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L’OSSIGENO COME SUBSTRATO DI ALTRE REAZIONI METABOLICHE Nella maggior parte delle cellule più del 90% dell’ossigeno molecolare viene utilizzato per la fosforilazione ossidativa Il rimanente viene utilizzato in altre reazioni metaboliche ed esistono almeno 200 enzimi che utilizzano l’ossigeno come substrato OSSIDASI ed OSSIGENASI Si indicano OSSIDASI gli enzimi che catalizzano l’ossidazione di un substrato per mezzo dell’ossigeno senza incorporazione di quest’ultimo nel prodotto. Normalmente coinvolge 2 elettroni per cui l’ossigeno è convertito in H2O2. Le ossidasi utilizzano un metallo o un coenzima flavinico Le OSSIGENASI sono invece enzimi che incorporano ossigeno nei prodotti ossidati. In questo ambito si hanno anche le MONOSSIGENASI, che incorporano un solo atomo dell’ossigeno molecolare TOSSICITA’ DELL’OSSIGENO PARZIALMENTE RIDOTTO La completa riduzione dell’ossigeno molecolare ad acqua necessita di 4 elettroni; in realtà spesso il metabolismo ossidativo genera specie parzialmente ridotte dell’ossigeno che sono MOLTO REATTIVE e quindi più tossiche dell’ossigeno stesso La riduzione dell’ossigeno con un solo elettrone forma lo IONE SUPEROSSIDO (O2- ); l’aggiunta di un altro elettrone porta alla formazione del PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2) L’aggiunta di un ulteriore terzo elettrone scinde l’ossigeno a formare il RADICALE OSSIDRILICO (OH- ) ed uno ione idrossido Queste specie parzialmente ridotte dell’ossigeno sono note con il termine ROS (REACTIVE OXYGEN SUBSTANCES) Tutte queste specie vengono prodotte nell’ambiente intracellulare e debbono essere convertite in specie meno reattive al fine di non danneggiare l’organismo PARADOSSO DELL’OSSIGENO STRESS OSSIDATIVO Il burst ossidativo è stato scoperto negli animali solo 30 anni fa mentre nelle piante è un’acquisizione degli anni 80 E’ uno dei più importanti paradossi della vita sulla terra Elemento comune di molte patologie è il coinvolgimento della forma parzialmente ridotta dell’ossigeno Dal punto di vista biochimico, i radicali liberi sono molecole particolarmente instabili in quanto possiedono un solo elettrone anziché due Questo li porta a ricercare un equilibrio appropriandosi dell’elettrone delle altre molecole con le quali vengono a contatto, molecole che diventano instabili e che a loro volta ricercano un elettrone e così via, innescando un meccanismo di instabilità a “catena” L’ossigeno atmosferico allo stato basale è un bi-radicale, presenta cioè due elettroni spaiati Ciò determina il fatto che l’ossigeno è paramagnetico ed è improbabile che possa reagire con le molecole organiche se prima non viene attivato Questa è necessaria in quanto i due elettroni spaiati nell’ossigeno hanno un spin parallelo Quindi l’ossigeno normalmente non è reattivo con molecole organiche che presentano un paio di elettroni con spin antiparallelo Questa restrizione determina che il più comune meccanismo di riduzione dell’ossigeno nelle reazioni biochimiche è quello che coinvolge il trasferimento di un solo elettrone (RIDUZIONE MONOVALENTE) Un altro modo attraverso il quale può avvenire l’attivazione dell’ossigeno è l’assorbimento di sufficiente energia da cambiare lo spin di uno dei due elettroni spaiati La forma bi-radicalica dell’ossigeno è nello stato basale di tripletto e se esso assorbe energia sufficiente da cambiare lo spin di uno dei due elettroni spaiati, esso formerà lo STATO SINGOLETTO Questa attivazione permette all’ossigeno singoletto di partecipare nelle