Dati di Validazione ring-test
Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis
Febbraio 2014
1
1 Metodi
I metodi scelti per la validazione dei protocolli sono i seguenti:
Tipo di saggio
Metodi validati
Componente biologica
riconosciuta
Selezione
preliminare
Selezione
preliminare e
identificazione
Selezione
preliminare e
identificazione
Crescita sui substrati YPGA, Dhavanthari,
mSCM
Morfologia
Immunofluorescenza (IF)
Epitopi o determinanti antigenici
PCR
Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al.
(1995
Acido nucleico (DNA)
Si riportano di seguito le metodi scelte per il protocollo utilizzato per l'esecuzione del ring-test: procedure (A)
e (B)
(A)
Tipo di saggio
Selezione
preliminare
Selezione
preliminare e
identificazione
Metodi validati
Componente biologica
riconosciuta
Crescita sui substrati SCM e CMM1
Morfologia
PCR
(Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al.
(1995)
Acido nucleico (DNA)
(B)
Tipo di saggio
Selezione
preliminare delle
colonie
Selezione
preliminare e
identificazione
Selezione
preliminare e
identificazione
Metodi validati
Componente biologica
riconosciuta
Crescita sui substrati SCM e CMM1 di colonie
da biosaggio
Morfologia
Immunofluorescenza (IF)
Epitopi o determinanti antigenici
PCR
Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al.
(1995)
Acido nucleico (DNA)
Saggi biologici
Sviluppo di sintomi specifici
2
2 Campioni per la validazione
2.1 Campioni utilizzati per l'attività di validazione del GdL
I campioni analizzati consistono in colture pure di batteri “target”, colture pure di batteri “non
target”, estratti di seme di pomodoro contaminati sperimentalmente con sospensioni batteriche a
concentrazione nota e non contaminati (sani), campioni di 2000 semi contaminati con 1,3,5,10 semi
infettati con un ceppo di Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (PVCT 156.1.1).
-
A. 12 isolati ‘target’ (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) provenienti da diversi areali
geografici:
“ target”
Provenienza/ospite
NCPPB 2979T
Ungheria
Pomodoro
1977
NCPPB
ISPaVe 1045
Sicilia
Pomodoro
---
ISPaVe
NCPPB 382
UK
Pomodoro
1956
NCPPB
PVCT 150.8
Italia (Rg)
Pomodoro
2005
DISTEF
PVCT 156.1.1
Italia (Rg)
Pomodoro
2006
DISTEF
PVCT 161.6.1
Italia (Rg)
Pomodoro
2007
DISTEF
PVCT 163.2.3
Italia (Rg)
Pomodoro
2007
DISTEF
PVCT 172.1.1
Italia (Rg)
Pomodoro
2008
DISTEF
PVCT 317.4
Emilia Romagna
Pomodoro
2004
A. Calzolari
PVCT 342
Emilia Romagna
Pomodoro
1992
A. Calzolari
PVCT 171.1.1
Italia (Rg)
Pomodoro
2006
DISTEF
PVCT 07265N1
Battipaglia(Sa)
Pomodoro
n.r.
L. Sigillo
-
B. 11 isolati ‘non target’ rappresentati da isolati batterici appartenenti a differenti generi:
“non target”
