Metabolismo del glutamm ato in fettine di corteccia renale di coniglio MARIA ANTONIE'ITA BUSELLU e FRANCE SCO POCCHIARI Laboratori di Chimica biologica Centro Internazionale di Chimica Microbiologica È stato studiato il destino dell'acido l-glutammico uniformem ente marcato 14 C in fettine di cortecci a r enale di coniglio u sando una t ecnica qu antitativa di radiocromatografìa su carta. L 'acido glutammico viene trasformato in C0 2 , glutam mina, alanina, serina, glicina, acido asp artico e glucosio. La presenza d ello ione Ca ++ n el m ezzo di incubazione stimola la formazione di glucosio d a glutammato. L'aggiunta eli glucosio non radioattivo com e cosub strato, m entre lascia inalterata la produzione di C02 e d egli amminoacidi radioattivi, stimola enormem ente la formazione di glucosio marcato, sia in assenza ch e in presen za d ello ione Ca++ . Riassunto. - Summary. (Glutamate metabolism in rabbit kidney cortex slices). The fate of 14 C gluta m ate in r abbit kidney cortex slices was followed quantitativ ely b y m ean s of the previousl y d escribed automatic scanning t echnique of paper r adiochromatogra m s (BELOFF-CHAIN et al. , 1955), in the presen ce and absence of non-radioactive glucose. The gluta mate disappearing from the m edium aft er 60 min of incubation was accounted for as C0 2 , glutamine, alanine, serine, glycine, aspar t at e and glucose. In a greement with the findings of KREBS et al. (1963), the presence of calcium in the incub ation m edium incr eased the production of radioactive glu cose from glutamat e (Tabl e l) . The presencc of non-radioactive glucose as cosubstrate considerably increased the conversion of glutamate into glu cose (Fig . l) both in the ahsen ce an d in the presen ce of Ca ++ ions. I ' TRODUZIONE È noto ch e in fettine di corteccia r en ale l'acido glutammico v ien e osstd ato (KREBS, 1935) e trasformato in glucosio (RussELL & WILHELMI, 1941 ; KREBS et al., 1963). La glucon eogen esi d ' altra parte è influenzata da v ari fattori, quali la dieta (KREBS et al. , 1963), lo stato dell'animale (TENG, 1954 ; FLINN, LEBOE UF & CAHILL, Jr., 1961) c la composizione ionica del m ezzo di incubazione del t essuto (KREBS et al. , 1963) . A nn. I st. Super. Sanità (1965) 1, 548·6b4. È semh cromatografì Laboratorio d ell'acido gh cosio su tal( Prodotti . marcato uc Bretagna). Preparm nutriti ad lib l'esp erim ento i r eni rapida di Stadie Rif di esp erienze W arburg, cm su ghiaccio . mM ; NaCl 9f & H ENDERSOJ concentrazion di 5,6 mM. f' di carta da fi vasch ette ven a 370 C, e gass di t essuto ven HENSELEIT (l' zione, le vasch • Trattame1. le misure della nizzato con al CHAIN et al. , Whatman l. J m ente cromat• guite n ei solvo l) buta 2) fenol In tali sol· glucosio. La ' croma tografa n• BUSELLU E POCCBlARI teccia renale 549 È sembrato pertanto inter essante studiar e con la t ecnica della radiocromatografia quantitativa su carta precedentem ente sviluppata in questo Laboratorio {BELOFF-CHAIN et al., 1955) il quadro m etabolico completo dell'acido glutammico nella corteccia r enale di coniglio e l'influenza del glucosio su tale metabolismo. PARTE SPERIMENTALE Prodotti. - Acido l-glutammico (sale monoammonico) uniformem ente marcato 14 C è stato ottenuto dal Radiochemical Centre, Amersham (Gran Bretagna). ~lutammico uni~lio usando una do glut ammico 1.a, acido aspartbazione stimola sio non radioat~ di co2 e degli mc di glucosio 1rtex slices). followed quanscanning tech55), in t h e prelat e disappearted for as C0 2 , In agr eem ent ,um in t he incutcose from gluas cosubstrat e ;lucose (Fig. l) n eo viene ossiILHELMI, 1941 ; en zata da vari e (TENG, 1954 ; :1ica del m ezzo (1965) 1, 54.8·51>4. Preparazione del tessuto ed incubazione. - Sono stati u sati conigli adulti nut riti ad libitum essenzialmente con crusca e aven a fino a 2 ore prima dell'esperimento. E ssi sono stati uccisi con un colpo alla nuca, dissanguati ed i reni rapidamente tolti, decapsulati