reazioni che coinvolgono il simultaneo trasferimento di due elettroni (RIDUZIONE DIVALENTE) Un altro meccanismo di attivazione è la riduzione monovalente dell’ossigeno alla forma del superossido, al perossido di idrogeno e a radicale idrossilico ed infine ad acqua AGENTE OSSIDANTE E RIDUCENTE. PUO’ OSSIDARE LO ZOLFO, L’ACIDO ASCORBICO O IL NADPH, RIDURRE IL CITOCROMO C E IONI METALLICI LA DISMUTAZIONE DEL SUPEROSSIDO PUO’ AVVENIRE SPONTANEAMENTE O ESSERE CATALIZZATA DALLA SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD) NON E’ UN RADICALE LIBERO PERCHE’ TUTTI I SUOI ELETTRONI SONO APPAIATI MOLECOLA MOLTO TOSSICA CHE PASSA DALLE MEMBRANE E QUINDI NON RESTA COMPARTIMENTALIZZATO LA PRESENZA DI UN METALLO RIDUCENTE PORTA ALLA FORMAZIONE DI UNA MOELCOLA MOTLO REATTIVA, IL RADICALE IDROSSILE Fe2+ + H2O2 Fe3+ + •OH + OH(reazione di Haber-Weiss) Il radicale idrossilico determina l’ossidazione dei substrati mediante due possibili reazioni: 1)•OH + R •ROH 2)•ROH + Fe3+ ROH + Fe2+ + H+ 3)•ROH +O2 ROH + •O2 -+ H+ Il burst ossidativo è definito come la rapida produzione di alti livelli di ROS in seguito a stimoli esterni Uno dei primi lavori sulla produzione delle ROS risale al 1983 dove si dimostrava la generazione rapida di ROS in piante di patata a seguito di infezione da Phytophtora infestans o, addirittura, con le componenti della parete fungina REAZIONI BIOLOGICHE DELLE ROS DANNO OSSIDATIVO AI LIPIDI DANNO OSSIDATIVO ALLE PROTEINE DANNO OSSIDATIVO AL DNA MITOCONDRIO Le ROS danneggiano i lipidi di membrana (PEROSSIDAZIONE LIPIDICA), ma anche le proteine Sono evidenti anche danni ossidativi a carico della struttura del DNA in cui i radicali idrossilici determinano rotture dei filamenti, che non possono essere riparate, e conseguente morte cellulare per interruzione della replicazione cromosomica Le cellule possiedono una serie di meccanismi tesi alla protezione dal danneggiamento dello stress ossidativo Esistono i cosiddetti ANTIOSSIDANTI che possono intercettare le ROS oppure ridurre i composti ossidati MECCANISMI DI DIFESA SUPEROSSIDO DISMUTASI O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2 Presente negli organismi aerobi e nella maggior parte (se non in tutti) i compartimenti cellulari CATALASI H2O2 HO2 + O2 Presente negli organismi aerobi e nella maggior parte (se non in tutti) i compartimenti cellulari ACIDO ASCORBICO L’acido L-ascorbico (vitamina C) è un’importante vitamina della dieta umana ed è abbondante nei tessuti vegetali. Le foglie verdi presentano una quantità di acido ascorbico simile a quello della clorofilla. A causa della sua importanza nutrizionale, la distribuzione dell’ascorbato è stata studiata molto nelle piante; tuttavia, poca considerazione è stata data alla sua importanza nelle piante. L’ascorbato si pensa svolga un ruolo essenziale in diversi processi fisiologici delle piante, inclusa la crescita, la differenziazione ed il metabolismo La funzione dell’ascorbato come riducente per molti radicali liberi diminuisce il danno ossidativo ma l’ascorbato ha sicuramente altre funzioni non ancora note. L’acido L-ascorbico è sintetizzato dagli esosi nelle piante superiori ma ancora controversi rimangono alcuni steps della sua biosintesi Sebbene siano possibili due vie distinte nella sintesi dell’acido ascorbico, le piante superiori convertono il D-glucosio in ascorbato attraverso una conversione diretta che mantiene la catena carboniosa nella stessa sequenza La via coinvolge l’ossidazione del carbonio 1 del D-glucosio e la formazione di un endiolo tra il