O 2

L’OSSIGENO COME SUBSTRATO DI ALTRE
REAZIONI METABOLICHE
Nella maggior parte delle cellule più del 90%
dell’ossigeno molecolare viene utilizzato per la
fosforilazione ossidativa
Il rimanente viene utilizzato in altre reazioni
metaboliche ed esistono almeno 200 enzimi che
utilizzano l’ossigeno come substrato
OSSIDASI ed OSSIGENASI
Si indicano OSSIDASI gli enzimi che catalizzano
l’ossidazione di un substrato per mezzo
dell’ossigeno
senza
incorporazione
di
quest’ultimo
nel
prodotto.
Normalmente
coinvolge 2 elettroni per cui l’ossigeno è
convertito in H2O2. Le ossidasi utilizzano un
metallo o un coenzima flavinico
Le OSSIGENASI sono invece enzimi che
incorporano ossigeno nei prodotti ossidati. In
questo
ambito
si
hanno
anche
le
MONOSSIGENASI, che incorporano un solo
atomo dell’ossigeno molecolare
TOSSICITA’ DELL’OSSIGENO PARZIALMENTE
RIDOTTO
La completa riduzione dell’ossigeno molecolare
ad acqua necessita di 4 elettroni; in realtà spesso
il
metabolismo
ossidativo
genera
specie
parzialmente ridotte dell’ossigeno che sono
MOLTO REATTIVE e quindi più tossiche
dell’ossigeno stesso
La riduzione dell’ossigeno con un solo elettrone
forma lo IONE SUPEROSSIDO (O2- ); l’aggiunta di
un altro elettrone porta alla formazione del
PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2)
L’aggiunta di un ulteriore terzo elettrone scinde
l’ossigeno a formare il RADICALE OSSIDRILICO
(OH- ) ed uno ione idrossido
Queste specie parzialmente ridotte dell’ossigeno
sono note con il termine ROS (REACTIVE
OXYGEN SUBSTANCES)
Tutte
queste
specie
vengono
prodotte
nell’ambiente intracellulare e debbono essere
convertite in specie meno reattive al fine di non
danneggiare l’organismo
PARADOSSO DELL’OSSIGENO
STRESS OSSIDATIVO
Il burst ossidativo è stato scoperto negli
animali solo 30 anni fa mentre nelle piante è
un’acquisizione degli anni 80
E’ uno dei più importanti paradossi della vita
sulla terra
Elemento comune di molte patologie è il
coinvolgimento della forma parzialmente
ridotta dell’ossigeno
Dal punto di vista biochimico, i radicali
liberi sono molecole particolarmente
instabili in quanto possiedono un solo
elettrone anziché due
Questo li porta a ricercare un equilibrio
appropriandosi dell’elettrone delle altre
molecole con le quali vengono a contatto,
molecole che diventano instabili e che a
loro volta ricercano un elettrone e così
via, innescando un meccanismo di
instabilità a “catena”
L’ossigeno atmosferico allo stato basale è un
bi-radicale, presenta cioè due elettroni spaiati
Ciò determina il fatto che l’ossigeno è
paramagnetico ed è improbabile che possa
reagire con le molecole organiche se prima
non viene attivato
Questa è necessaria in quanto i due elettroni
spaiati nell’ossigeno hanno un spin parallelo
Quindi l’ossigeno normalmente non è reattivo
con molecole organiche che presentano un
paio di elettroni con spin antiparallelo
Questa restrizione determina che il più
comune meccanismo di riduzione dell’ossigeno
nelle reazioni biochimiche è quello che
coinvolge il trasferimento di un solo elettrone
(RIDUZIONE MONOVALENTE)
Un altro modo attraverso il quale può avvenire
l’attivazione dell’ossigeno è l’assorbimento di
sufficiente energia da cambiare lo spin di uno
dei due elettroni spaiati
La forma bi-radicalica dell’ossigeno è nello