e m essi su ghiaccio. Con l'affettatore di Stadie Riggs sono state eseguite fettine di corteccia r enale. In una serie di esperien ze circa 200 m g di t essuto venivano m essi in una v asch etta di Warburg, contenente 3 ml di un tampone di fosfato ' a pH 7,4 r affreddato su ghiaccio. Il tampone aveva la segu ente composizione : Na 2 HPO, 17,5 mM; NaCl 98 mM; KCI 27 mM ; MgS0 4 1,2 mM; KH 2PO, 4 mM (ELLIOTT & HENDERSON, 1948); l'acido glut ammico uniformem ente marcato 14C era alla concentrazione di 6,7 mM. Il glucosio, quando presente, er a alla concentrazione di 5,6 mM. Nel pozzetto centrale della vasch etta veruva posto un p ezzetto di carta da filtro arrotolato ed imbevut o con 0,2 mi di NaOH al 30 %· Le vasch ette venivano connesse ai manometri, post e in un b agno t ermost at ato a 37° C, e gassate con 0 2 p er 5 min. In un'altra serie di esperienze circa 100 m g di t essuto venivano incubati in 3 ml del tampone bicarbonato di KREBS & HENSELEIT (1932) con 0 2 + C0 2 (95 : 5) com e fase gassosa. Dopo l h di incubazion e, le vasch ette, tolte dal bagno, venivano immediatamente pos te su ghiacc;o. Trattamento del tessuto dopo incubazione, e preparazione dei campioni p er le misure della radioattività. - Dopo l'incubazione il t essuto veniva om ogenizzato con alcool etilico al 60 % come precedentemente descritto (BELOFFCHAIN et al. , 1955) e l'estratto alcoolico ottenuto cromatogr afato su carta Whatman l . Aliquote dei m eni eli incub<~ zione venivano anche esse direttam ente cromatografate su carta. L e cromat ografie bidimensionali erano eseguite nei solventi : l) butanolo secondario : acido formico : acqua (75 : 15 : 15) ; 2) fenolo : acqua: ammoniaca concentrata d = 0,91 (80 : 20 : l) In tali solventi non si separavano in m odo netto la glicina, la serina ed il glucosio . La quantità di glucosio presente veniva pertanto determinat a cromatogr afando i campioni in modo monodimensionale in butanolo t erA nn. I st. Super. Sanità (1965) 1, 548·554 . 550 ESPERIENZE E RICERCHE + ziario : acqua (80 : 20) 4 g di acido picrico; in questo solvente il glucosio viene separato dagli ammino-acidi. Sottraendo la quantità di radioattività del glucosio così determinata dalla macchia separata nella cromatografia bidimensionale, contenente glucosio, glicina e serina, è stata ricavata la quantità di glicina e serina. Per conoscere il rapporto in cui questi due metaboliti sono presenti, è stata eseguita una analisi cromatografica con l'analizzatore per amminoacidi Beckman Spinco secondo la tecnica di MooRE, SPAKMAN & STEIN (1958). L e radiocromatografì.e su carta venivano esplorate con l'apparecchiatura descritta da FRANK et al (1959). n r esiduo insolubile del tessuto dopo preparazione dell'estratto alcoolico era lavato due volte con lO ml di H 20 ogni volta, e trasferito su scodellino di alluminio. La radioattività veniva misurata con un contatore Geiger. La C0 2 raccolta su NaOH durante il periodo di incubazione, v eniva precipitata come BaC0 3 e la sua radioattività determinata con un contatore Geiger (BELOFF CHAIN et al., 1955). RISULTATI della glicim dell'estratto nella propo: Tabella l s l'estratto. l HENSELEIT, amminoacid formazione sia perchè ~ nel cromato glucosio d et sia perchè h spondente a Risultati , mg di tessuto, Consumo di ossigeno e produzione di 14 C0 2 • -Nelle condizioni sperimentali usate, il consumo di ossigeno da parte di fettine di corteccia renale di coniglio in presenza di glutammato è lineare p er 60 minuti di incubazione ed ammonta a circa 110 fL moli/g di tessuto, peso umido/h . Il glucosio aggiunto al mezzo di incubazione non ha alcun effetto su tale consumo. La quantità di 14 C0 2 prodotta da glutammato 14C è di circa 90 fL moli/g di tessuto, p eso umido per ora, due volte superiore a quella ottenuta incubando nelle stesse condizioni fettine di corteccia cerebrale di ratto (SELLINGER et al. , 1962). A differenza di quanto precedentemente osservato nel tessuto