Provenienza
C. michiganensis subsp.
nebraskenis
C. michiganensis subsp.
tessellarius
C. michiganensis subsp.
sepedonicus
Pseudomonas corrugata
NCPPB2581 T
Stati Uniti
Zea mays
1974
NCPPB
NCPPB3664 T
Stati Uniti
Triticum
aestivum
1990
NCPPB
Patata
1968
NCPPB
CFBP5454
Repubblica
Ceca
Italia
Pomodoro
1991
DISTEF
P. mediterranea
CFBP5447
Italia
Pomodoro
1991
DISTEF
P. syringae pv tomato
PVCT28.3.1
Italia
Pomodoro
Ralstonia solanacearum
NCPPB 325
Stati Uniti
Pomodoro
1953
NCPPB
Non identificato
184.2
Italia
Semi pomodoro
2008
DISTEF
Non identificato
184.3
Italia
Semi pomodoro
2008
DISTEF
Non identificato
184.4
Italia
Semi pomodoro
2008
DISTEF
Non identificato
184.5
Italia
Semi pomodoro
2008
DISTEF
NCPPB 2140
3
DISTEF
-
C. 25 campioni costituiti da estratti di semi di pomodoro o semi di pomodoro contaminati
sperimentalmente:
Quantità
15
Matrice
Estratto di seme di
pomodoro
Tipologia del campione
Inoculati sperimentalmente, da 107 a 102 ufc/ml
4
Semi di pomodoro
Quattro campioni da 2000 semi rispettivamente contaminati
con 1, 3, 5, 10 semi infetti
6
Estratto di di seme di
pomodoro
Non contaminati (“sani”)
2.2 Campioni utilizzati per il ring-test
Procedura A
- 11 campioni costituiti da 5000 semi contaminati rispettivamente con 1,3,5, semi come indicato in
tabella
Campione n.
Tipologia del campione
1
5:5000
2
1:5000
3
10:5000 (controllo positivo)
4
5000 semi (non infetti = sano)
5
5:5000
6
3:5000
7
5000 semi (non infetti = sano)
8
5000 semi contaminati con Pseudomonas corrugata (5:5000)
9
1:5000
10
5000 semi contaminati con Pseudomonas corrugata (5:5000)
11
3:5000
4
Procedura B
- 11 campioni costituiti da 2000 semi contaminati rispettivamente con 1, 2, 3 semi come indicato in
tabella
Campione n.
Tipologia del campione
1
3:2000
2
2000 semi (non infetti = sano)
3
2:2000
4
5:2000 (controllo positivo)
5
2:2000
6
1:2000
7
1:2000
2000 semi contaminati con Pseudomonas corrugata
(5:2000)
3:2000
8
9
10
11
2000 semi (non infetti = sano))
2000 semi contaminati con Pseudomonas corrugata
(5:2000)
3 Valori di validazione attività GdL
3.1 Isolamento in coltura pura di colonie su substrati nutritivi / selettivi agarizzati
Isolamento in coltura pura di Cmm da estratto di semi di pomodoro:
Valori %
Sensibilità diagnostica
Accuratezza
YPGA
74,5
80
Dhavanthari
44
57
3.2 Metodo sierologico IFAS
IFAS da isolati batterici target e non target (paragrafo 3.2.1., tabelle A e B)
Valori %
Inclusività
Esclusività
IFAS
100
82
5
mSCM
64
71
IFAS da estratto di semi contaminati sperimentalmente (paragrafo 3.2.1., tabella C) come saggio
preliminare:
Valori %
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza
IFAS
74
100
80
I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando:
Kit per immunofluorescenza: Neogen Phytodiagnostics (1113-18) Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis, Fluoriscan IF Kit;
Vetrini per immunofluorescenza:
vetrini multipli per microscopio, diametro pozzetti 6 mm Menzel-Gläser Diagnostica e
Thermo Scientific cod. X1XER308B#MNZ;
vetrini copri oggetto 24 x 60 mm Prestigi di Vemi S.r.l.;
Microscopio a fluorescenza: Zeiss, Axioskop 2 plus - HAL 100 e Nikon Eclipse 80i.
