controllo interno di qualità dell`RNA estratto
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RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto ELIT ech Gro u p S.p .A. C.so Svizzera, 185 10149 Torino ITALY Uffici: Tel. +39-011 976 19 Fax +39-011 936 76 11 E. mail: [email protected] sito WEB: www.elitechgroup.com RK100 Nella prima fase il CPE-RNA, una soluzione stabilizzata di RNA genomico di fago MS2, è aggiunto dopo il campione al sistema di estrazione in modo da fornire il controllo interno. Il CPE-RNA è estratto e retrotrascritto insieme all'RNA del campione. Nella seconda fase il RECK, utilizzato come diluente dell'enzima Taq DNA polimerasi, è aggiunto alla reazione di amplificazione per il parametro in analisi. Il RECK fornisce gli oligonucleotidi di innesco per la coamplificazione della regione genomica che codifica per la proteina di assemblaggio del cDNA di fago MS2. La presenza del prodotto specifico della reazione di amplificazione del CPE-RNA indica la correttezza dell'esecuzione dell'estrazione, della trascrizione inversa e dell'amplificazione. RECK Il RECK permette inoltre di verificare visivamente l'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di amplificazione grazie alla sua colorazione e di caricare direttamente il prodotto della reazione di amplificazione su gel di agaroso grazie alle sue caratteristiche di densità e di colorazione. controllo interno di qualità dell'RNA estratto CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO -20°C RK100 Il RECK può essere utilizzato sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di una sola reazione di amplificazione (single round) sia con i sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested). Il RECK può essere utilizzato in reazioni di amplificazione il cui prodotto specifico sia una molecola di DNA di dimensioni inferiori a 500 bp. SOMMARIO USO PREVISTO PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO ALTRI PRODOTTI RICHIESTI MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO AVVERTENZE E PRECAUZIONI PROCEDURA PROBLEMI E SOLUZIONI LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 1 pag. 1 pag. 2 pag. 2 pag. 3 pag. 3 pag. 3 pag. 5 pag. 9 pag. 10 Il RECK può essere utilizzato in reazioni di amplificazione la cui temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco (annealing) sia compresa tra i 50°C e i 60°C . Il RECK è calibrato in modo da non modificare la sensibilità della reazione di amplificazione. Quando utilizzato con i prodotti della serie OligoMIX, la sensibilità della reazione di amplificazione rimane di circa 10 molecole di cDNA bersaglio nei 10 µL di prodotto della reazione di trascrizione inversa aggiunti alla provetta «monotest». Il prodotto consente di effettuare il controllo di idonetà di 50 estrazioni e di 100 reazioni di amplificazione totali (100 single round o 50 nested), controlli positivi e negativi compresi. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI USO PREVISTO Il prodotto trova impiego nel controllo di idoneità dell'RNA estratto da campioni biologici nei saggi di trascrizione inversa ed amplificazione. Il prodotto inoltre facilita le procedure analitiche nei saggi di trascrizione inversa ed amplificazione. L'identificazione dei campioni non idonei nei saggi di amplificazione per la ricerca di un cDNA bersaglio nel prodotto della reazione di trascrizione inversa ottenuto dall'RNA estratto da campioni biologici può essere utilizzata per l'accertamento dei campioni veri negativi. I reagenti per l'estrazione dell’RNA dai campioni da analizzare, per la trascrizione inversa dell’RNA, per l'amplificazione, per il controllo positivo di amplificazione e per la rivelazione del DNA amplificato non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l’impiego dei seguenti prodotti accessori prodotti da ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (codice EXTG01), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni non cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni; «EXTRAzol» (codice EXTR01), kit di estrazione dell’RNA da campioni cellulari e non cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni; «RT-kit plus» (codice BRK200), kit di trascrizione inversa dell’RNA con “random primer”; il kit consente di effettuare 50 reazioni; PRESENTAZIONE DEL PRODOTTO Il prodotto fornisce il controllo positivo di estrazione di RNA CPE-RNA e la miscela di controllo RECK, aliquotati in provette e pronti all'uso. La procedura prevede l'impiego del controllo positivo di estrazione di RNA nella fase di estrazione e della miscela di controllo nella fase di amplificazione. «DNA pol. 2U / µL» (codici ER40, ER140), enzima DNA polimerasi termostabile per l'amplificazione degli acidi nucleici; il prodotto ER40 consente di effettuare 25 reazioni, il prodotto ER140 consente di effettuare 100 reazioni. serie «OligoMIX Alert kit», kit di amplificazione del cDNA prodotto dalla trascrizione inversa dell’RNA estratto da campioni biologici; serie «Positive Control», controlli positivi di amplificazione di DNA plasmidico; serie «ELECTROPHORESIS» (codici