l virus H1N1 dell’influenza pandemica del 2009 induce una risposta anticorpale in grado di cross‐reagire con il virus dell’influenza “Spagnola” del 1918 Lavoro di diploma 2010‐2011 Giorgia Pucci Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno Svolto presso l’Istituto di Ricerca in Biomedicina a Bellinzona (IRB) Responsabili: Davide Corti (PhD), Blanca M. Fernandez‐Rodriguez (TAB) Sommario 1. Abstract ...................................................................................................................................................... 4 2. Introduzione .............................................................................................................................................. 5 2.1. Scopo e obiettivo del lavoro ............................................................................................................. 5 2.2. Cos’è l’influenza ................................................................................................................................ 5 2.3. Il virus ................................................................................................................................................ 6 2.4. Come evolvono i virus influenzali .................................................................................................... 7 2.5. I 3 virus influenzali del mio lavoro di diploma ............................................................................... 10 2.6. Vaccino ............................................................................................................................................ 11 3. Materiali e metodi ................................................................................................................................... 12 3.1. Emoagglutinine influenzali ............................................................................................................. 12 3.2. Cellule e batteri ............................................................................................................................... 12 3.3. HUFI6 e MUFI6 ................................................................................................................................ 13 3.4. Sieri .................................................................................................................................................. 13 3.5. Altre sostanze .................................................................................................................................. 13 3.6. Kit di estrazione e purificazione ..................................................................................................... 15 3.7. Apparecchiature .............................................................................................................................. 15 3.8. Descrizione di alcuni strumenti usati piú frequentemente nel lavoro ......................................... 16 3.8.1. NanoDrop (Thermo Scientific) ................................................................................................ 16 3.8.2. FACS (BD Biosciences) ............................................................................................................. 17 3.9. Metodi per la produzione di cellule che esprimono sulla loro superficie le emoagglutinine dell’influenza spagnola del 1928 e dell’influenza stagionale del 1999 ............................................ 18 3.9.1. Trasformazione di E. Coli TOP 10 con A/SC e A/NC ed esecuzione di una coltura in fase liquida ...................................................................................................................................... 18 3.10. Metodi per la produzione di cellule che esprimono sulla loro superficie le emoagglutinine dell’influenza suina del 2009 ............................................................................................................. 19 3.10.1. Realizzazione dei primer specifici ........................................................................................... 19 3.10.2. Ottimizzazione della PCR e amplificazione del frammento relativo all’emoagglutinina di A/CA/04/09 ............................................................................................................................. 19 3.10.3. Digestione enzimatica, ligazione e dialisi del vettore phCMV1 con A/CA/04/09 ................ 19 3.10.4. Trasformazione di E. Coli TOP 10 con A/CA ed esecuzione di una coltura in fase liquida ... 20 3.11. Settaggio della quantità di plasmide da usare nella trasfezione .................................................. 21 3.11.1. Lettura al FACS dei risultati ottenuti ...................................................................................... 22 3.12. Analisi dei sieri al FACS ................................................................................................................... 22 4. Risultati .................................................................................................................................................... 24 4.1. Prima parte del lavoro .................................................................................................................... 24 4.1.1. Quantificazione A/SC e A/NC ................................................................................................. 24 2 4.1.2. Settaggio della PCR per A/CA ................................................................................................. 24 4.1.3. Quantificazione dei campioni successivamente a digestione enzimatica ............................ 25 4.1.4. Ligasi ........................................................................................................................................ 25 4.1.5. Quantificazione A/CA ............................................................................................................. 26 4.1.6. Setting al FACS ........................................................................................................................ 27 4.2. Seconda parte del lavoro (analisi preliminari) ............................................................................... 28 4.3. Seconda parte del lavoro (analisi effettiva dei campioni) ............................................................. 32 5. Discussione .............................................................................................................................................. 35 5.1. Prima parte del lavoro .................................................................................................................... 35 5.2. Seconda parte del lavoro (analisi preliminari) ............................................................................... 36 5.3. Seconda parte del lavoro (analisi effettiva dei campioni) ............................................................. 37 6. Conclusioni ............................................................................................................................................... 39 7. Bibliografia ............................................................................................................................................... 40 8. Ringraziamenti ......................................................................................................................................... 42 I. Allegati ....................................................................................................................................................... 1 I. Plasmide phCMV1 (Genlantis, San Diego CA) ...................................................................................... 1 II. Plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) ................................................................................................. 3 III. Sequenze delle 3 emoagglutinine in analisi nel lavoro di diploma ..................................................... 4 i. HA A/CA/04/09 ................................................................................................................................. 4 ii. HA A/SC/1/18 .................................................................................................................................... 