cerebrale, n elle fettine di corteccia renale il glucosio non ha alcun effetto sulla produzione di 14 C0 2 da glutammato radioattivo. sfato di ELLIC (1932). Concen tività totale : presente : 0,1 ' Trasformazione dell'acido glutammico in amminoacidi. - I principali amminoacidi formati dall'acido glutammico uniformemente marcato uc sono in ordine di quantità d ecrescenti : glutammina, alanina, serina, glicina ed acido aspartico (Tab. l). La glutammina, la serina, la glicina sono presenti quasi esclusivamente nel mezzo di incubazione, ed i valori riportati nelle tabelle si riferiscono alle misure effettuate nei cromatogrammi su carta dei mezzi di incubazione. La radioattività corrispondente a queste sostanze presenti nei cromatogrammi degli estratti alcoolici non è stata considerata perch è in quantità troppo piccola per una misura significativa ; mediante cromatografia su r esina a scambio ionico si è potuto separare la glicina dalla serina e stabilire che la quantità di serina formata è quattro volte quella glutammin a .dnn. I st. Super. Sanitd (1965) 1 , 548·554. ID~ZZO DJ PRODOTTO ZIO NE: acido asparl serina + gli· aJanina glucosio acido glutan. C02 ••• • 0 2 f.t moli/ 2! umido/h . • Dilferen: UUSELLU E POCCH!Ant ttc il glucosio radioattiv ità ~romatografìa ricavata la sti due m etacon l'analizdi MooRE, tivano esplot ;tratto alcooito su scodelatorc Geiger. veniva preciun contatore 55 1 d ella glicina. L 'acido aspartico è stato det ermin ato solo n ei crom atogrammi dell'estratto d el t ess uto ; l'alanina è p resente sia n el m ezzo ch e n ell'estratto n ella proporzione di circa 2 : l. Il valore dell'acido glutammico dato nella Ta bella l si riferisce ovviamente solo all'acido gl utammico presente nell'estratto. La presen za dello ione calcio nel m ezzo di inc uba zione (KR EBS & H E SEL E I T, 1932) non sembra a vere alcun effetto sulla formazione d egli amminoacidi da glutamm ato. Una probabile influenza potrebbe esserci sulla formazione della serina c glicina, ma è difficile speculare sui valori ottenuti , sia pcr ch è sono st ati ricavati sottraendo dalla radioatti vità corrispondente n el cro matogramma b idimen sionale alla serin a, glicina e glucosio, quella d el glucosio d et erminato in un altro cromatogramma (vedi p arte sperim entale), sia p erchè la zona radioattiva non era ben se parat a da quella adiacente corrisp ond ente all' acido glutammico. T ABELLA l. Influenza de l glucosio sul m etabolismo de ll'acido gluta mmico in fe ttine di corteccia r enale di coniglio mi sperim en·cia r enale di cub azione ed osio aggiunto t 90 f.L moli/g ttenuta incu- Risu ltati espressi in 11-g di acido g lutammico tras formato (o rimasto inalterato) p er 200 mg di tessuto, peso fresco, dopo incubazione per l h a 370 C in 0 2 in 3 ml di tampone fosfato eli E LLIOTT & H E DERSON (1948), O di quello bicarbonato di KREBS & H ENSELEIT (1932). Concentrazione dell'acido glutammico uniformemente m arcato 14C : 0,1 %, radioattività totale : lO 11-C per vaschetta. Concentrazione del glncosio non radioattivo, quando presente: 0,1 %. Valori medi d i IO esperienze ± err ore standard. Tnmpoue fosrnto ~mzz o D l INCU JJAZIONE SC OZI\ g l UCOSiO J (SELLINGER tto cerebrale, sulla produ - PRODOTTO DI T R ASFORMA ZIO N E: acido aspart ico I pr incipali marcato 14C erina , glicina 1a sono pretori ri portati nmi su carta est e sos tanze consider a t a a ; mediante glicina d alla volte quella !65) 1. 54 8·554. (11-g ac. glut ammico) l COli glUCOS i O T am pono bicarbonato ~~Senza g l UCOSiO (11-g ac. glu- JI (11-g ac. glutammico) l t ammico) l COn glUCOS i O (11-g ac. glutammico) l 11 ± 2 9± l 18 ± 2 14 ::!:: l 187 ± 29 175 ± 18 194 ± 24 182 ± 26 81 ± 13 58 ±. 3 4.3 ± 11 59 ± 10 alani nn 112 .:l: l 88 ± 11 113 ± 20 96 ± 9 glucosio tracce 83 :t: 17 143"'± 22 290 ± 32 244 ± 41 glutammin a serina + glicina . 218*± ]] acido glutammico 295 :!