stato basale di tripletto e se esso assorbe
energia sufficiente da cambiare lo spin di uno
dei due elettroni spaiati, esso formerà lo
STATO SINGOLETTO
Questa attivazione permette all’ossigeno
singoletto di partecipare nelle reazioni che
coinvolgono il simultaneo trasferimento di due
elettroni (RIDUZIONE DIVALENTE)
Un altro meccanismo di attivazione è la
riduzione monovalente dell’ossigeno alla
forma del superossido, al perossido di
idrogeno e a radicale idrossilico ed infine ad
acqua
AGENTE OSSIDANTE E RIDUCENTE. PUO’
OSSIDARE LO ZOLFO, L’ACIDO ASCORBICO O
IL NADPH, RIDURRE IL CITOCROMO C E IONI
METALLICI
LA DISMUTAZIONE DEL SUPEROSSIDO PUO’
AVVENIRE SPONTANEAMENTE O ESSERE
CATALIZZATA
DALLA
SUPEROSSIDO
DISMUTASI (SOD)
NON E’ UN RADICALE LIBERO PERCHE’ TUTTI I
SUOI ELETTRONI SONO APPAIATI
MOLECOLA MOLTO TOSSICA CHE PASSA DALLE
MEMBRANE
E
QUINDI
NON
RESTA
COMPARTIMENTALIZZATO
LA PRESENZA DI UN METALLO RIDUCENTE
PORTA ALLA FORMAZIONE DI UNA MOELCOLA
MOTLO REATTIVA, IL RADICALE IDROSSILE
Fe2+ + H2O2  Fe3+ + •OH + OH(reazione di Haber-Weiss)
Il radicale idrossilico determina l’ossidazione
dei substrati mediante due possibili reazioni:
1)•OH + R  •ROH
2)•ROH + Fe3+  ROH + Fe2+ + H+
3)•ROH +O2  ROH + •O2 -+ H+
Il burst ossidativo è definito come la rapida
produzione di alti livelli di ROS in seguito a
stimoli esterni
Uno dei primi lavori sulla produzione delle ROS
risale al 1983 dove si dimostrava la
generazione rapida di ROS in piante di patata a
seguito di infezione da Phytophtora infestans
o, addirittura, con le componenti della parete
fungina
REAZIONI BIOLOGICHE DELLE ROS
DANNO OSSIDATIVO AI LIPIDI
DANNO OSSIDATIVO ALLE PROTEINE
DANNO OSSIDATIVO AL DNA
MITOCONDRIO
Le ROS danneggiano i lipidi di membrana
(PEROSSIDAZIONE LIPIDICA), ma anche le
proteine
Sono evidenti anche danni ossidativi a carico
della struttura del DNA in cui i radicali idrossilici
determinano rotture dei filamenti, che non
possono essere riparate, e conseguente morte
cellulare per interruzione della replicazione
cromosomica
Le cellule possiedono una serie di meccanismi
tesi alla protezione dal danneggiamento dello
stress ossidativo
Esistono i cosiddetti ANTIOSSIDANTI che
possono intercettare le ROS oppure ridurre i
composti ossidati
MECCANISMI DI DIFESA
SUPEROSSIDO DISMUTASI
O2- + O2- + 2H+  H2O2 + O2
Presente negli organismi aerobi e nella
maggior parte (se non in tutti) i
compartimenti cellulari
CATALASI
H2O2  HO2 + O2
Presente negli organismi aerobi e nella
maggior parte (se non in tutti) i
compartimenti cellulari
ACIDO ASCORBICO
L’acido L-ascorbico (vitamina C) è un’importante
vitamina della dieta umana ed è abbondante nei
tessuti vegetali.
Le foglie verdi presentano una quantità di acido
ascorbico simile a quello della clorofilla.
A causa della sua importanza nutrizionale, la
distribuzione dell’ascorbato è stata studiata
molto nelle piante; tuttavia, poca considerazione
è stata data alla sua importanza nelle piante.
L’ascorbato si pensa svolga un ruolo essenziale
in diversi processi fisiologici delle piante, inclusa
la
crescita,
la
differenziazione
ed
il
metabolismo
La funzione dell’ascorbato come riducente per
molti radicali liberi diminuisce il danno ossidativo
ma l’ascorbato ha sicuramente altre funzioni non
ancora note.