4 iii. HA A/NC/20/99 ................................................................................................................................. 5 IV. Confronto tra la sequenza amminoacidica delle tre emoagglutinine in analisi ............................. 6 V. Risultati ottenuti al FACS ed elaborato con Flowjo 9.3.1 .................................................................... 7 VI. Risultati elaborati con Flowjo 9.3.1 e rivisti con Microsoft Office Excel 2007 .............................. 13 Tabella A ...................................................................................................................................................... 13 Tabella B ...................................................................................................................................................... 14 Tabella C ...................................................................................................................................................... 15 3 1. Abstract 1.1. Abstract in italiano 1.2.Abstract in inglese Recent studies performed on rats have shown that antibodies developed by our immune system following active immunization or vaccination can neutralize one or more influenza viruses belonging to the same type. This can give the subject a cross‐protection. In this study it is therefore proposed to test sera of people vaccinated in 2009 against swine influenza (pandemic) with two other influenza type A virus: the influenza pandemic/SC/1/18 and seasonal influenza virus A/CN/20/99. It is known that the ability of the virus neutralizing antibody is due to the bond formed between the antibody and a region of the hemagglutinin (HA) present on the envelope of the influenza virus. The purpose of this study was to investigate the ability of the antibodies in patient sera to cross‐neutralize only the HA of pandemic virus because, evolutionarily, this virus has major sites of conservation which are less prone to glycosylation: which instead is not the case for seasonal influenza viruses that are frequently subject to structural changes in the level of HA. The effect of these sites of glycosylation was demonstrated using a flow cytometer (FACS), with which it was possible to view the actual capacity of sera to neutralize the virus pandemic and not seasonal flu. Recenti studi eseguiti sui topi hanno dimostrato che gli anticorpi sviluppati dal nostro sistema immunitario successivamente ad immunizzazione attiva o vaccinazione possono neutralizzare uno o più virus dell’influenza appartenenti allo stesso tipo, fornendo così al soggetto una cross‐protezione. In questo studio si è quindi proposto di testare i sieri dei pazienti vaccinati nel 2009 contro l’influenza suina (pandemica) con altri due virus influenzali di tipo A: il virus dell’influenza pandemica A/SC/1/18 e il virus dell’influenza stagionale A/NC/20/99. Si conosce inoltre che la capacità dell’anticorpo di neutralizzare il virus è dovuto al legame formato tra l’anticorpo stesso e l’emoagglutinina (HA) presente sull’envelope del virus influenzale. Pertanto si è studiata la capacità degli anticorpi presenti nei sieri dei pazienti di cross‐neutralizzare unicamente le HA dei virus pandemici in quanto, evolutivamente, sono quelle che presentano maggiori siti di conservazione e sono meno soggette a glicosilazioni: cosa che invece non avviene per i virus dell’influenza stagionale che sono frequentemente soggetti a cambiamenti di livello strutturale delle HA. L’effetto di questi siti di glicosilazione è stato dimostrato grazie all’uso di un citometro a flusso (FACS), dove si sono potute visualizzare le effettive capacità dei sieri di riconoscere unicamente i virus pandemici e non quello dell’influenza stagionale . 4 2. Introduzione 2.1. Scopo e obiettivo del lavoro Questo lavoro di diploma consiste nel testare la capacità di sieri umani ottenuti successivamente all’esecuzione della vaccinazione contro l’influenza suina del 20091 di riconoscere emoagglutinine di un virus pandemico risalente al 1918. Infatti, gli anticorpi prodotti dal sistema immunitario, successivamente alla vaccinazione, sono ritenuti capaci di neutralizzare anche altri virus influenzali dello stesso tipo. La capacità di cross‐reagire verrà testata sulle emoagglutinine virali di tre virus di tipo A: A/NC/20/99 (influenza stagionale del 1999 e usato come vaccino nel periodo tra il 2000 e il 2007), A/SC/1/18 (influenza spagnola del 1918), A/CA/04/09 (influenza suina del 2009, diventato poi il virus epidemico H1N1 utilizzato nel vaccino stagionale 2010/2011) [1]. Per la prima parte del mio lavoro ho avuto a disposizione le sequenze dell’emoagglutinine di due virus influenzali pandemici (spagnola e suina) e di un virus influenzale stagionale inserite all’interno di due diversi plasmidi: phCMV1 (influenza stagionale e spagnola) e il vettore pcDNA3 (suina). La sequenza codificante per l’emoagglutinina di A/CA/04/09 è stata trasferita dal plasmide pcDNA3 a phCMV1. Successivamente a quest’operazione sono stati prodotti quantitativi maggiori di plasmidi phCMV1, contenenti le tre sequenze specifiche per le emoagglutinine influenzali in analisi, tramite trasformazione batterica. Lo scopo di questo passaggio è stato quello di avere a disposizione sufficiente materiale per la seconda parte del mio lavoro che consisteva nel trasfettare, con i vettori contenenti le sequenze sopra citate, una linea cellulare chiamata 293T/17 in modo che queste cellule fossero in grado di presentare sulla loro superficie le emoagglutinine dei tre virus influenzali in questione. A questo punto è stato possibile, tramite uno staining extracellulare, visualizzare con citometria a flusso l’effettiva capacità degli anticorpi presenti nei sieri di cross‐reagire con gli antigeni in questione. In questa seconda parte sono stati utilizzati, oltre ai sieri dei pazienti vaccinati nel 2009, anche sieri dei pazienti vaccinati nel 2008 e nel 2010; in modo da rendere maggiormente visibile la risposta di cross‐neutralizzazione dei sieri in analisi. L’obiettivo principale di questo lavoro è stato di valutare la cross reattività nella risposta anticorpale indotta dalla vaccinazione con il virus pandemico della suina (A/CA/04/09) [2]. 2.2. Cos’è l’influenza L’influenza è una patologia di tipo infettivo causata da virus a RNA della famiglia degli Orthomyxoviridae [3]. Prevalentemente viene trasmessa da persona a persona tramite aerosol provenienti dalle cavità orali (naso e gola) di una persona infettata dal virus che tossisce o starnutisce; pertanto la trasmissione aerea del virus richiede uno stretto contatto tra individuo infetto e individuo sano. I primi sintomi compaiono generalmente dopo un’incubazione di circa 1‐2 giorni e, in questo lasso di tempo, il virus può essere eliminato nell’ambiente circostante dal soggetto infettato [5]. L’esordio della malattia è spesso molto brusco ed improvviso, con picchi febbrili che possono durare dai 3 ai 4 giorni. I sintomi sono solitamente: febbre (con punte che possono giungere sino ai 39.5°C), dolori muscolari ed ossei, astenia, cefalea e sintomi respiratori quali tosse, congestione nasale e mal di gola [5] [6]. In generale, la malattia 1 I sieri mi sono forniti dall’Istituto San Raffaele di Milano e in parte anche dall’Istituto di Ricerca di Bellinzona. evolve in modo benigno senza complicanze e si risolve nell'arco di 3‐6 giorni senza la necessità di effettuare terapie particolari. Tuttavia, nei bambini più piccoli, nelle persone con più di 65 anni, negli individui affetti da alcune patologie croniche, nei soggetti immunocompromessi ed in gravidanza, possono insorgere alcune complicanze anche severe [5]. 