-_ 33 24·6 ± 17 C0 2 537 ± 24 549 ± 8 22 , 4 ± 1 ,0 22, 7± 0, 5 • ' l - - - - 0 2 11- rnoli/ 200 mg tessuto-peso umido/ h l • D ifl'ercnzn significativa : P < O,Ol. A nn. / st. Super. Sw lità (1065) 1. 548-55<1. 552 ESPERIENZE E RICERCHE Il glucosio, in accordo con quanto precedentemente trovato da KREBS, non ha alcun effetto sulla formazione di glutammina (KREBS, 1935), nè sulla quantità di acido glutammico intracellulare, al contrario di quanto osservato n elle fettine di corteccia cerebrale (STERN et al. , 1949; SELLINGER et al., 1962). Gluconeogenesi. -La quantità di glucosio formato da acido glutammico in un m ezzo di incubazione di fosfato esente da ioni Ca++ , è molto scarsa, dell'ordine di circa 10-20 p.g/ 200 mg di tessuto, peso fresco/h. In un m ezzo contenente ioni Ca++ invece, in accordo con quanto precedentemente trovato da KREBS et al. (1963) n elle fettine di corteccia r enale di ratto incubate con lattato o fumarato, si ha un notevole aumento della quantità di glutammico trasformato in glucosio ch e raggiunge 83 p.g per 200 mg di t essuto p eso fresco. In presenza di glucosio non radioattivo, in assenza o in presenza dello ione Ca ++, la gluconeogenesi da glutammato aumenta enormemente raggiungendo il valore di circa 220 p.g/200 mg di tessuto/h. Il glucosio radioattivo che si forma è presente quasi esclusivamente nel m ezzo di incubazione. La quantità di glucosio formato da glutammato dipende dalla quantità di glucosio non radioattivo presente nel mezzo di incubazione : è direttamente proporzionale alla quantità di glucosio aggiunta fino alla concentrazione dello 0,05 % e poi cresce più lentamente con l'aumento della concentrazione del glucosio nel mezzo (Fig. l). Residuo insolubile. - Nel r esiduo insolubile sono state trovate soltanto tracce di radioattività, il che indica che nelle condizioni sperimentali usate il glutammato non è incorporato in gran quantità nè nelle proteine nè nel glicogeno. La qua1 mezzo di ii KREB S et al. concentrazio gluconeogen< Il gluco sulla formazi cellulare in a Esso inoltre che non av guardo è into trovato che l effetto sulla Il glucosi tammato sia riguardo nota T ENG, 1954; renale di ratt quella osserva rità del diab e In ques te coneogenesi d della concentr DISCUSSIONE É Il glutammato è un attivo metabolita della corteccia r enale. Dopo una ora di incubazione esso viene utilizzato per circa il 40 % e m etabolizzato in C0 2 , glutammina, alanina, serina, glicina, acido aspartico e glucosio. La notevole formazione di glutammina è in accordo con quanto precedentemente trovato da KnEBS (1935) ; la produzione di alanina da glutammato marcato, indica che nella corteccia r enale l'acido piruvico che si forma viene transaminato piuttos to ch e esser e ridotto ad acido lattico. La presenza del glucosio non stimola la formazione dell'acido lattico. La piccola quantità di acido aspartico radioattivo indica una rapida utilizzazione dell'acido ossalacetico, sia attraverso il ciclo degli acidi tricarbossilici (e questo determina un'alta formazione di 14C02), sia attraverso la formazione di acido fosfopiruvico quando nel m ezzo di incubazione è presente o lo ione Ca++ o il glucosio. La serina può formarsi dall'ossipiruvico ad opera dell'ossipiruvico-transaminasi presente n el t essuto renale (SALLACK , 1955). Dalla serina può derivare poi la glicina in accordo con quanto precedentem ente dimostrato da SHEMIN (1946) con l'uso di glicina m arcata 14 C nel carbossile e 15N n el gruppo amminico. Ann. Jst. Super. Sanità (1965) 1 , 548 ·554 . ci. ~aooo u 2 ::l" .... 