L’acido L-ascorbico è sintetizzato dagli esosi
nelle piante superiori ma ancora controversi
rimangono alcuni steps della sua biosintesi
Sebbene siano possibili due vie distinte nella
sintesi dell’acido ascorbico, le piante superiori
convertono il D-glucosio in ascorbato attraverso
una conversione diretta che mantiene la catena
carboniosa nella stessa sequenza
La via coinvolge l’ossidazione del carbonio 1 del
D-glucosio e la formazione di un endiolo tra il
carbonio 2 ed il carbonio 3
L’ascorbato
può
abbattere
direttamente,
con
o
senza
enzimatica, e indirettamente,
tocoferolo alla forma ridotta
le
ROS
la
catalisi
riciclando il
L’ascorbato reagisce con le ROS più facilmente
di altre componenti acquose, e quindi protegge
le macromolecole dallo stress ossidativo
La reazione con il superossido può svolgere un
ruolo fisiologico simile alla SOD:
2O2-+2H++ascorbato2H2O2 + deidroascorbato
La reazione con il perossido di idrogeno è
catalizzata dall’ascorbato perossidasi:
H2O2+2ascorbato2H2O+2 monodeidroascorbato
Il ruolo indiretto dell’ascorbato
come
antiossidante è legato alla rigenerazione degli
antiossidanti legati alla membrana come il
tocoferolo che abbatte i radicali perossilici e
l’ossigeno singoletto rispettivamente:
radicale tocoferossilico + ascorbato 
tocoferolo + monodeidroascorbato
SINERGISMO TRA ACIDO ASCORBICO E
VITAMINA E
Radicale
lipidico
Idroperossido
Lipidico
ROOH
-tocoferolo
Vit.E
Radicale
ascorbile
NADPH
Radicale
-tocoferossile
Acido
ascorbico
NADP
GLUTATIONE
Il glutatione (GSH) è un tripeptide (Glu-CysGly) le cui funzioni antiossidanti sono facilitate
dal gruppo sulfidrilico della cisteina
A seguito dell’ossidazione, lo zolfo forma un
radicale tiolico che reagisce con una altra
molecola di glutatione formando un ponte
disolfuro (GSSG)
Il GSH è presente in molti tessuti, cellule e
compartimenti subcellulari delle piante
Il suo livello si riduce con l’età e varia a
seconda dell’ambiente naturale; ad esempio, i
livelli di glutatione sono più elevati alla luce
che al buio
Al livello subcellulare, la concentrazione di
GSH è più alta nel cloroplasto, dove varia tra
1 e 4 mM, ma significative quantità
accumulano anche nel citosol
Il GSH può funzionare da antiossidante in
molti modi:
-Può reagire chimicamente con l’ossigeno
singoletto, il superossido e il radicale
idrossilico
- può funzionare direttamente da scavenging
delle ROS
Il GSH inoltre è l’agente riducente che ricicla
l’ascorbato dalla sua forma ossidata a quella
ridotta da parte dell’enzima deidroascorbato
riduttasi
Il GSH può anche ridurre il deidroascorbato
con un meccanismo non-enzimatico a pH7 e a
concentrazioni di GSH superiori a 1 mM.
Questa può divenire una via significativa nel
cloroplasto dove il pH dello stroma è circa 8 e
la concentrazione di GSH è circa 5 mM
Ci sono anche funzioni alternative del GSH nel
metabolismo cellulare indipendentemente dalle
sue funzioni antiossidanti
Può svolgere un ruolo chiave nel trasporto
dello zolfo ridotto dalle foglie ai tessuti sink
come le radici
Il GSH partecipa anche alla detossificazione
degli xenobiotici come substrato per la
glutatione-S-transferasi
TOCOFEROLO
Il tocoferolo, nello specifico l’alfa-tocoferolo
(vitamina E), è stato studiato in esteso nei
mammiferi come stabilizzatore della membrana
ed antiossidante che abbatte le ROS, i
radicali perossilici e l’ossigeno singoletto
Questo ruolo è correlato alla sua completa
stabilità dell’anello benzochinonico e la
completa riduzione della catena
Le proprietà antiossidanti del tocoferolo sono
il risultato della sua abilità a quenchiare
l’ossigeno singoletto ed i perossidi
Il tocoferolo è meno efficiente ad abbattere
l’ossigeno singoletto rispetto al beta-carotene
e tuttavia nelle membrane tilacoidali esso può
funzionare per rompere il radicale carbossilico
intrappolando i radicali perossilici:
ROO + tocoferolo  ROOH + radicale
tocoferossile
Il radicale tocoferossile è stabilizzato dalla
completamente sostituzione del benzochinone e
quindi blocca le reazioni ossidative a catena