3.3 Metodo molecolare PCR
(Pastrick and Rainey ,1999; Dreier et al.,1995)
PCR da isolati batterici target e non target (paragrafo 3.2.1., tabelle A e B)
Valori %
Inclusività
Esclusività
Pastrick and Rainey,
1999
100
79
Pastrick and Rainey,
1999**
100
100
Dreier et al.,1995
92
95,5
* *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA polymerase tipologia 'hot-start' (ImmolaseTM Hot
Start DNA Polymerase)
PCR da estratti di semi contaminati sperimentalmente (paragrafo 3.2.1., tabella C) come saggio
preliminare
Valori %
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza
Pastrick and Rainey, 1999
56
100
66
Dreier et al.,1995
46,5
100
59
I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando:
Kit per estrazione del DNA: DNeasy® Plant Mini Kit, QIAGEN (Cat. No. 69104);
Kit per amplificazione del DNA: GoTaq® Flexi DNA Polymerase kit, Promega (Cat.No. M8305),
comprensivo di buffer, MgCl2 e Taq DNA polimerasi; * Polimerasi di tipologia 'hot start':
Immolase TM DNA polymerasi (Bioline)
6
dNTPs: dNTP Mix Promega (Cat. No. U1515);
Termociclatore: Gene Amp ® PCR System 9700 Applied Biosystems e Gene Amp ® PCR System
2400.
Soglia di sensibilità analitica
Il calcolo della sensibilità analitica è stato effettuato a partire da un estratto di semi di pomodoro
contaminato con concentrazioni calibrate del patogeno a partire da 107 ufc/ml a 100 ufc/ml in tre
ripetizioni e da campioni di 2000 semi contaminati rispettivamente con 1, 3, 5, 10 semi infetti. I
valori soglia (espressi in ufc/ml) di sensibilità assoluta vengono di seguito riportati per ciascun
metodo.
ufc/ml
Valore soglia
ufc/ml
Valore soglia
Isolamento su
YPGA
103
3:2000
IF
103
3:2000
Isolamento su
Dhavanthari
106
3:2000
Isolamento su mSCM
PCR Pastrick and
Rainey, 1999
105
1:2000
PCR Dreier et al.,1995
104
5:2000
105
1:2000
Non è stato calcolato il valore soglia di sensibilità analitica applicando la PCR Pastrick and Rainey,
1999 con l'enzima ; Immolase TM DNA polymerase (Bioline)
Specificità analitica
La specificità analitica è stata valutata a partire dalla collezione di ceppi batterici ‘target’ e ‘non
target’ (paragrafo 3.2.1, tabelle A e B) tenendo conto dei risultati falsi positivi.
L’IFAS ha prodotto due risultati debolmente positivi con i seguenti ceppi batterici 'non-target':
NCPPB 2581
NCPPB 2140
C. m. subsp. nebraskensis
C. m. subsp. sepedonicus
e tre risultati debolmente positivi con il seguente ceppo batterico ‘non target’:
NCPPB 3664
C. m. subsp .. tesselarius
7
La PCR Pastrick and Rainey (1999) ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi
batterici ‘non target’:
NCPPB 2581
NCPPB 2140
NCPPB 3664
PVCT 184.6
C. m. subsp. nebraskensis
C. m. subsp. sepedonicus
C. m. subsp. tesselarius
Contaminante
Tuttavia, la PCR Pastrick and Rainey (1999) con l'utilizzo dell'enzima ImmolaseTM DNA
Polymerase, di tipologia 'hot-start', non ha prodotto risultati falsi negativi o falsi positivi.
La PCR secondo Dreier et al. (1995) ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi
batterici ‘non target’:
NCPPB 2581
C. m. subsp. nebraskensis
ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi batterici ‘non target’:
4 Valori di validazione procedura A
4.1 Isolamento in coltura pura di colonie su substrati selettivi agarizzati CMM1 e
SCM
L'isolamento in coltura pura di Cmm dall'estratto ottenuto dai campioni di 5000 semi riportati nel
paragrafo 3.2.2. (procedura A) sui terreni CMM1 e SCM non ha permesso l'individuazione di
colonie Cmm-like , con esito pertantonegativo per tutti i laboratori partecipanti al ring-test.