30000 ·;;:; ...c: 20000 o ·;:;; ov 10000 :J t; 0.02 Conc. del ! Rimane an fetto il glucosio È inter essante brale ò.i ratto, la produzione d BUSE L.LU E POCCHIARI tto da KREBS, 1935), nè sulla 1nto osser vato R et al., 1962). lo glutammico : molto scar sa, In un mezzo mente trovato • incubat e con li glutammico to p eso fresco. nza dello ione raggiungendo oattivo che si ~- La quantità glucosio non proporzionale !ello 0,05 % e e del glucosio >vat e soltanto mentali u sate ~o t eine nè n el La quantità di glucosio radioattivo formato da glutammato è dovuto al mezzo di incubazione usato : infatti, come a mpliament e dimostrato da KREBS et al. (1963), l'assenza dello ione Ca++ e la presenza del fosfato ad una con centrazione superiore allo 0,01 molare inibiscono considerevolmente l a gluconeogen esi. Il glucosio aggiunto al m ezzo di inc ub azione non ha al cun effetto nè sulla formazione di glutammina, nè sulla quantità di acido glutammico intracellulare in accordo con quanto p r ecedent emente trovato da KREBS (1935). Esso inoltre non ha effetto sulla produ zione di C0 2 , il ch e potrebbe indicare che non avviene n essuna diluizione al livello dell'acido piruvico. A tale riguardo è inter essante ricordar e che LEE, VERNON & CAHILL (1962) hanno trovato che il glucosio aggiunto al mezzo di incubazione non aveva alcun effetto sulla ossidazione del piruvato. Il glucosio invece stimola in modo considerevole la gluconeogen esi da glutammato sia in assenza ch e in presenza di ioni Ca++ ; è interessante a questo rigu ardo notare ch e da vari autori (FLINN, LEBOEUF & CARILL, Jr., 1961 ; TE NG, 1954 ; LANDAU, 1960) er a stat o trova to ch e in fettine di corteccia r en al e di r atto dia b etico la sintesi di glucosio da piruvato era maggiore di quella osservata in fettine di corteccia renale di ratto normale, e ch e l a severità d el diabete era un fattore important e nello stimolare l a glucon eogen esi. In queste esp eri en ze si è dimostra to che l 'effetto del glucosio sulle gluconeogen esi da glutammato non è catalitico ed aumenta con l'aumentare d ella concentrazione del glucosio nel m ezzo di incub azione (Fig. l). E tle. Dopo una me tabolizzato glucosio. La c eden temente 1at o marcato, vien e transaa del glucosio ttità di acido • ossalacetico, ·mina un' alta fosfopiruvico l glucosio. L a -transaminasi erivare poi la HEMIN (1946) · amrruntco. 965) 1' 548-554 . 553 ci. LOOOO so 30000 u ::l 3c ·.:::; ·v; zoooo .Q B u 10000 .=1 \.:) O.Ql O.OL 0.06 0.08 0.10 Conc. del glucosio nel mezzo F ig. l. - Influenza delle concentrazioni del glucosio nel mezzo di incubazione sulle gluconeogenesi da glutammato in fettine di corteccia renale di coniglio. - La quantità di glucosio radioattivo fo rma to da glut ammato uniformemente marcato 14C è espressa in colpi per minuti (c.p.m.) per 200 mg di tessuto (peso fre sco). Ogni punto rappresenta il valor e medio di due esperienze. % Rimane ancora da studiare su quale stadio d ella glucon eogenesi ha effetto il glucosio e se il suo effetto è correlato o m eno con quello d ello ione Ca ++. È interessan te infine ricordare ch e il glucosio nelle fet tin e di corteccia cer ebrale à i ratto, t essut o essenzialmente glicolitico, stimola considerevolm ente la produzione di acido la ttico da piruvico (BELOFF-CHAIN et al., 1962). A nn. I st. Supe·r. Sanitd (1965) 1, 548·554. 554 ESPER IENZE E RICERCHE Ringraziamenti . - Gli autori desiderano esprimere il loro ringraziam ento al Prof. E. B. Chain, per gli autorevoli consigli avuti n el corso del lavoro ; ai Proff. L. Tentori e G. Vivaldi per le analisi cromatografiche degli amminoacidi effettuate con l'analizzatore Beckman Spinco; ai Sigg. G. Cer velli e G. Ri cciarello per l' apprezzata assistenza t ecnica. Sulla N-be1 20 novembre 1964. BIBLIOGRAFIA B ELOFF-CHATN, A., R. CATANZARO, E. B. CRAIN, L. 