso.
La procedura prevede l'impiego del controllo positivo di estrazione di RNA nella fase di estrazione e
della miscela di controllo nella fase di amplificazione.
«DNA pol. 2U / µL» (codici ER40, ER140), enzima DNA polimerasi termostabile per l'amplificazione
degli acidi nucleici; il prodotto ER40 consente di effettuare 25 reazioni, il prodotto ER140 consente
di effettuare 100 reazioni.
serie «OligoMIX Alert kit», kit di amplificazione del cDNA prodotto dalla trascrizione inversa
dell’RNA estratto da campioni biologici;
serie «Positive Control», controlli positivi di amplificazione di DNA plasmidico;
serie «ELECTROPHORESIS» (codici EPH02 o EPH04), rivelazione del DNA amplificato per
elettroforesi su gel d’agaroso; il kit consente di effettuare 64 estrazioni.
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CPE-RNA
RECK
Descrizione
controllo positivo
di estrazione di RNA
miscela di controllo
Quantità
Composizione
4 x 150 µL
~3 fM RNA genomico MS2,
BSA acetilata,
Guanidina tiocianato,
Sodio laurilsarcosinato,
100 mM 2-Mercaptoetanolo,
Sodio citrato, Acido Cloridrico
Poliacrilamide lineare
4 x 200 µL
0,1 µM oligonucleotidi
TRIS-HCl, saccaroso,
Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF
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Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare
MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO
Componente
RECK
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Etichettatura
Xn - NOCIVO
-
MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO
- Cappa a flusso laminare.
- Guanti monouso in lattice o simili.
- Microcentrifuga da banco (12.000 - 14.000 RPM).
- Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µL, 2-20 µL, 5-50 µL).
- Acqua bidistillata sterile.
- Termostato programmabile (thermal - cycler).
Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la
rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in
particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni
da parte di prodotti di amplificazione.
E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione
e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione
nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione.
E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle
reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire
camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per
l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione.
I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono
essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai
essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere
dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali
con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed
RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per
l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette
utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del
tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere
sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA.
I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione
nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di
amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro.
Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti
Avvertenze e precauzioni generali
Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti
infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale
che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno
30 minuti oppure trattato in autoclave a 121°C per un'ora prima di essere smaltito.
Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in
grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o
aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale
monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere
neutralizzati prima dell'eliminazione.
Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia.
Non pipettare a bocca alcuna soluzione.
Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro.
Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti.
Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti.
Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio.
Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio.
Rispettare la data di scadenza del prodotto.
Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore.
Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi.
Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori.
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Il reagente CPE-RNA presenta le seguenti frasi di rischio (R) e i seguenti consigli di prudenza (S):
Xn - NOCIVO
R 20/21/22-32. Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con la pelle
libera gas altamente tossico.
S 20-23-37-50. Non mangiare né bere durante l'impiego. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol.
Usare guanti adatti. Non mescolare con acidi.
Il reagente RECK presenta i seguenti consigli di prudenza (S):
S 23-25. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi.
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Allestimento della trascrizione inversa
PROCEDURA
Il sistema di trascrizione inversa deve utilizzare oligonucleotidi a sequenza casuale "random primer"
come innesco della reazione di polimerizzazione del cDNA.
Impostazione del ciclo termico
Prima di iniziare la sessione è necessario:
- verificare che i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione principale prevedano
una temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco (annealing) compresa tra i 50°C e i
- impostare
sul thermal - cycler i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione
60°C
;
principale.
Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica ai parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione.
Campioni
Il materiale da utilizzare con questo prodotto deve essere costituito dal prodotto della reazione di
trascrizione inversa (cDNA) ottenuto dall’RNA estratto da campioni biologici.
Il sistema di trascrizione inversa dell'RNA deve utilizzare i "random primer" per l'innesco della
reazione di polimerizzazione.
Quando si impiegano campioni biologici cellulari, per esempio sangue intero, si consiglia di
verificare la quantità di RNA totale estratto che è immessa nella reazione di trascrizione inversa, per evitare
la comparsa di prodotti aspecifici e possibili fenomeni di inibizione nella successiva reazione di
amplificazione.
La concentrazione finale massima dell’RNA totale nella reazione di trascrizione inversa dovrebbe
essere di circa 40 ng / µL. Per esempio, la quantità massima di RNA totale che può essere immessa in una
reazione di trascrizione inversa con volume finale di 25 µL è di circa 1 µg.
Il sistema di estrazione dell'RNA dal campione di partenza deve fornire RNA idoneo all'uso in
reazioni di trascrizione inversa ed amplificazione.
Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle
a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti.
Controlli di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione
Allestimento dell'estrazione
Prima di iniziare la sessione è necessario:
- scongelare una provetta di CPE-RNA, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per
riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio.