2.3. Il virus Figura 1: rappresentazione di un virus influenzale con le sue componenti principali (a sinistra) e rappresentazione schematica di un’emoagglutinina con evidenziazione di alcune regioni caratteristiche (a destra) [27]. I virus influenzali appartengono al genere Orthomyxovirus della famiglia Orthomyxoviridaee [2] e vengono differenziati in virus di tipo A, tipo B e tipo C in base alle loro caratteristiche antigeniche. Da notare comunque che tutti e 3 i tipi di virus influenzale contengono al loro interno 8 frammenti di RNA a singola elica, ognuno codificante per differenti proteine del virus [5]. I virus influenzali di tipo A sono i patogeni più virulenti per l’uomo e possono causare la sintomatologia più grave. Essi sono capaci di infettare anche un’ampia varietà di mammiferi ed uccelli oltre all’uomo: ad esempio cavalli, maiali e volatili domestici e selvatici. Molto spesso a questa tipologia di virus sono associate epidemie e pandemie [3]. A seconda delle glicoproteine di superficie che lo compongono, il virus di tipo A può essere ulteriormente suddiviso in sottotipi (o serotipi): 16 sottotipi di emoagglutinina (da H1 a H16) e 9 sottotipi di neuroaminidasi (da N1 a N9) [5]. Tutti i sottotipi sono stati rilevati nelle specie aviarie (in particolare nei volatili acquatici selvatici che sono ospiti naturali per una grande varietà di virus A), mentre l’uomo e i mammiferi ospitano solo alcuni sottotipi: ciò sta molto probabilmente ad indicare che gli uccelli sono il serbatoio naturale del virus influenzale di tipo A [5] [6]. Nell’uomo i due sottotipi maggiormente responsabili delle epidemie stagionali sono H1 e H3. Il virus di tipo B è quasi esclusivamente un patogeno umano, fatta eccezione per i pinnipedi (quali foche ed otarie) che sono gli unici animali vulnerabili conosciuti [4]. Generalmente è meno grave dell’influenza di tipo A. Il ridotto tasso di mutazione antigenica, combinata con una scarsa gamma di ospiti 6 (che impedisce uno spostamento antigenico tra specie diverse) assicura l’impossibilità di pandemie di influenza B [6]. L'influenza C infetta sia l'uomo che i suini e può causare gravi malattie ed epidemie locali [5]. Tuttavia, l'influenza C è meno comune rispetto agli altri tipi e normalmente sembra causare solo disturbi non troppo gravi nei bambini [6]. Nel suo complesso se consideriamo le caratteristiche comuni alle tre diverse tipologie di virus, abbiamo: la struttura virale di base, la particella di forma sferica‐ovoidale ed un involucro. Quest’ultimo caratterizzato da due tipi di glicoproteine: l'emoagglutinina (HA) e la neuroaminidasi (N). Per glicoproteina s’intende una proteina alla cui catena peptidica sono legate catene oligosaccaridiche definite glicani. Il glicano viene attaccato mediante un processo di modificazione genericamente definito come glicosilazione [8]. Quindi, come detto precedentemente, l’emoagglutinina e la neuroaminidasi sono due glicoproteine presenti sull’envelope virale; la prima è presente sull’envelope di alcuni virus come per esempio il virus dell’influenza ed è responsabile dell’adesione del virus alla cellula destinata ad essere infettata (appartiene alla famiglia delle lectine e può provocare l’agglutinazione degli eritrociti) [5]. La seconda invece è un enzima appartenente alla classe delle idrolasi. È una glicoproteina espressa tipicamente sulla superficie dei virus influenzali ed é necessaria per la penetrazione del patogeno nelle vie respiratorie; inoltre risulta essere indispensabile affinché il virus rilasciato dalle cellule infettate possa essere liberato ed infettare quindi altre cellule [5]. Il genoma del virus consiste in un singolo filamento di RNA segmentato in 8 frammenti (7 nel tipo C) che codificano per 10 proteine strutturali e non strutturali. La particolarità dei virus influenzali è la variabilità antigenica, cioè la loro capacità di cambiare il loro "identikit" rendendo più difficile il compito del sistema immunitario. Questo fenomeno è più frequente nei virus di tipo A rispetto a quelli di tipo B e mai registrato nel tipo C. Le continue modificazioni producono varianti virali verso le quali, nella popolazione a rischio, la resistenza è scarsa o assente. E' per questo che l'influenza continua a essere la maggiore patologia a carattere epidemico nell’uomo, e che ogni anno cambiano i vaccini [9]. 2.4. Come evolvono i virus influenzali L’influenza è causata da una moltitudine di specie virali che, ogni anno possono estinguersi, causare epidemie o rispettivamente pandemie. Tipicamente nelle due normali stagioni influenzali (una per emisfero), in un anno ci sono tra i 3 ed i 5 milioni di casi di malesseri gravi e fino a 500'000 decessi, che costituiscono una epidemia influenzale ogni anno. Ogni decennio o ventennio insorge una pandemia, che infetta una grande parte della popolazione mondiale e può uccidere decine di milioni di persone. A differenza dell’epidemia, che colpisce una popolazione di individui delimitata sia nel numero che nella regione, la pandemia ha una diffusione geografica molto estesa ed interessa diverse aree del mondo presentando un elevato numero di morti e casi gravi [4]. La prima pandemia influenzale documentata è quella del 1918, o anche chiamata “spagnola”, causata dal ceppo virale H1N1. Storicamente si tratta della pandemia peggiore e causò attorno ai 50 milioni di morti. Nel corso degli anni sono state registrate altre pandemie che, benché presentino un numero di decessi minore della spagnola, non sono però da considerare meno importanti. Ben 39 anni dopo la pandemia del 1928 ci fu, nel 1957, la pandemia asiatica (H2N2), seguita poi nel 1968 dalla pandemia di 7 Hong Kong (H3N2) ed ai giorni nostri dall’influenza suina (H1N1) o meglio definita con l’acronimo SOIV (Swine Origin Influenza Virus) [10]. I nuovi virus influenzali sono prodotti costantemente da mutazioni o da riassortimento [5]. A questa continua evoluzione sono soprattutto interessati gli antigeni di superficie, in modo particolare l'emoagglutinina. I cambiamenti possono essere di due tipi: le variazioni antigeniche maggiori (antigenic shifts) e le variazioni antigeniche minori (antigenic drifts) [8]. Le antigenic shift si verificano ogni 10‐30 anni e soltanto nei virus di tipo A, le antigenic drift avvengono quasi annualmente sia nel virus di tipo B che in quelli di tipo A. Gli antigenic shift determinano la comparsa di nuovi virus, aventi caratteristiche antigeniche dell'emoagglutinina e/o della neuroaminidasi del tutto diverse, verso i quali la popolazione è priva di immunità. Quando si verifica il cambiamento simultaneo dei due antigeni di superficie la pandemia è particolarmente virulenta. Se invece lo shift coinvolge solo l'emoagglutinina il virus si diffonde ma, per la presenza nelle popolazioni di anticorpi anti‐neuroaminidasi efficaci, la malattia risulta meno grave [5]. Gli antigenic drifts, si verificano invece ogni 1‐3 anni all’interno di uno stesso sottotipo influenzale sia per l’influenza A che per l’influenza B. Tale fenomeno è determinato dalle successive mutazioni dei geni, che codificano per emoagglutinina e/o neuroaminidasi: ciò comporta cambiamenti nella sequenza aminoacidica dei siti antigenici delle proteine, di conseguenza gli anticorpi diffusi nella popolazione non riescono più a riconoscere il virus. Questo genere di mutazioni è dovuto principalmente ad errori di trascrizione da parte della polimerasi virale [5] [9]. Un ulteriore sistema adottato dal virus per potersi evolvere, e quindi evitare il riconoscimento delle sue strutture da parte del sistema immunitario, è rappresentato da differenti livelli di glicosilazione. Tutte le glicosilazioni a carico dell’emoagglutinina prevedono la coniugazione di oligosaccaridi alla catena laterale dell’aminoacido asparagina (le cosiddette N‐glicosilazioni) [8]. Figura 2: messa in evidenza dei cambiamenti a livello strutturale dell’emoagglutinina con visualizzazione dei siti di glicosilazione (in blu e rispettivamente in rosso) che determinano un cambiamento per il riconoscimento da parte degli anticorpi di strutture comuni. La parte dell’emoagglutinina mantenuta invariata viene rappresentata in verde [28]. 