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Riassun l'acido 2,3-cl ottiene per 1 2,3-crunossaliJ l'anidride del con il dicloru di PCl5 sull'a Summa1 dicarboxy lic a carboxylic aci The first and b enzylarr of benzylamÌJ duct through The seco through a r e. •ro ringrazia nel corso del grafiche degli igg. G. Cer- Sulla N-benzil-immide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico ADRIANA CESARI Laboratori di Chimica t F. PoccHIARl, lism in r at cere- C. Rossi, 1955. phragm musclr. md suspensions beled substrat es /. Ph.rsiol., 200, tomatic scanner 'elected Sci. P auni ne from glua nima1 tissu es. Riassunto. - Si descrivono due sintesi della N -benzilimmide dell' acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Nella prima la N-benzilimmide si ottiene per riscaldamento con SOCI2 della monobenzilammide dell' acido 2,3-chinossalin-clicarbossilico, ottenuta per azione della benzilammina sull'anidride dello st esso acido. Nella seconda si fa r eagire la b enzilammina con il dicloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarb ossilico preparato per azione di PC1 5 sull' acido. Summary. (On the synthesis of N -benzylimide of quinoxaline-2,3dicarboxy lic acid). - Two syntheses of N -ben zylimide of quinoxaline 2,3-dicarboxylic acid (l) are described. 1963. Renal t -kid ney c ortex lA , ildu ng im Tier;id ney i11 vitro. lelcd substra tes o acid s on sullrena lect omized n~ a ln.in ase. In : Ed ., p. 782 -787. •olism of gluta '• 148-162. '·· 162, 297-307. ion of gluta mic Arch. Biochem. l65) 1 . 548-554 . The first one is based on the r ea ction b etween quinoxaline anhy drid e and b enzylamine followed by treatment (hot) with H Cl of the obtained salt of benzylamine. Thc obtained monob enzylamidc (II) givcs the r equired product through a r eaction with SOCI2 and CHCl3 • /""' / N '\_/ CONH-R l Il J ~/~""COOH (Il) The second synthesis, which is impaired by its low yield, is r ea ched through a r eaction of benzylamjne with quinoxaline-2,3 dicarboxylic acid A nn. I st. Supe>·. Sauitti (196.1) 1 . 555·559. 556 ES PE RIE NZE E RlCERCIIE dichloride. The latter was prepared by action of PC15 on the corresponding acid. R ecentem ente è stato dimostrato che alcune ftalimmidi N-sostituite possono provocare effetti sfavorevoli sulla gravidanza del ratto simili a quelli osservati con la Talidomide (BIGNAMI et al., 1962) Consegu entem ente, è parso interessante verificare se tale azione sta particolare delle ftalimmidi sostituite o possa esser e causata anche da immidi cicliche di acidi bicarbossilici eterociclici. A questo scopo fu scelta la N-benzil-immide dell'acido 2,3-chinossalindicarbossilico (I, R = CH 2 -C 8H 5 ) la cui sintesi fa oggetto della presente nota. Come prodotto di partenza per t ale sintesi fu preparata la monobenzilammide dell' acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico (II, R = CH 2 -C 8 H 5 ) , non ancora nota e da noi facilmente ottenuta per azione della ben zilammina sull' anidride dello st esso acido. Dopo diversi tent ativi si è vis to che la N -benzil-immide può esser e ottenuta con resa pressochè t eorica p er riscaldam ento della m onoammide (II, R = CH2-C6H 5 ) con d ocuro di tionile oppure con ossicloruro di fosforo. In precedenza si era cercato di preparare l'immide (I, R = C~-C 6 H5 ) facendo r eagire la benzilammina con il dicloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico ; quest ' ultimo, non ancora noto in letteratura , fu facilm ente preparato p er azione del p entacloruro di fosforo sull'acido corrispondente . Con ques ta via di sintesi, tuttavia , la b enzil-immide d esiderata fu ottenuta con r ese scarsissime, il prodotto principale della r eazione essendo la dib enzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-di carbossilico. Un altro t entativo di effettuare la chiusura dell'anello immidico p er riscaldamento n el vuoto della monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalindicarbossilico non diede l'attesa immide, b en sì la N-b enzil-ammide dell'acido chinossalin-2-carbossilico (III, R = CH2-C6H 5) . La · facile decarbossilazione dell'a cido (II, R = CH 2-C 8 H 5 ) non era di per sé imprevedibile, tuttavia essa apparve in contrasto con quanto descritto da CHATTAWAY e H uMPHREY (1929) per la pr eparazione dell'immide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico (I, R = H) da essi ottenuta per riscaldam ento a secco ad alta t emperatura d ella monoammide dello stesso acido (II, R = H). In realtà, si riscontrò che il riscald11m ento n el vuoto di t