Nota bene: Il CPE-RNA deve essere utilizzato nella prima fase della procedura di estrazione.
● Dopo l'aggiunta del campione alla soluzione lisante, aggiungere 10 µL di CPE-RNA a ciascuna provetta
di estrazione e mescolare per inversione.
Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di estrazione.
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Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di retrotrascrizione.
Allestimento dell'amplificazione
Prima di iniziare la sessione è necessario:
- scongelare una provetta di RECK, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per
riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio.
- diluire l’enzima DNA polimerasi termostabile (non fornita nel prodotto) con il RECK alla
concentrazione finale desiderata. Preparare un volume di enzima diluito sufficiente per tutte le
reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un margine di sicurezza. L’enzima diluito
non può essere conservato.
Nota bene: Il volume di RECK aggiunto alla reazione di amplificazione con l’enzima diluito deve risultare un
decimo del volume finale della reazione di amplificazione stessa.
● Aggiungere a ciascuna provetta di amplificazione 5 µL di DNA polimerasi termostabile diluita nel RECK
(quando il volume finale di reazione è di 50 µL).
Nota bene: L'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di amplificazione può essere verificata visivamente
grazie alla colorazione blu del RECK.
Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di amplificazione.
Nota bene: Quando il RECK è utilizzato con sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni
di amplificazione (nested) deve essere utilizzato per la diluizione dell'enzima DNA polimerasi termostabile
sia nell'allestimento della prima amplificazione sia nell'allestimento della seconda amplificazione.
Allestimento della rivelazione elettroforetica su gel di agaroso
E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di estrazione ed amplificazione
allestendo un controllo negativo e un controllo positivo.
Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al
posto del campione biologico senza aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di
trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione.
Per il controllo positivo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al
posto del campione biologico e aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di
trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione.
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Revisione 02
Il prodotto specifico della reazione di amplificazione può essere rivelato ed identificato mediante
separazione elettroforetica nelle condizioni descritte di seguito:
- utilizzando un gel d'agaroso al 2% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TBE 1x (89 mM
TRIS, 89 mM acido borico, 2 mM EDTA disodico);
- utilizzando un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TAE 1x (40 mM
TRIS, 20 mM acido acetico, 1 mM EDTA disodico), come nei prodotti della serie
«ELECTROPHORESIS».
Nota bene: Il RECK elimina la necessità di preparare il prodotto della reazione di amplificazione mediante
l'aggiunta di un tampone di caricamento grazie alla sua densità e colorazione.
● Prelevare 15 µL di prodotto della reazione di amplificazione e trasferirli direttamente in un pozzetto del
gel di agaroso.
Il prodotto specifico della amplificazione del CPE-RNA ha dimensioni di circa 610 bp.
Nota bene: La corsa elettroforetica deve essere eseguita in modo da risolvere il prodotto specifico della
reazione di amplificazione del parametro in analisi dal prodotto specifico del CPE-RNA.
Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di rivelazione.
Nota bene: Il prodotto della reazione di amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi.
Confinare il prodotto della reazione di amplificazione residuo e gli scarti prodotti nella fase di rivelazione.
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A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta il risultato della
separazione elettroforetica di una sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione in cui sono
stati analizzati quattro campioni.
La reazione di amplificazione per il parametro in analisi presenta un prodotto specifico di 235 bp.
Controllo
Pesi
positivo
Molecolari parametro
in analisi
Controllo
positivo
RECK
Controllo
negativo
generale
Campione
positivo
Campione Campione
Campione
negativo
positivo* non idoneo
idoneo
Pozzetti
1380 bp
517 bp
459 bp
387 bp
610 bp
610 bp
610 bp
235 bp
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Interpretazione dei risultati
Prima di convalidare definitivamente un risultato "cDNA del parametro in analisi ASSENTE" per un
campione è necessario analizzare il risultato ottenuto con il RECK per questo campione.
I risultati delle reazioni relative ai campioni in analisi sono utilizzati per valutare la presenza del
cDNA del CPE-RNA come descritto nella tabella seguente:
cDNA del CPE-RNA®
Idoneità del campione
RECK
Risultato del saggio
Prodotto specifico ASSENTE
negativo
ASSENTE
non idoneo*
Prodotto specifico PRESENTE
positivo
PRESENTE
idoneo, vero negativo
Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di un campione in analisi, si sono
verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o nulla) o nella fase di
trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o nulla) o nella fase di estrazione (assenza di RNA o
presenza di inibitori) che possono causare risultati falsi negativi.
Il campione è NON IDONEO e l'analisi deve essere ripetuta a partire dall’estrazione di un nuovo
campione.