8 La glicosilazione rappresenta inoltre il motivo per cui i virus pandemici usati nel mio lavoro mostrano delle somiglianze a livello antigenico; pertanto risulta facilitato il riconoscimento di entrambi da parte degli anticorpi contenuti nei sieri dei pazienti vaccinati contro il SOIV. Altrettanto non si può dire invece per il virus dell’influenza stagionale che presenta un maggior numero di siti glicosilati che pertanto compromettono il riconoscimento da parte del sistema immunitario [2]. Figura 3: emoagglutinine (HA) di tipo influenzale appartenenti al ceppo pandemico o stagionale. (A‐B) confronto tra HA dell’influenza SC del 1918 con influenza stagionale NC del 1999 che evidenziano, tramite colorazione blu, i siti di glicosilazione. Come si può ben notare alla testa dell’HA di tipo stagionale vi sono delle glicosilazioni che determinano la differenza della risposta immunitaria [28]. Ė inoltre importante segnalare che tutte le emoagglutinine virali presentano una regione comune che risulta essere molto conservata. Questa regione é il gambo o in inglese chiamato anche “stem”. La maggior parte degli anticorpi prodotti dal sistema immunitario sono diretti contro la testa dell’emoagglutinina (globular head) che, come descritto in precedenza, rappresenta la regione maggiormente soggetta a mutazioni indotte dal meccanismo di antigenic drift ed è anche interessata da modificazioni nel numero e nella localizzazione dei residui oligosaccaridici. Tuttavia, recenti studi condotti all’IRB2, hanno dimostrato anche la presenza di anticorpi diretti contro la stem dell’emoagglutinina in grado di neutralizzare il virus. Questi ultimi anticorpi sono stati dimostrati essere in grado di riconoscere e neutralizzare molteplici virus anche appartenenti a differenti sottotipi virali andando a costituire la cosiddetta risposta anticorpale di tipo eterosubtipico [11]. Questo tipo di risposta rappresenta soltanto una frazione minoritaria della risposta anticorpale diretta contro l’emoagglutinina ed è caratterizzata da anticorpi in grado di neutralizzare il virus ma con scarsa potenza. Data comunque la maggior presenza di anticorpi diretti contro la globular head e la loro maggiore efficacia neutralizzante, gli anticorpi contenuti nei sieri dei pazienti non sono in grado di neutralizzare tutti e tre i virus influenzali (anche se la stem di questi tre virus è molto conservata) poiché diretti verso una regione della testa dell’emoagglutinina non conservata nell’influenza stagionale [2]. 2 Esempio uno studio condotto da Davide Corti e pubblicato nel 2010, intitolato: “Heterosubtypic neutralizing antibodies are produced by individuals immunized with seasonal influenza vaccine”. Citazione bibliografica [11]. 9 2.5. I 3 virus influenzali del mio lavoro di diploma Originariamente il virus pandemico dell’influenza H1N1 è emerso nel 1918 dando poi luogo a periodici ceppi stagionali che hanno cominciato a diminuire in frequenza durante la fine degli anni cinquanta [2]. La pandemia del 1918, anche chiamata spagnola3, uccise circa 50 milioni di persone per poi scomparire all’incirca dopo 18 mesi dalla sua comparsa [3]. Nel 1977 si verificò una recrudescenza di virus H1N1, ridefinendo così i ceppi di H1N1 stagionali che sono attualmente in circolazione (come ad esempio A/NC/20/99) [2]. Questi ceppi stagionali, data la trasmissione unicamente da uomo a uomo, subiscono annualmente delle mutazioni antigeniche che li rendono ogni anno un virus “nuovo” che il nostro sistema immunitario fatica a riconoscere [12]. In contrasto con questi adattamenti all’uomo da parte del virus, l'attuale pandemia d'influenza A (H1N1) del 2009 (risultante da vari riassortimenti nel corso degli anni con altri virus di tipo influenzale) rappresenta una trasmissione cross‐specie dato che il virus, precedentemente, era limitato alla specie dei suini [2]. Grazie al fatto che negli ultimi anni il virus ha usato come serbatoio i maiali, limitandone pertanto le mutazioni genetiche tra cui principalmente la glicosilazione, ha permesso al patogeno di mantenere una somiglianza di circa il 95% con gli antigeni di superficie della spagnola. Figura 4: genesi del virus dell’influenza suina. Nel 1990 si è verificato un primo un riassortimento tra il virus classico della suina, il virus Nord Americano dell’aviaria ed il virus umano dell’H3N2 portando come risultato ad un triplo riassortimento H3N2 e H1N2 che successivamente ha continuato a circolare in Nord America come virus influenzale nella popolazione suina. Questo virus si è poi nuovamente riassortito con un quarto derivante dall’Eurasia portando come risultato finale al virus della suina (SOIV) odierno [29]. 3 Nome dovuto al fatto che furono i giornali spagnoli i primi a darne notizia 10 Quindi la conservazione antigenica tra il virus della “Spagnola” ed il SOIV è alla base dell’osservazione che le persone già entrate in contatto con il virus del 1918 sono in grado di cross reagire con il SOIV [12] [13]. Questo meccanismo può anche essere definito cross‐neutralizzazione: infatti gli anticorpi in questo caso riescono a riconoscere una struttura comune a due virus pandemici pur essendo diversi tra loro ed isolati in un lasso di tempo di 90 anni. Il sistema immunitario è in grado di contrastare tutte le varianti genetiche antigenicamente simili a quelle che in passato hanno infettato l'organismo grazie alla presenza di alcuni epitopi conservati all’interno della struttura proteica dell’emoagglutinina [14] [15]. 2.6. Vaccino I vaccini attualmente in commercio possono essere realizzati con virus interi inattivati, cioè uccisi, oppure con solo le parti fondamentali del virus in grado si stimolare il sistema immunitario. Questi vaccini vengono denominati split (a virus “dissociati”) quando le particelle virali sono disaggregate mediante dei solventi, e vaccini a subunità quando sono presenti solo alcune proteine della superficie virale (emoagglutinine o neuroaminidasi) importanti per lo sviluppo della risposta immune. Questi vaccini subvirionici (split o subunità) danno un'ottima protezione e sono ben tollerati anche da soggetti particolarmente sensibili alle proteine esogene (ad esempio i bambini, gli asmatici, ecc.). Per aumentarne l’immunogenicità sono stati recentemente introdotti sul mercato vaccini con nuove sostanze adiuvanti (microemulsione di squalene in acqua o liposomi). Il primo caso di vaccinazione in cui sono state effettivamente utilizzate le sostanze adiuvanti è proprio durante la pandemia del 2009. La produzione del virus avviene in uova di pollo per circa 9‐12 giorni in aziende certificate e sotto rigoroso controllo veterinario [16]. Il vaccino, iniettato ai pazienti italiani di cui ho a disposizione il siero per eseguire il lavoro di diploma, si chiama Focetria4. È costituito da un pool monovalente (MPH) di antigene di superficie inattivato del virus pandemico con una sospensione tamponata contenente essenzialmente le proteine purificate della membrana esterna, emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA), di un ceppo di virus influenzale pandemico raccomandato dalla OMS‐UE per la pandemia5. Contiene inoltre degli adiuvanti (microemulsionati di squalene) per aumentarne la patogenicità e dei conservanti per evitarne l’immediato degrado [17]. I sieri forniti dall’IRB invece sono di persone vaccinate con i seguenti vaccini: Nome Tipologia Dose A (H1N1) A (H3N2) B Influvac 2008/2009 Stagionale 0.5 mL A/Brisbane/59/2007 Brisbane/10/2007 B/Florida/4/2006 Influvac 2009/2010 Stagionale 0.5 mL A/Brisbane/59/2007 A/Brisbane/10/2007 B/Brisbane/60/2008 Pandemrix7 Pandemico 0.5 mL A/California/7/2009 ‐ ‐ Influvac 2010/2011 Stagionale 0.5 mL A/California/7/2009 A/ Perth/16/2009 B/Brisbane/60/2008 6 4 Focetria della ditta Novartis (Svizzera) Virus usato: A/California/7/2009 6 Influvac della ditta Solvay (Svizzera) 7 Pandemrix della ditta GlaxoSmithKline (Svizzera); the vaccine contains an immunologic adjuvant AS03 which consists of DL‐α‐tocopherol (vitamin E), squalene and polysorbate 5 11 3. Materiali e metodi Idealmente il mio lavoro di diploma si può suddividere in due parti: la prima comprende la trasfezione di cellule specifiche in modo che riescano ad esprimere sulla superficie cellulare le emoagglutinine di interesse, ricavate a partire dalla sequenza specifica inserita all’interno di un vettore plasmidico. A sua volta questa prima parte può essere ulteriormente suddivisa in due poiché i campioni, a dipendenza del plasmide in cui sono inserite le sequenze, verranno trattati in modo diverso con esperimenti specifici atti comunque a raggiungere lo scopo finale di espressione a livello cellulare delle emoagglutinine in analisi. La seconda parte consiste nel trasfettare le cellule 293T/17 e successivamente testare la capacità di sieri ottenuti dopo la vaccinazione con il virus SOIV nel 2009 e nella successiva stagione 2010/2011 di riconoscere le emoagglutinine presentate sulla superficie delle cellule trasfettate. 