ale monoammide da esclusiv amente la 2-carbossiammido-chinossalina (III, R = H), la decarbossilazione essendo anch e in questo caso la r eazion e preferita. La decar A nn. I st. Super. Sanità (1 965) 1 , 555 ·559. bossilazione di bossilico (PIUTé Monoben Grammi 9. alcool assoluto, Dopo aver scal la soluzione al< subito un b el 1 di b en zilammin dibenzil-ammid· prodotto gr ezz< benzilammina I Analisi: per c2 La struttm il medesimo a !oncino munito nella r eazione. un prodotto sol ammide pura, < Il sale di l sciolto a caldo i dibenzil-ammid< acquosa calda " 557 CESARI the corr espon- bossilazione di monoammidi e monoesteri dell'acido 2,3-chinossalin-dicarb ossilico (PIUTTI & MARINI, 1936) sembra d'altra parte assai generale. di N -sostituite ratto simili a >egu entemente, : delle ftalim~lichc di acidi (l) (II) ~.3-chinossalin­ della presente (III) la monobenzilH 2-C 6H5), non b enzilammina PARTE SPERIMENTALE Monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. (II) de può esser e ella monoamossicloruro di t = CH2 -C6 H5) :lo 2,3-chinosttui·a, fu facil~ido corrispondesiderata fu :tzione essendo Grammi 9,5 di anidride chinossalinica vengono sosp esi in 300 ml di alcool assoluto, si scalda a ricader e e si aggiungono g 16 di benzilammina. Dopo aver scaldato a ri cadere p er un'ora, si concentra a pressione ridotta la soluzione alcoolica ; il residuo viene ripreso con acqua e et ere. Si separa subito un bel prodotto cristallino (g 12) costituito essenzialment e dal sale di b enzilammina dell'acido 2,3-chinossalin-carbossiammidico (II) e da poca dibenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Un campione del prodotto grezzo così ottenuto per cristallizzazione da acetone dà il sale di b enzilammina puro, con p. f. 182-184o. Analisi: midico per ri.,3-chinossalinnide dell'acido non era dì tanto descritto nide dell'acido riscaldamento o (II, R = H). monoammide R = H), la rita. La decar- · 5) 1965) 1, 555·559. per C24H 22N 40 3 trov .% cale. c 69,71; 69,55; H 5,27; 5,35; N 13,72 ; 13,52 . La struttura del sale di b en zilammina è stata confermata sciogliendo il m edesimo a caldo in xilolo c scaldando la soluzione xilenica in un palloncino munito di una colonnina in modo da allontanare l' acqua che si forma nella r eazione. Terminato il riscaldamento, per raffreddamento si separa un prodotto solido che, dopo cristallizzazione da alcool, fornisce la dibenzilammide pura, con p. f. 190-192°. Il sale di benzilammina ottenuto come prodotto della reazione viene sciolto a caldo in acqua, filtrato da poco prodotto insolubile (risultato essere dib enzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico) e la soluzione acquosa calda viene acidificata con HCL Si ottengono così g 10,5 di monoAnn. 1st. Super. Sanità ( 1965) 1, 555·559. 558 E SPERIENZE E RICER CHE benzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico, che ricristallizzata da alcool, fonde a 1720 con decomposizione. Analisi: trov.% p er Ct,Ht aN aOa C 66,60; cale. H 66,44; 4,39; N 13,68; 4,26; 13,68. N-benzil- immide dell'acido 2,3 -chinossalin-dicarbossilico. (I) Grammi 6,5 di monobenzilammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico vengono trattati con SO cm 3 di SOC1 2 • Dopo 30' si aggiungono 300 ml di CHC1 3 e si scalda a ricadere sino a completa dissoluzione. Si concentra poi la soluzione a pressione atmosferica sino ad incipiente cristallizzazione. Dopo raffreddamento in ghiaccio, i cristalli vengono filtrati alla pompa, lavati due volte con poco CHC1 3 ghiacciato. Resa g 4,8 di prodotto praticament e puro, p. f. 270-272o. Un campione ricristallizzato da benzolo mostra p. f. 270-272°. Analisi: trov.% per C1 ,H 11N a02 C 70,23; cale. H 70,58; 3,72; N 14,57; 3,83; 14,53. Dalle acque cloroformiche per concentrazione si recupera cu ca l g di prodotto lievemente impuro. Pirolisi della monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Riscaldando p er l ora in xilolo la monobenzil-ammide ed evaporando poi il solvente nel vuoto, si ottiene un solido cristallino insolubile negli alcali caustici. Dopo due cristallizzazioni da alcool m etilico si ottengono cristalli di b enzilammide dell' acido 2-chinossalin-carbossilico, con p. f. 150-152°. Analisi: per cl GH ! aN 30 trov.