carbonio 2 ed il carbonio 3 L’ascorbato può abbattere direttamente, con o senza enzimatica, e indirettamente, tocoferolo alla forma ridotta le ROS la catalisi riciclando il L’ascorbato reagisce con le ROS più facilmente di altre componenti acquose, e quindi protegge le macromolecole dallo stress ossidativo La reazione con il superossido può svolgere un ruolo fisiologico simile alla SOD: 2O2-+2H++ascorbato2H2O2 + deidroascorbato La reazione con il perossido di idrogeno è catalizzata dall’ascorbato perossidasi: H2O2+2ascorbato2H2O+2 monodeidroascorbato Il ruolo indiretto dell’ascorbato come antiossidante è legato alla rigenerazione degli antiossidanti legati alla membrana come il tocoferolo che abbatte i radicali perossilici e l’ossigeno singoletto rispettivamente: radicale tocoferossilico + ascorbato tocoferolo + monodeidroascorbato SINERGISMO TRA ACIDO ASCORBICO E VITAMINA E Radicale lipidico Idroperossido Lipidico ROOH -tocoferolo Vit.E Radicale ascorbile NADPH Radicale -tocoferossile Acido ascorbico NADP GLUTATIONE Il glutatione (GSH) è un tripeptide (Glu-CysGly) le cui funzioni antiossidanti sono facilitate dal gruppo sulfidrilico della cisteina A seguito dell’ossidazione, lo zolfo forma un radicale tiolico che reagisce con una altra molecola di glutatione formando un ponte disolfuro (GSSG) Il GSH è presente in molti tessuti, cellule e compartimenti subcellulari delle piante Il suo livello si riduce con l’età e varia a seconda dell’ambiente naturale; ad esempio, i livelli di glutatione sono più elevati alla luce che al buio Al livello subcellulare, la concentrazione di GSH è più alta nel cloroplasto, dove varia tra 1 e 4 mM, ma significative quantità accumulano anche nel citosol Il GSH può funzionare da antiossidante in molti modi: -Può reagire chimicamente con l’ossigeno singoletto, il superossido e il radicale idrossilico - può funzionare direttamente da scavenging delle ROS Il GSH inoltre è l’agente riducente che ricicla l’ascorbato dalla sua forma ossidata a quella ridotta da parte dell’enzima deidroascorbato riduttasi Il GSH può anche ridurre il deidroascorbato con un meccanismo non-enzimatico a pH7 e a concentrazioni di GSH superiori a 1 mM. Questa può divenire una via significativa nel cloroplasto dove il pH dello stroma è circa 8 e la concentrazione di GSH è circa 5 mM Ci sono anche funzioni alternative del GSH nel metabolismo cellulare indipendentemente dalle sue funzioni antiossidanti Può svolgere un ruolo chiave nel trasporto dello zolfo ridotto dalle foglie ai tessuti sink come le radici Il GSH partecipa anche alla detossificazione degli xenobiotici come substrato per la glutatione-S-transferasi TOCOFEROLO Il tocoferolo, nello specifico l’alfa-tocoferolo (vitamina E), è stato studiato in esteso nei mammiferi come stabilizzatore della membrana ed antiossidante che abbatte le ROS, i radicali perossilici e l’ossigeno singoletto Questo ruolo è correlato alla sua completa stabilità dell’anello benzochinonico e la completa riduzione della catena Le proprietà antiossidanti del tocoferolo sono il risultato della sua abilità a quenchiare l’ossigeno singoletto ed i perossidi Il tocoferolo è meno efficiente ad abbattere l’ossigeno singoletto rispetto al beta-carotene e tuttavia nelle membrane tilacoidali esso può funzionare per rompere il radicale carbossilico intrappolando i radicali perossilici: ROO + tocoferolo ROOH + radicale tocoferossile Il radicale tocoferossile è stabilizzato dalla completamente sostituzione del benzochinone e quindi blocca le reazioni ossidative a catena