3.1. Emoagglutinine influenzali I campioni utilizzati per la trasfezione delle cellule mi sono stati forniti dall’Istituto di Ricerca in Biomedicina di Bellinzona (IRB). Le sequenze codificanti per le emoagglutinine di interesse sono state inserite all’interno di due diversi tipi di plasmide: la sequenza codificante per l’emoagglutinina dell’influenza spagnola del 1918 (A/SC/1/18) e quella per l’emoagglutinina dell’influenza stagionale del 1999 (A/NC/20/99) sono state inserite all’interno di un plasmide phCMV1 mentre la sequenza dell’emoagglutinina relativa all’influenza suina del 2009 (A/CA/04/09) è stata inserita all’interno del plasmide pcDNA3.18. La conservazione dei campioni è avvenuta a ‐80°C. 3.2. Cellule e batteri I batteri utilizzati per il processo di trasformazione si chiamano One Shot TOP10 Chemically Competent E.Coli (Invitrogen, Svizzera). Hanno la caratteristica di avere un'alta efficienza di trasformazione ed inoltre mantengono un’alta replica dei plasmidi. La conservazione è raccomandata a ‐80°C [18]. Per la seconda parte del lavoro ho usato le cellule chiamate HEK 293T/17. La sigla HEK sta per Human Embryonic Kidney, sono cellule aderenti, facili da far crescere e frequentemente usate per esperimenti di trasfezione. All’IRB vengono tenute in coltura in incubatori a 37°C con il 5% di CO2 e al 95% di umidità all’interno di specifiche flask al quale viene aggiunto un terreno ideale per la crescita delle cellule senza che vi siano contaminazioni batteriche o fungine. Prima di essere messe in coltura le cellule sono conservate a ‐150°C in Figura 5: HEK 293T/17 [30]. appositi congelatori. 8 Per maggiori informazioni riguardante i plasmidi utilizzati vedi gli allegati 12 3.3. HUFI6 e MUFI6 Anticorpi monoclonali scoperti e prodotti all’IRB in grado di riconoscere e neutralizzare tutti i sottotipi di influenza A. MUFI6 possiede una regione costante derivante da anticorpo di topo, mentre HUFI6 possiede una regione costante derivante da anticorpo di origine umana. 3.4. Sieri Alcuni sieri contenenti gli anticorpi sviluppati successivamente a stimolazione del sistema immunitario con la vaccinazione contro l’influenza suina del 2009 sono stati forniti dall’Istituto San Raffaele di Milano. Questi anticorpi sono diretti contro l’emoagglutinina influenzale, presumibilmente verso la testa dell’emoagglutinina che risulta inoltre essere la regione maggiormente soggetta a modificazioni ti tipo strutturale. I sieri prelevati successivamente a vaccinazione del 2008, 2009 e 2010 mi sono stati forniti dall’IRB. Dall’iniezione del vaccino al prelievo del siero sono trascorsi 14‐30 giorni. Per quanto riguarda i sieri del 2009 comprendono sia vaccinazione contro l’influenza stagionale che la vaccinazione contro l’influenza pandemica (suina). 3.5. Altre sostanze PCR Nome prodotto Ditta Particolarità Taq DNA Polymerase recombinant Invitrogen, Switzerland 10x PCR Buffer Minus Mg2+ Invitrogen, Switzerland 50mM Magnesium Chloride Invitrogen, Switzerland 10mM dNTP Invitrogen, Switzerland Primer specifici Microsynth, Switzerland Design eseguito in laboratorio con programma CLC Mainworkbench e realizzati dalla Microsynth Nome prodotto Ditta Descrizione Agarose I BioConcept, Switzerland Ethidium Bromide Solution Sigma‐Aldrich Blue Juice™ Gel Loading Buffer Invitrogen, Switzerland 100bp DNA Ladder Invitrogen, Switzerland Gel Agarosio 13 Digestione enzimatica e ligasi Nome prodotto Ditta Descrizione BglII New England BioLabs, USA NotI New England BioLabs, USA NEBuffer3 (10x) New England BioLabs, USA BSA New England BioLabs, USA Albumina bovina, viene usata per prevenire l’adesione dell’enzima al tubo di reazione o alla punta della pipette T4 DNA Ligase New England BioLabs, USA 10x Ligase Reaction Buffer New England BioLabs, USA Nome prodotto Ditta Descrizione Bacto™ Agar Becton Dickinson and Company, France LB Medium Bio 101, California Trasformazione degli E.Coli Top10: One Shot TOP10 Competent E.Coli Chemically Invitrogen, Switzerland SOC Medium Invitrogen, Switzerland Usato nello step finale per ottenere massima efficienza di trasformazione Kanamycin Invitrogen (GIBCO), Switzerland Nome prodotto Ditta Descrizione DMEM Invitrogen (GIBCO), Switzerland HyClone Bovine Calf Serum Thermo Scientific, USA Contiene proteine utili per le colture cellulari Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma‐Aldrich, Switzerland PS (Penicillin‐Streptomycin) Invitrogen (GIBCO), Switzerland Fugene HD Roche, Switzerland Sostanza capace di formare dei liposomi con al loro interno il materiale genetico da introdurre all’interno della cellula di interesse Tripsina Invitrogen (GIBCO), Switzerland Trasfezione 293T/17: 14 Analisi al FACS Nome prodotto Ditta Descrizione EDTA Invitrogen (GIBCO), Switzerland HyClone Bovine Calf Serum Thermo Scientific, USA PBS Invitrogen (GIBCO), Switzerland DyLight 649‐Conjugated Affini Pure Jackson Immuno Research, Inc. F(ab’)2 Fragment Goat Anti‐Human IgG, Fc, Fragment Specific Anticorpo secondario, si lega alla regione Fc dell’anticorpo primario. Dotato di fluoroforo. ELISA Nome del prodotto Ditta Descrizione BSA New England BioLabs, USA PBS Invitrogen (GIBCO), Switzerland Goat Anti‐Human IgG‐AP Jackson Immuno Research, Inc 4 Nitrophenyl phosphate disodium salt hexaydrate Sigma‐Aldrich, Switzerland Substrato Bicarbonate Buffer Realizzato in Istituto 3.6. Kit di estrazione e purificazione Nucleo Spin® Plasmid (Macherey‐Nagel, Switzerland) GFX PCR DNA and Gel Purification kit (GE‐Healthcare, Switzerland) 3.7. Apparecchiature T3000 Thermocycler (Biolabo Scientific Instruments, Switzerland) Camera elettroforetica (Witec Ag, Switzerland) PCR Cabinet (Witec Ag, Switzerland) Fluorescent Tables (Techne, Switzerland) Nanodrop Spectrophotometer ND‐1000 (Thermo Scientific, USA) FACS Calibur e FACS Canto Centrifuge 5415 D e 5810 R (Eppendorf, Switzerland) Thermomixer compact (Eppendorf, Switzerland) Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc., USA) Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator (Thermo Scientific, USA) Agitatore e piastra riscaldante (IG Instrumenten Gesellschaft AG, Switzerland) Bunsen Fireboy Plus (IBS Integra Biosciences, Switzerland) 15 3.8. Descrizione di alcuni strumenti usati piú frequentemente nel lavoro 3.8.1. NanoDrop (Thermo Scientific) Il NanoDrop, della ditta Thermo Scientific, è uno spettrofotometro (220‐750nm) capace di analizzare dei volumi molto piccoli di campioni da quantificare (fino a 0.5 μL) mantenendo un’elevata accuratezza e riproducibilità [19]. Questa apparecchiatura utilizza una tecnologia brevettata, basata sulla tensione superficiale che piccoli volumi di liquidi esercitano quando si trovano collocati tra due superfici vicine. In poche parole la goccia di campione posizionata nell’apposita piastra di lettura crea una colonna di liquido a diretto contatto con due fibre ottiche, e può essere analizzata in modo semplice e veloce. Questo elimina la necessità di cuvette ed altri dispositivi di contenimento del campione e permette di pulire in pochi secondi le due superfici entrate in contatto con il campione. Inoltre, il NanoDrop ha la capacità di misurare i campioni ad alta concentrazione, senza diluizione (50x concentrazione superiore a quello campioni misurati con uno spettrofotometro cuvetta standard) [19] [20]. La visualizzazione dei risultati può essere effettuata al computer tramite dei grafici e dei rapporti che mi permettono di determinare il grado di purezza del campione oltre alla sua quantificazione [20]. Figura 6: visualizzazione di come si vedono le immagini allo schermo del computer [31]. Nel mio caso ciò che interessa maggiormente è la possibilità di quantificare gli acidi nucleici successivamente all’esecuzione di una PCR o di una purificazione, determinandone anche il grado di purezza e verificando pertanto la presenza o l’assenza di contaminazioni proteiche (rapporto A 260/280 maggiore o uguale a 1.7‐1.8) [20]. 