% cale. C 72,90; H 72,98; 5,16; N 15,84; 4,98 ; 15,96. Grammi 3,9 si m escolano inti mente a l850, t e rapidamente a l ~ dopo di ch é la rr a pressione ridot1 Si ottengono cos: Analisi: per C 10I Dibenz Ad una solu: silico in 15 ml d lieve ebollizione ~ provoca immedia terminata l'aggiu filtra, lavando pc drato di b enzilan con p. f. l870. P pura, con p. f. l Analisi: per C24 I n filtrato be mide, dopo conceJ lavati con et er e € di b enzil-immide Analisi: Pirolisi della mono-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Grammi 2 di monoammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico (CHATTAWAY & H uMPHREY, 1929) vengono riscaldati nel vuoto a 185° p er 20 minuti e poi a 205° per altri lO minuti: si ottiene così una massa vetrosa colorata in bruno che per dissoluzione in acido acetico e trattamento con carbone animale, dà per cristallizzazione con buone r ese l'ammide dell' acido chinossalin-2-carbossilico, con p. f. 198°. Analisi: per C9 H,N 3 0 trov.% cale. C 62,56; 62,43 ; H 4,25; 4,07; N 24,44; 24,27. Ann. I st. Snper . San·ità (1965) 1. 555·559 . per C1 ,I 30 novembr G., D. Bo• F. D. 8 P. & G. B. l BIGN AMI, CRATTAWAY, PIUTTI, 559 CESARI Cloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. ricristallizzata 1; N 13,68; 13,68. :o. (I) salin-dicarhosngono 300 ml . Si concentra istallizzazione. i alla pompa, rodotto prati'0-272°. N 14,57; 14,53. 1 cuca l g di ;carbossilico. d evaporando ile n egli alcali 1gono cristalli 150-1520. 15,84; 15,96. ·bossilico. ·dicarhossilico ruoto a l8So sì una massa etico e trat>ne rese l'am- Grammi 3,9 di :midri de chinossalinica (CHA'l'TAWAY & HUMPHREY, 1929) si mescolano intimamente con g 4 ,2 di PCI 5 e la miscela si scalda gradualmente a 185°, t emperatura alla quale ha inizio la reazione; si raffredda rapidamente a 150° e si mantiene la r eazione a questa temperatura per 3 ore, dopo di ché la massa di reazione appare tutta liquida . Si elimina il POC1 3 a pressione ridotta e si cristallizza da ligroina la massa cris tallina r esidu a . Si ottengono così g 3 di dicloruro, con p. f. 85-87o. Analisi: per C10H.Cl 2N 2 02 trov. % C cal e. 47,31; H 47,07; 1,80; N 1,56; ll,Ol; 10,98. Dibenzil-ammide dell'an do 2,3 -chinossalin-dicarbossilico. Ad una soluzione di g 2,5 di cloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarhossilico in 15 mi di benzolo anidro si aggiungono lentamente e scaldando a lieve ebollizione g 3 di b enzilammina sciolti in 50 m! di benzolo. L'aggiunta provoca immediata formazione di un precipitato che aumenta col tempo; terminata l' aggiunta, si scalda su h. m . per mezz'ora, indi si raffredda e si filtra, lavando poi il precipitato sul filtro con acqua per eliminare il cloridrato di h enzilammina. Si ottengono così g 2,6 di dihem:il~mmide grezza, con p. f. 187°. Per cristallizzazione da alcool si ottiene la dihenzil ammide pura, con p. f. l90-l92o. Analisi: per C24 H 20N 402 trov. % C cale. 72,79; H 72,71; 5,19; N 14,31; 5,09; 14,14 . n filtrato benzenico da cui si era inizialm ente separata la dihenzilammide, dopo con centrazione a pressione ridotta, lascia dei crist alli che vengono lavati con etere e poi cristallizzati da poco benzolo. Si ottengono così g 0,2 di henzil-immide dell'acido 2,3-chinossalindicarhossilico, con p . f. 276°. Analisi: per C1 7H 11N 3 02 trov. % cal e. C 70,85; 70,58; H 4,01; N 3,83; 14,42; 14,53. 30 novembre 1964. BIBLIOGRAFIA G., D. BOVET, F. BOVET-NITTI & V. ROSNATI, 1962. Lancet, ii, 1333. F . D. & \v'. G. HUMPHREY, 1929. J. Chem. Soc., 645 P. & G. B. MARINI, 1936. Gazz . Chim. !tal., 66, 271. BIGNAMI, CHATTAWAY, N 24,44; 24,27. l 965) 1. 555·5 59 . PIUTTI , Ann. 1st. Super. Sanità (1965) 1. 5 55 ·559.