EPH02 o EPH04), rivelazione del DNA amplificato per elettroforesi su gel d’agaroso; il kit consente di effettuare 64 estrazioni. SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 1/10 SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 2/10 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto RK100 CPE-RNA RECK Descrizione controllo positivo di estrazione di RNA miscela di controllo Quantità Composizione 4 x 150 µL ~3 fM RNA genomico MS2, BSA acetilata, Guanidina tiocianato, Sodio laurilsarcosinato, 100 mM 2-Mercaptoetanolo, Sodio citrato, Acido Cloridrico Poliacrilamide lineare 4 x 200 µL 0,1 µM oligonucleotidi TRIS-HCl, saccaroso, Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF RK100 Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto Etichettatura Xn - NOCIVO - MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso in lattice o simili. - Microcentrifuga da banco (12.000 - 14.000 RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µL, 2-20 µL, 5-50 µL). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile (thermal - cycler). Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121°C per un'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori. SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 3/10 Il reagente CPE-RNA presenta le seguenti frasi di rischio (R) e i seguenti consigli di prudenza (S): Xn - NOCIVO R 20/21/22-32. Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. A contatto con la pelle libera gas altamente tossico. S 20-23-37-50. Non mangiare né bere durante l'impiego. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Usare guanti adatti. Non mescolare con acidi. Il reagente RECK presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S 23-25. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 4/10 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto RK100 RK100 Allestimento della trascrizione inversa PROCEDURA Il sistema di trascrizione inversa deve utilizzare oligonucleotidi a sequenza casuale "random primer" come innesco della reazione di polimerizzazione del cDNA. Impostazione del ciclo termico Prima di iniziare la sessione è necessario: - verificare che i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione principale prevedano una temperatura di ibridazione degli oligonucleotidi di innesco (annealing) compresa tra i 50°C e i - impostare sul thermal - cycler i parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione 60°C ; principale. Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica ai parametri del ciclo termico della reazione di amplificazione. Campioni Il materiale da utilizzare con questo prodotto deve essere costituito dal prodotto della reazione di trascrizione inversa (cDNA) ottenuto dall’RNA estratto da campioni biologici. Il sistema di trascrizione inversa dell'RNA deve utilizzare i "random primer" per l'innesco della reazione di polimerizzazione. Quando si impiegano campioni biologici cellulari, per esempio sangue intero, si consiglia di verificare la quantità di RNA totale estratto che è immessa nella reazione di trascrizione inversa, per evitare la comparsa di prodotti aspecifici e possibili fenomeni di inibizione nella successiva reazione di amplificazione. La concentrazione finale massima dell’RNA totale nella reazione di trascrizione inversa dovrebbe essere di circa 40 ng / µL. Per esempio, la quantità massima di RNA totale che può essere immessa in una reazione di trascrizione inversa con volume finale di 25 µL è di circa 1 µg. Il sistema di estrazione dell'RNA dal campione di partenza deve fornire RNA idoneo all'uso in reazioni di trascrizione inversa ed amplificazione. Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti. Controlli di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione Allestimento dell'estrazione Prima di iniziare la sessione è necessario: - scongelare una provetta di CPE-RNA, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio. Nota bene: Il CPE-RNA deve essere utilizzato nella prima fase della procedura di estrazione. ● Dopo l'aggiunta del campione alla soluzione lisante, aggiungere 10 µL di CPE-RNA a ciascuna provetta di estrazione e mescolare per inversione. Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di estrazione. 28/05/13 Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di retrotrascrizione. Allestimento dell'amplificazione Prima di iniziare la sessione è necessario: - scongelare una provetta di RECK, mescolare per inversione, centrifugare per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio. - diluire l’enzima DNA polimerasi termostabile (non fornita nel prodotto) con il RECK alla concentrazione finale desiderata. Preparare un volume di enzima diluito sufficiente per tutte le reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un margine di sicurezza. L’enzima diluito non può essere conservato. Nota bene: Il volume di RECK aggiunto alla reazione di amplificazione con l’enzima diluito deve risultare un decimo del volume finale della reazione di amplificazione stessa. ● Aggiungere a ciascuna provetta di amplificazione 5 µL di DNA polimerasi