16 3.8.2. FACS (BD Biosciences) Il FACS, o anche denominato citometro a flusso, è un apparecchio che unisce le caratteristiche di uno strumento contaglobuli a quello di un microscopio a fluorescenza [21]. Le cellule da contare vengono marcate con appositi fluorocromi che, una volta colpiti dal raggio laser presente nella camera di conta, vengono eccitati emettendo una ben determinata fluorescenza rilevabile con appositi detettori posizionati all’interno dello strumento. La camera di conta può essere definita come un blocco di quarzo scavato all’interno per formare un capillare in cui le cellule, immerse nel liquido di trascinamento, passano singolarmente per poi essere colpite dal fascio laser. La capacità del fluido di separarle è definita focalizzazione idrodinamica [22]. A B Figura 7: (A) foto dell'imbuto che grazie alla focalizzazione idrodinamica indirizza le cellule nel capillare che a sua volta entra all'interno della camera di conta dove i fluorocromi verranno eccitati. (B) fascio laser indirizzato dai vari prismi verso il punto di incontro delle particelle [32]. In generale il primo laser, che colpisce le cellule nella camera di conta, ha una lunghezza d’onda di 488 nm (colore blu). Per colpire le cellule deve passare attraverso una serie di prismi e lenti che lo indirizzano verso il punto esatto d’incontro delle particelle; a sua volta la luce diffusa dalle particelle viene convogliata, attraverso un sistema di fibre ottiche, in un sistema di filtri capace di separare le varie lunghezze d’onda generate dai fluorocromi utilizzati. I filtri in questione sono specifici unicamente per determinate lunghezze d’onda infatti se non corrisponde quest’ultima viene riflessa. Ci sono i filtri "Long Pass (LP)" che si lasciano attraversare solo da lunghezze d'onda superiori a quella fissata e riflettono tutto ciò che possiede una lunghezza d'onda inferiore; i filtri "Band Pass (BP)" che si lasciano attraversare solamente da lunghezze d'onda comprese tra due valori fissati, ed i filtri "Short Pass (SP)" che si lasciano attraversare da lunghezze d'onda inferiori a quella fissata e riflettono tutto ciò che possiede una lunghezza d'onda superiore [23]. Pertanto la scelta dei fluorocromi da utilizzare per detettare le varie particelle viene applicata seguendo la configurazione dello strumento e quindi in base al sistema di laser e di filtri di cui è composto [21]. 17 3.9. Metodi per la produzione di cellule che esprimono sulla loro superficie le emoagglutinine dell’influenza spagnola del 1928 e dell’influenza stagionale del 1999 3.9.1. Trasformazione di E. Coli TOP 10 con A/SC e A/NC ed esecuzione di una coltura in fase liquida Prima di iniziare l’esperimento l’IRB mi ha fornito i plasmidi contenenti le sequenze per le due emoagglutinine in analisi che successivamente sono stati quantificati con l’apparecchio Nanodrop. Questa misura mi ha permesso di determinare il corretto volume di soluzione contenente plasmide da utilizzare per la trasformazione degli E. Coli Top10; infatti secondo il protocollo fornito dalla ditta Invitrogen il quantitativo massimo di DNA consigliato è 100 ng. Come primi campioni mi sono stati forniti: la sequenza dell’emoagglutinina della spagnola A/SC/1/18 e quella dell’influenza stagionale A/NC/20/99; tutte inserite correttamente all’interno del vettore phCMV1. Seguendo il protocollo fornito dalla ditta Invitrogen ho trasformato i batteri allo scopo di poter realizzare una prima coltura su piastra dei due campioni. Questo mi ha permesso di amplificare il numero di plasmidi contenenti l’inserto di interesse. Per trasformare i batteri ho utilizzato lo shock termico: in poche parole si tratta di portare i batteri da 4°C circa a 42°C in qualche secondo. Questo permette alla parete batterica di diventare permeabile formando delle specie di pori che consentono l’entrata del DNA plasmidico all’interno del battere. Successivamente per permettere la chiusura dei pori bisogna riposizionare la Eppendorf in ghiaccio per alcuni minuti. Alla fine i batteri vengono incubati per circa 1h a 37°C in modo che possano attivare il loro metabolismo iniziando a riprodursi. Dopo questo lasso di tempo si può inoculare una ben determinata quantità di batteri in piastre selettive contenenti l’antibiotico specifico (nel mio caso il plasmide phCMV1 contiene il gene di resistenza alla kanamicina) e lasciarle incubare overnight (circa 12 ore) a 37°C in modo che le colonie possano crescere. Il giorno successivo saranno cresciuti unicamente i batteri che si sono trasformati, e cioè quei batteri che hanno inglobato al loro interno il plasmide avente la resistenza alla kanamicina. Questo purtroppo non vuol dire però che il plasmide debba contenere per forza l’inserto codificante per la mia emoagglutinina di interesse; infatti può capitare che durante la ligasi il plasmide si sia richiuso su se stesso non formando quindi un legame con la sequenza dell’emoagglutinina. Successivamente si è deciso di proseguire con una coltura in fase liquida di medie dimensioni (160 mL) in modo da amplificare maggiormente la quantità di plasmide a disposizione. Questa coltura è rimasta in incubazione nella camera tutta la notte su un apposito agitatore regolato a 225 rpm. Il giorno successivo con l’ausilio del kit Nucleo Spin Plasmid (Macherey‐Nagel, Svizzera) si è eseguito l’estrazione del materiale plasmidico dal battere. Il protocollo utilizzato e quello specifico per le colture in fase liquida di medie dimensioni Xtra Midi (colture comprese tra i 40 e i 400 mL). Successivamente a questo passaggio si è quantificato il materiale genetico estratto con l’ausilio del Nanodrop. I campioni sono stati stoccati in apposite Eppendorf (DNA RNA Free) da 1.5 mL e messi in congelatore a ‐80°C per conservarli fino al prossimo utilizzo. 18 3.10. Metodi per la produzione di cellule che esprimono sulla loro superficie le emoagglutinine dell’influenza suina del 2009 3.10.1. Realizzazione dei primer specifici La sequenza per l’HA relativa all’influenza suina é stata inserita all’interno di un plasmide chiamato pcDNA3.1. Per evitare l’aggiunta di variabili all’esperimento si é deciso di cambiare il plasmide di inserzione e utilizzare phCMV1 come per i campioni precedenti. Per fare ciò sono stati realizzati dei primer su misura contenenti la sequenza di taglio per un enzima di restrizione specifico presente anche all’interno del plasmide phCMV1, proprietà che verrà sfruttata negli esperimenti successivi. Questi primer sono in grado di legarsi in parte alla sequenza della mia emoagglutinina ed in parte invece, a partire dal sito di taglio per l’enzima di restrizione non sono complementari e pertanto sono liberi. Le sequenze dei primer sono quindi (design realizzato all’IRB con software CLC Mainworkbench mentre la sintesi é stata eseguita dalla ditta Microsynth): FW primer con sequenza di taglio per BglII 5’ TCGTGAGATCTATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATA 3’ RV primer con sequenza di taglio per NotI 5’ GGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTGCGGCCGCTCATAC 3’ Per quanto riguarda la sequenza dei primer In grassetto sono segnalate delle sequenze che non si appaiano né al plasmide né all’emoagglutinina In giallo sono evidenziate le sequenze di taglio per gli enzimi di restrizione, mentre in verde é segnalata l’inizio della sequenza codificante per gli amminoacidi che compongono l’emoagglutinina di interesse. 3.10.2. Ottimizzazione della PCR e amplificazione del frammento relativo all’emoagglutinina di A/CA/04/09 Il setting della PCR é stato eseguito provando diverse temperature di anneal dei primer e diverse concentrazioni di DNA. La temperatura migliore per l’anneal é risultata essere 60°C mentre la concentrazione di DNA ideale è di 150 ng. Si è quindi proseguito con l’amplificazione e l’estrazione del frammento di interesse da pcDNA3.1. Successivamente é stato realizzato un gel di agarosio all’1% per poter visualizzare e tagliare la banda relativa alla sequenza amplificata grazie al confronto della taglia con un Marker di 100bp. Con l’uso degli UV e di un bisturi é stata selezionata la banda di interesse per poi essere successivamente purificata dal gel con apposito kit chiamato GFX PCR DNA and Gel Purification kit (GE‐ Healthcare, Svizzera). A questo punto é stato quantificato con Nanodrop il campione ottenuto. 3.10.3. Digestione enzimatica, ligazione e dialisi del vettore phCMV1 con A/CA/04/09 La digestione enzimatica é stata eseguita in contemporanea sia sulla sequenza codificante per l’emoagglutinina del virus A/CA/04/09 selezionata e purificata nell’esperimento precedente, sia sul plasmide phCMV1 senza inserto in modo da creare le zone di coesione utili nella reazione di ligasi. 