4.2 Metodo molecolare PCR
(Pastrick and Rainey ,1999; Dreier et al.,1995)
PCR da estratto di 5000 semi contaminati sperimentalmente (paragrafo 3.2.2., tabella procedura A)
come saggio preliminare
Pastrick and
Pastrick and
Dreier et al.,1995
Rainey, 1999
Rainey, 1999**
81
Sensibilità diagnostica
3
62
86
Specificità diagnostica
100
92
64
Accuratezza relativa
38
72
Concordanza
99
83
78
* *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA polymerase tipologia 'hot-start' (ImmolaseTM DNA
Polymerase)
Valori %
8
5 Valori di validazione procedura B
5.1 Metodo sierologico IFAS
IFAS da matrice vegetale come saggio preliminare
Valori %
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza
Concordanza
IFAS
52
59
54,5
60
I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando:
Kit per immunofluorescenza: Neogen Phytodiagnostics (1113-18) Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis, Fluoriscan IF Kit;
Vetrini per immunofluorescenza:
vetrini multipli per microscopio, diametro pozzetti 6 mm Menzel-Gläser Diagnostica e
Thermo Scientific cod. X1XER308B#MNZ;
vetrini copri oggetto 24 x 60 mm Prestigi di Vemi S.r.l.;
Microscopio a fluorescenza: Zeiss, Axioskop 2 plus - HAL 100 e Nikon Eclipse 80i.
5.2 Metodo molecolare PCR
(Pastrick and Rainey,1999; Dreier et al.,1995)
PCR da estratto di 5000 semi contaminati sperimentalmente (paragrafo 3.2.2., tabella procedura A)
come saggio preliminare
Valori %
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza relativa
Concordanza
Pastrick and
Rainey, 1999**
84
92
87
86
Dreier et al.,1995
17
89
43
85
* *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA Taq polymerase tipologia 'Hot-start' (ImmolaseTM
Hot Start DNA Polymerase)
Non sono stati riportati i valori relativi alla PCR-Pastrick and Rainey (1999) con utilizzo di una
polimerasi di tipologia diversa dalla 'hot start' in quanto tutti i laboratori hanno conseguito risultati
negativi.
I risultati ottenuti nei paragrafi 3.3, 4.2, 5.2 evidenziano la necessità di utilizzare una polimerasi
'hot-start' per la reazione di PCR come indicato nel lavoro originale di Pastrick and Rainey (1999).
Infatti, l'utilizzo di DNA polimerasi diverse possono portare all'ottenimento di numerosi falsi
negativi, come indicato dal bassissimo valore di sensibilità ottenuto e dai valori inferiori di
specificità e sensibilità ottenuti con sia con metodo di PCR Dreier et al., 1995 che con Pastrick and
Rainey, 1999 in cui sia utilizzato un'enzima che non preveda un passaggio iniziale 'hot-start'. L'uso
9
della 'ImmolaseTM Hot Start DNA Polymerase (BiolineTM) ha consentito l'individuazione di molti
campioni, compresi quelli a dose minima di contaminazione (es. 1:5000); inoltre, anche i valori di
specificità analitica sono stati ottimali in quanto tutti gli isolati batterici 'target' sono stati
correttamente identificati e i 'non target' non hanno prodotto falsi positivi. Tutti i laboratori hanno
invece conseguito risultati negativi (eccetto due campioni da parte di un solo laboratorio)
applicando il metodo di Pastrick and Rainey (1999) con una polimerasi di altra tipologia rispetto
alla 'hot-start'.
Infine, non si garantisce un risultato analogo con l'utilizzo di Taq polimerasi di analoga tipologia,
ma di differente marchio commerciale.
5.3 Biosaggio
L'inoculazione degli estratti di seme su piantine di pomodoro non ha dato esito positivo ovvero non
sono stati visualizzati sintomi dopo 20 giorni dall'inoculazione nè è stato isolato il patogeno sui
campioni massali costituiti da porzioni di fusticino della pianta inoculata uniti assieme come unico
campione.
10