termostabile diluita nel RECK (quando il volume finale di reazione è di 50 µL). Nota bene: L'aggiunta dell'enzima diluito alla miscela di amplificazione può essere verificata visivamente grazie alla colorazione blu del RECK. Nota bene: Non è richiesta alcuna modifica al protocollo di amplificazione. Nota bene: Quando il RECK è utilizzato con sistemi che prevedono l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested) deve essere utilizzato per la diluizione dell'enzima DNA polimerasi termostabile sia nell'allestimento della prima amplificazione sia nell'allestimento della seconda amplificazione. Allestimento della rivelazione elettroforetica su gel di agaroso E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di estrazione ed amplificazione allestendo un controllo negativo e un controllo positivo. Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al posto del campione biologico senza aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione. Per il controllo positivo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da estrarre al posto del campione biologico e aggiungere il CPE-RNA. L'estratto sarà poi utilizzato nella reazione di trascrizione inversa e nella reazione di amplificazione. SCH mRK100 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto Revisione 02 Il prodotto specifico della reazione di amplificazione può essere rivelato ed identificato mediante separazione elettroforetica nelle condizioni descritte di seguito: - utilizzando un gel d'agaroso al 2% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TBE 1x (89 mM TRIS, 89 mM acido borico, 2 mM EDTA disodico); - utilizzando un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TAE 1x (40 mM TRIS, 20 mM acido acetico, 1 mM EDTA disodico), come nei prodotti della serie «ELECTROPHORESIS». Nota bene: Il RECK elimina la necessità di preparare il prodotto della reazione di amplificazione mediante l'aggiunta di un tampone di caricamento grazie alla sua densità e colorazione. ● Prelevare 15 µL di prodotto della reazione di amplificazione e trasferirli direttamente in un pozzetto del gel di agaroso. Il prodotto specifico della amplificazione del CPE-RNA ha dimensioni di circa 610 bp. Nota bene: La corsa elettroforetica deve essere eseguita in modo da risolvere il prodotto specifico della reazione di amplificazione del parametro in analisi dal prodotto specifico del CPE-RNA. Nota bene: Non è richiesta alcuna altra modifica al protocollo di rivelazione. Nota bene: Il prodotto della reazione di amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare il prodotto della reazione di amplificazione residuo e gli scarti prodotti nella fase di rivelazione. Pag. 5/10 SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 6/10 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto RK100 A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta il risultato della separazione elettroforetica di una sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione in cui sono stati analizzati quattro campioni. La reazione di amplificazione per il parametro in analisi presenta un prodotto specifico di 235 bp. Controllo Pesi positivo Molecolari parametro in analisi Controllo positivo RECK Controllo negativo generale Campione positivo Campione Campione Campione negativo positivo* non idoneo idoneo Pozzetti 1380 bp 517 bp 459 bp 387 bp 610 bp 610 bp 610 bp 235 bp RK100 Interpretazione dei risultati Prima di convalidare definitivamente un risultato "cDNA del parametro in analisi ASSENTE" per un campione è necessario analizzare il risultato ottenuto con il RECK per questo campione. I risultati delle reazioni relative ai campioni in analisi sono utilizzati per valutare la presenza del cDNA del CPE-RNA come descritto nella tabella seguente: cDNA del CPE-RNA® Idoneità del campione RECK Risultato del saggio Prodotto specifico ASSENTE negativo ASSENTE non idoneo* Prodotto specifico PRESENTE positivo PRESENTE idoneo, vero negativo Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di un campione in analisi, si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o nulla) o nella fase di trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o nulla) o nella fase di estrazione (assenza di RNA o presenza di inibitori) che possono causare risultati falsi negativi. Il campione è NON IDONEO e l'analisi deve essere ripetuta a partire dall’estrazione di un nuovo campione. 247 bp 235 bp RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto 235 bp *Nota bene: Quando nella reazione di amplificazione è presente il prodotto specifico per il parametro in analisi, il prodotto specifico del CPE-RNA può risultare assente. Infatti la reazione di amplificazione del CPE-RNA con il RECK, essendo calibrata per non interferire, può essere spostata dalla reazione di amplificazione per il parametro in analisi. In questo caso il campione è comunque idoneo e il risultato positivo dell'analisi è valido. 