19 L’incubazione avviene per 1 ora a 37°C e successivamente gli enzimi vengono inattivati per 20 minuti a 65°C. Una volta eseguita questa reazione bisogna procedere con una purificazione del prodotto da tutti i reagenti che possono interferire con la ligazione successiva. Questo avviene grazie all’uso del kit GFX PCR DNA and Gel Purification kit (GE‐Healthcare, Svizzera). Successivamente bisogna eseguire una quantificazione del prodotto con Nanodrop; utile per la determinazione del quantitativo di campione da pipettare nella provetta di reazione. Per la determinazione della concentrazione ideale di plasmide e inserto da utilizzare ho usufruito di tre modi diversi di calcolo. Il primo proviene dal sito internet della New England Bio Labs (USA) mentre il secondo e il terzo sono delle formule che mi sono stati forniti in laboratorio ed in cui l’unica differenza consiste in un fattore numerico. Così sono state realizzate tre diverse provette di reazione con le tre diverse concentrazioni di inserto e vettore calcolate con i tre metodi; in questo modo è stato possibile determinare la tecnica migliore. Sono poi stati aggiunti i rispettivi reagenti, tra cui l’enzima T4 DNA ligase, ed il tutto é rimasto in incubazione per 1 ora a temperatura ambiente. Per poter selezionare i plasmidi aventi l’inserto è stata eseguita una PCR successivamente all’esecuzione di una trasformazione batterica e una coltura su piastre selettive. I primer utilizzati per questa PCR sono gli stessi realizzati per l’estrazione della sequenza codificante per l’emoagglutinina di A/CA/04/09 dal vettore plasmidico pcDNA3. Le condizioni di PCR sono invariate rispetto a quelle prestabilite durante l’ottimizzazione eseguita nel capitolo 3.10.2. Trascorsa l’ora di incubazione é stata eseguita una dialisi, con membrana da 0.05 µm (Millipore, Svizzera), di 30 minuti per eliminare tutti i reagenti ed i sali utilizzati nella ligasi e che potrebbero disturbare nella prossima reazione; che sarebbe la trasformazione batterica. 3.10.4. Trasformazione di E. Coli TOP 10 con A/CA ed esecuzione di una coltura in fase liquida Lo scopo ed i procedimenti di questo esperimento sono gli stessi che per A/SC e A/NC; infatti anche in questo caso si inizia con una trasformazione batterica e successivamente una coltura su piastra contenente l’antibiotico kanamicina per selezionare tutti quei batteri che sono stati trasformati correttamente e contengono al loro interno phCMV1 con la resistenza specifica. L’unica differenza consiste nello step successivo: dopo aver messo in coltura i batteri si preleva un determinato quantitativo dalla colonie cresciute e si esegue una PCR. Questo ci permette di discriminare le colonie che contengono unicamente il plasmide da quelle che contengono il plasmide con l’inserto. Una volta selezionate le colonie di interesse si preparano delle colture in fase liquida (nelle beute) di medie dimensioni in modo da amplificare maggiormente la quantità di plasmide avente l’inserto. Questa coltura è rimasta in incubazione nella camera tutta la notte su un apposito agitatore regolato a 225 rpm. Con il resto della colonia è stato preparato uno stock in glicerolo che poi, una volta messo in azoto liquido, è stato immediatamente stoccato a ‐80°C. Il giorno successivo si è proseguito con l’estrazione del materiale plasmidico dai batteri posti nella coltura di medie dimensioni grazie all’uso del kit Nucleo Spin Plasmid (Macherey‐Nagel, Svizzera) ed alla fine si é quantificato il prodotto ottenuto dall’estrazione con l’uso del Nanodrop. I campioni sono stati stoccati in apposite Eppendorf da 1.5 mL e messi in congelatore a ‐80°C per conservarli fino all’uso. 20 3.11. Settaggio della quantità di plasmide da usare nella trasfezione Un volta purificati e quantificati i plasmidi appartenenti a virus influenzali A/SC, A/NC e A/CA si procede con il settaggio della concentrazione di plasmide da utilizzare durante la trasfezione delle 293T/17. Questo risulta importante per determinare a che concentrazione il plasmide inizia a diventare tossico per la cellula, causandone la morte, e a che concentrazione l’espressione delle HA sulla superficie cellulare è massima. A questo proposito è inoltre essenziale trovare una concentrazione in cui entrambi questi fattori siano rispettati. Come primo passaggio dell’esperimento ho dovuto preparare le cellule 293T/17 per la trasfezione. Dato che queste cellule crescono in adesione sulla superficie della flask, ho dovuto principalmente staccarle con l’aiuto di tripsina (enzima proteolitico), pipettarle in una Falcon da 50 mL, centrifugarle e successivamente contarle. Una volta determinato il numero di cellule contenuto nella Falcon, ho potuto preparare delle Petri contenenti 4 milioni di cellule 293T/17 ciascuna con 10 mL di terreno specifico. A questo punto sono state sistemate in termostato per circa 12 ore. Il giorno successivo si inizia con il preparare la soluzione trasfettante che deve contenere: Il plasmide con l’emoagglutinina specifica, alla concentrazione da testare Il Fugene HD DMEM senza nessuna aggiunta di antibiotici o proteine I plasmidi sono stati testati alla concentrazione di 0.5 μg/mL, 2 μg/mL e 8 μg/mL, per quanto riguarda A/SC e A/NC, mentre a 2 μg/mL, 5 μg/mL e 8 μg/mL, per quanto riguarda A/CA, usando come controllo positivo il plasmide contenente la sequenza per l’emoagglutinina del virus influenzale A/VN/1194/04 e come controlli negativi delle cellule che non verranno trasfettate con il plasmide ma seguiranno comunque tutto il processo di trasfezione (anche definite Mock). Una volta calcolato il corretto volume di plasmide da pipettare si procede con la realizzazione della soluzione trasfettante. Successivamente si vortexano per alcuni secondi le provette contenenti la soluzione e si lascia incubare il tutto per 30 minuti a temperatura ambiente in modo da permettere la formazione di liposomi contenenti al loro interno il materiale genetico (in questo caso DNA plasmidico) da usare successivamente per il processo di trasfezione. Infatti il materiale genetico riesce ad entrare all’interno della cellula grazie alla fusione tra la membrana cellulare e la membrana lipidica del liposoma. Dopo 30 minuti, si toglie il terreno dalle Petri prestando particolare attenzione a non toccarne il fondo per evitare di staccare le cellule in adesione. Successivamente si sostituisce il terreno con del DMEM (terreno di coltura) fresco e si aggiunge la soluzione trasfettante con dei movimenti concentrici: essendo una soluzione tossica dev’essere sparsa su tutta la superficie della Petri in modo che non muoiano troppe cellule e in modo che tutte o il maggior numero possibile vengano trasfettate. Ė importante non inserire proteine, in questo passaggio, nel terreno di coltura poiché queste potrebbero essere inglobate al posto del plasmide portando ad una trasfezione scorretta ed inefficiente. Le Petri contenenti la soluzione trasfettante vanno lasciate in termostato per 6 ore in modo che l’entrata del plasmide possa avvenire in modo corretto. Trascorso questo lasso di tempo si procede con un ricambio del terreno e si lasciano incubare le Petri contenenti le cellule trasfettate per 48 ore in modo che riescano ad esprimere sulla loro superficie le emoagglutinine virali di interesse per l’esperimento. In questo passaggio è molto importante non inserire antibiotici nel terreno di coltura: questo perché l’azione del farmaco potrebbe rallentare il metabolismo 21 cellulare impedendo la corretta entrata dei plasmidi all’interno delle cellule e la corretta sintesi delle proteine che verranno espresse sulla superficie. Trascorse le 48 ore si preparano le cellule trasfettate per la lettura al FACS. 3.11.1. Lettura al FACS dei risultati ottenuti Come primo step si devono staccare tutte le cellule dal fondo della Petri ed eseguire 2 lavaggi con una soluzione salina (PBS) per poter eliminare tutto il terreno di coltura; fonte di disturbo per le successive elaborazioni del campione. L’ultimo lavaggio viene eseguito con del MACS Buffer: una soluzione contenete EDTA che impedisce l’aggregazione delle cellule. A questo punto le cellule sono state colorate con Trypan Blue e messe nella camera di conta in modo da determinarne la quantità e la vitalità ad ogni concentrazione in analisi. Una volta annotati questi risultati, importanti nella fase finale dell’esperimento, ho continuato la preparazione