247 bp
235 bp
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235 bp
*Nota bene:
Quando nella reazione di amplificazione è presente il prodotto specifico per il parametro in
analisi, il prodotto specifico del CPE-RNA può risultare assente. Infatti la reazione di amplificazione del
CPE-RNA con il RECK, essendo calibrata per non interferire, può essere spostata dalla reazione di
amplificazione per il parametro in analisi. In questo caso il campione è comunque idoneo e il risultato
positivo dell'analisi è valido.
75 bp
65 bp
46 bp
* I campioni positivi per il parametro in analisi, pur essendo idonei, possono non presentare il
prodotto della reazione di amplificazione del CPE-RNA. Infatti la reazione di amplificazione del CPE-RNA
con il RECK può essere spostata dalla reazione di amplificazione del parametro in analisi.
E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della reazione di amplificazione
di un campione confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione di un marker di peso molecolare e
con la migrazione del prodotto della reazione di amplificazione del controllo positivo.
L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della reazione di amplificazione non ha alcun significato
per quanto riguarda la ricerca del cDNA del CPE-RNA nel campione.
Convalidazione generale della sessione di amplificazione
I risultati delle reazioni di controllo negativo e di controllo positivo sono utilizzati per convalidare la
sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione come descritto nelle tabelle seguenti:
Amplificazione del controllo negativo
Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione
Prodotto specifico ASSENTE
corretta
Amplificazione del controllo positivo
Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione
Prodotto specifico PRESENTE
corretta
Se il prodotto specifico di amplificazione è presente nella reazione di controllo negativo, si sono
verificati problemi di contaminazione nella fase di estrazione, di trascrizione inversa o di amplificazione che
possono causare risultati falsi positivi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di estrazione.
Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di controllo positivo, si sono
verificati problemi nella fase di estrazione (assenza di RNA o presenza di inibitori), nella fase di trascrizione
inversa (trascrizione inversa non efficiente o assente) o nella fase di amplificazione (amplificazione non
efficiente o assente) che possono causare risultati falsi negativi, il saggio deve essere ripetuto a partire
dalla fase di estrazione.
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PROBLEMI E SOLUZIONI
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LEGENDA DEI SIMBOLI
Prodotto specifico di amplificazione presente nella reazione di controllo negativo
Numero di catalogo.
Possibili cause
Soluzioni
Errore durante la dispensazione del CPE-RNA
Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il
contenuto della provetta, cambiare sempre puntale
Limiti di temperatura.
Errore durante la dispensazione dell'RNA Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il
estratto
contenuto della provetta, cambiare sempre puntale
Errore durante la dispensazione del cDNA
Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il
contenuto della provetta, cambiare sempre puntale
Codice del lotto.
Errore durante la dispensazione del prodotto Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il
di prima amplificazione
contenuto della provetta, cambiare sempre puntale
Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese).
Contaminazione dei reagenti preparati per la Eseguire con attenzione la ricostituzione, la diluizione e la
sessione
dispensazione dei reagenti, cambiare sempre puntale
Dispositivo medico diagnostico in vitro.
Contaminazione dell'acqua sterile o del RECK
Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile o di RECK
per la diluizione degli enzimi
Contaminazione degli stock di enzimi
Utilizzare nuove aliquote di enzimi
Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici
diagnostici in vitro.
Contaminazione dell'area per l'estrazione / Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare
allestimento delle reazioni di amplificazione
camici, sostituire provette e puntali in uso
Contenuto sufficiente per "N" test.
Prodotto specifico di amplificazione assente nella reazione di Positive Control
CONT
Possibili cause
Contenuto.
Soluzioni
Errore durante la dispensazione del CPE-RNA Eseguire con attenzione la dispensazione del CPE-RNA
Attenzione, consultare le istruzioni per l’uso.
Errore durante la dispensazione dell'RNA
Eseguire con attenzione la dispensazione dell'RNA
estratto
Fabbricante.
Errore durante la dispensazione del cDNA
Eseguire con attenzione la dispensazione del cDNA
Errore durante la dispensazione del prodotto Prelevare e dispensare con attenzione il prodotto di prima
di prima amplificazione
amplificazione nella seconda amplificazione
Errore durante la dispensazione del prodotto Caricare con attenzione il prodotto della reazione di
della reazione di amplificazione nel gel
amplificazione nel gel
Errore durante l'estrazione dell'RNA
Seguire con attenzione le istruzioni relative all'estrazione
dell'RNA.
Sistema di trascrizione inversa non adatto
Utilizzare un sistema con random primer.
Enzimi troppo diluiti o errore durante la Ricontrollare i calcoli di diluizione, seguire con attenzione la
dispensazione degli enzimi
dispensazione degli enzimi e mescolare adeguatamente
Degradazione del controllo positivo
Utilizzare una nuova aliquota di CPE-RNA
Errore di impostazione dei cicli termici
Controllare i cicli termici impostati sul thermal – cycler.
Temperatura di annealing superiore a 60°C
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