75 bp 65 bp 46 bp * I campioni positivi per il parametro in analisi, pur essendo idonei, possono non presentare il prodotto della reazione di amplificazione del CPE-RNA. Infatti la reazione di amplificazione del CPE-RNA con il RECK può essere spostata dalla reazione di amplificazione del parametro in analisi. E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della reazione di amplificazione di un campione confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione di un marker di peso molecolare e con la migrazione del prodotto della reazione di amplificazione del controllo positivo. L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della reazione di amplificazione non ha alcun significato per quanto riguarda la ricerca del cDNA del CPE-RNA nel campione. Convalidazione generale della sessione di amplificazione I risultati delle reazioni di controllo negativo e di controllo positivo sono utilizzati per convalidare la sessione di estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione come descritto nelle tabelle seguenti: Amplificazione del controllo negativo Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione Prodotto specifico ASSENTE corretta Amplificazione del controllo positivo Estrazione, trascrizione inversa ed amplificazione Prodotto specifico PRESENTE corretta Se il prodotto specifico di amplificazione è presente nella reazione di controllo negativo, si sono verificati problemi di contaminazione nella fase di estrazione, di trascrizione inversa o di amplificazione che possono causare risultati falsi positivi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di estrazione. Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di controllo positivo, si sono verificati problemi nella fase di estrazione (assenza di RNA o presenza di inibitori), nella fase di trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o assente) o nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o assente) che possono causare risultati falsi negativi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di estrazione. SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 7/10 SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 8/10 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto RK100 RECK controllo interno di qualità dell'RNA estratto PROBLEMI E SOLUZIONI RK100 LEGENDA DEI SIMBOLI Prodotto specifico di amplificazione presente nella reazione di controllo negativo Numero di catalogo. Possibili cause Soluzioni Errore durante la dispensazione del CPE-RNA Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Limiti di temperatura. Errore durante la dispensazione dell'RNA Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il estratto contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Errore durante la dispensazione del cDNA Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Codice del lotto. Errore durante la dispensazione del prodotto Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il di prima amplificazione contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Contaminazione dei reagenti preparati per la Eseguire con attenzione la ricostituzione, la diluizione e la sessione dispensazione dei reagenti, cambiare sempre puntale Dispositivo medico diagnostico in vitro. Contaminazione dell'acqua sterile o del RECK Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile o di RECK per la diluizione degli enzimi Contaminazione degli stock di enzimi Utilizzare nuove aliquote di enzimi Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contaminazione dell'area per l'estrazione / Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare allestimento delle reazioni di amplificazione camici, sostituire provette e puntali in uso Contenuto sufficiente per "N" test. Prodotto specifico di amplificazione assente nella reazione di Positive Control CONT Possibili cause Contenuto. Soluzioni Errore durante la dispensazione del CPE-RNA Eseguire con attenzione la dispensazione del CPE-RNA Attenzione, consultare le istruzioni per l’uso. Errore durante la dispensazione dell'RNA Eseguire con attenzione la dispensazione dell'RNA estratto Fabbricante. Errore durante la dispensazione del cDNA Eseguire con attenzione la dispensazione del cDNA Errore durante la dispensazione del prodotto Prelevare e dispensare con attenzione il prodotto di prima di prima amplificazione amplificazione nella seconda amplificazione Errore durante la dispensazione del prodotto Caricare con attenzione il prodotto della reazione di della reazione di amplificazione nel gel amplificazione nel gel Errore durante l'estrazione dell'RNA Seguire con attenzione le istruzioni relative all'estrazione dell'RNA. Sistema di trascrizione inversa non adatto Utilizzare un sistema con random primer. Enzimi troppo diluiti o errore durante la Ricontrollare i calcoli di diluizione, seguire con attenzione la dispensazione degli enzimi dispensazione degli enzimi e mescolare adeguatamente Degradazione del controllo positivo Utilizzare una nuova aliquota di CPE-RNA Errore di impostazione dei cicli termici Controllare i cicli termici impostati sul thermal – cycler. Temperatura di annealing superiore a 60°C SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 9/10 SCH mRK100 28/05/13 Revisione 02 Pag. 10/10