dei campioni per la lettura con il FACS. In una piastra da 96 pozzetti ho pipettato 50'000 cellule per pozzetto di ogni campione a disposizione compresi anche i controlli negativi, importanti per preparare le impostazioni del FACS d’analisi. Successivamente ho eseguito una centrifugazione delle cellule ed un’incubazione di 1 ora in ghiaccio con uno specifico anticorpo (HUFI6) capace di legarsi all’antigene (emoagglutinina) da analizzare. Trascorso il tempo di incubazione, ho proseguito con dei lavaggi delle cellule per eliminare tutti gli anticorpi non legati al mio antigene e, come ultima incubazione, ho aggiunto un anticorpo anti‐IgG umane, legato ad un fluoroforo: DyLight 649‐Conjugated Affini Pure F(ab’)2 Fragment Goat Anti‐Human IgG, Fc, Fragment Specific. Il frammento della regione variabile F(ab’)2 di questo anticorpo secondario è costituito da anticorpo di capra, in grado quindi di riconoscere e legarsi alla regione costante degli anticorpi umani. Anche questa incubazione é avvenuta in ghiaccio ed é durata 20 minuti al buio. Successivamente sono stati eseguiti ulteriori lavaggi per eliminare l’eccesso ed infine si é eseguita l’analisi con FACS. I risultati ottenuti con il citometro a flusso sono stati ulteriormente analizzati con Flowjo 9.3.1 (TREE STAR Inc., USA), un programma informatico specifico per l’elaborazione dei grafici e delle percentuali. 3.12. Analisi dei sieri al FACS È importante preparare le cellule da utilizzare nella trasfezione per l’espressione dell’emoagglutinina virale specifica. Le 293T/17 vanno piastrate sempre a 4 milioni per Petri e lasciate riposare una notte prima di essere utilizzate, in modo che riescano ad aderire bene al fondo del contenitore. Il giorno successivo si prepara la soluzione trasfettante per ogni emoagglutinina, nella quale verrà poi aggiunta la corretta quantità di plasmide settata precedentemente e dove si aggiungerà poi il Fugene HD per la formazione dei liposomi. Il procedimento risulta essere uguale a quello eseguito per il settaggio, sia per i tempi d’incubazione che per il cambio dei terreni. Trascorse le 48 ore si possono preparare le cellule per lo staining al FACS: anche il questo caso il protocollo rimane invariato unica eccezione fatta per un’incubazione aggiuntiva con anticorpo MUFI6 prima di eseguire l’aggiunta dell’anticorpo primario e del secondario. MUFI6 ha la capacità di legarsi alla stem dell’emoagglutinina, in questo modo quando aggiungiamo l’anticorpo primario siamo in grado di ridurre il segnale mediato da anticorpi presenti nel siero in grado di legare la medesima regione nello stem riconosciuta da MUFI6 e di conseguenza di rilevare specificamente la presenza di anticorpi diretti contro la globular head. Alla fine delle incubazioni le piastre sono pronte per essere lette al FACS. 22 L’apparecchio utilizzato in questo caso non é più il FACS Calibur ma il FACS Canto: il principio di lettura rimane comunque invariato, l’unica differenza consiste, eventualmente, nella programmazione delle impostazioni dell’apparecchio. L’analisi dei risultati è stata eseguita sempre con software Flowjo 9.3.1 (TREE STAR Inc., USA). Figura 8: immagine relativa a quanto succede durante lo staining cellulare. 23 4. Risultati 4.1. Prima parte del lavoro I risultati ottenuti nella prima parte del mio lavoro corrispondono principalmente ai dati riguardanti quantificazioni e settaggi delle varie metodiche utilizzate. Questi dati mi servono per l’elaborazione dei risultati della seconda parte del lavoro. 4.1.1. Quantificazione A/SC e A/NC Principalmente è stata eseguita la trasformazione di E. Coli TOP 10 con plasmidi phCMV1 contenenti la sequenza specifica per l’emoagglutinina da analizzare. Successivamente alla realizzazione di una coltura “midi” in fase liquida ed alla purificazione del plasmide dai batteri con apposito kit Nucleo Spin Plasmid della ditta Macherey‐Nagel (Svizzera), si é quantificato il prodotto ottenuto dall’estrazione con l’uso del Nanodrop. Come viene mostrato nella tabella 1 la quantificazione ed il grado di purezza dei vari campioni hanno portato a dei risultati più che soddisfacenti (non vi sono indici di contaminazioni). Tabella 1: quantificazione dei campioni A/SC e A/NC. Non vi sono né contaminazioni proteiche (rapporto A 260/280 maggiore o uguale a 1.7‐1.8) né di fenoli (rapporto A 260/230 circa attorno ai 2.2). Campione ng/μL 260/280 260/230 A/NC/20/99 328.93 1.89 2.26 A/SC/01/18 320.94 1.87 2.21 4.1.2. Settaggio della PCR per A/CA Sono state analizzate due concentrazioni diverse di DNA con due temperature di anneal dei primer per poter determinare con quali condizioni la PCR da’ dei risultati migliori. Alla fine si é deciso di usare una concentrazione di DNA di 0.3 μg/μL ed una temperatura di annealing dei primer di 60°C (come mostrato in tabella 2). Tabella 2: condizioni in cui la PCR risulta fornire dei risultati migliori. A/CA/04/09 in pcDNA3.1 (0.3 μg/μL) 0.5 μL Temperatura di annealing 60°C La scelta di queste condizioni è stata effettuata successivamente all’esecuzione della quantificazione dei vari campioni ottenuti successivamente alla PCR. In tabella 3 è stato riportato unicamente il risultato ottenuto per il campione migliore a livello di quantificazione che corrisponde alle condizioni iniziali citate in tabella 2. 24 Tabella 3: quantificazione relativa al campione ottenuto successivamente all’applicazione delle condizioni stabilite nella tabella 2. Campione ng/μL 260/280 260/230 A/CA/04/09 67.843 1.78 1.01 4.1.3. Quantificazione dei campioni successivamente a digestione enzimatica Dopo aver effettuato la PCR per poter amplificare la sequenza dell’emoagglutinina di A/CA contenuta nel plasmide pcDNA 3.1. si è proseguito con la migrazione del prodotto PCR su gel di agarosio ed infine alla selezione e purificazione con apposito kit della banda ottenuta (kit usato:GFX PCR DNA and Gel Purification kit della ditta GE‐Healthcare, Svizzera). Il prodotto della purificazione ed il nuovo vettore phCMV1 (dove verrà poi successivamente inserita la sequenza dell’emoagglutinina A/CA) sono stati poi digeriti con appositi enzimi di restrizione (BglII e NotlI) precedentemente selezionati in base alle caratteristiche del plasmide stesso ed alla sequenza specifica dell’emoagglutinina. Dopo di che i prodotti della digestione sono stati nuovamente purificati con il kit precedentemente citato e successivamente quantificati per poter calcolare i corretti ng da utilizzare nella reazione successiva di ligasi. Tabella 4: quantificazione del plasmide phCMV1 e dell’emoagglutinina A/CA successivamente alla digestione enzimatica alla purificazione con apposito kit Campione ng/μL 260/280 260/230 A/CA/04/09 31.09 1.96 0.79 phCMV1 33.06 1.93 0.22 4.1.4. Ligasi Per questa operazione sono stati effettuati tre diversi calcoli per determinare i ng di vettore ed inserto da usare nella reazione di ligasi. Due calcoli mi sono stati forniti in laboratorio mentre il terzo calcolo era indicato dalla ditta fornitrice dell’enzima, la New England BioLabs. Primo calcolo: (ng inserto x kbp vettore)/ (kpb inserto x6) = ng vettore Secondo calcolo: (ng inserto x kbp vettore)/ (kpb inserto x3) = ng vettore Terzo calcolo (non é esattamente un calcolo ma sono delle quantità già definite dalla New England BioLabs) 50 ng vettore 50 ng inserto 25 Tutti i calcoli hanno dato dei risultati positivi, visualizzati tramite PCR e migrazione su gel agarosio 1%. Quindi tutti i campioni ottenuti successivamente alle tre diverse ligasi possono essere potenzialmente utilizzate per il passaggio successivo del mio esperimento che consiste nella trasformazione batterica di E. Coli Top 10 e nell’amplificazione del plasmide contenente l’emoagglutinina di interesse tramite coltura “midi” in fase liquida. 1 2 3 4 2072 bp 1500bp 600 bp 100 bp Figura 9: gel di agarosio all’1%. Da sinistra a destra abbiamo i risultati del primo calcolo (1), rispettivamente del secondo (2) e del terzo (3). In ultima posizione (4) troviamo il Marker 100bp DNA Ladder (Invitrogen, Svizzera). La suddivisione in quadranti è stata effettuata per rendere maggiormente visibili e distinguibili i risultati ottenuti. I campioni positivi hanno una taglia di 1698 bp, mentre quelli negativi hanno una taglia di 83 bp. 4.1.5. Quantificazione A/CA Dopo aver effettuato la trasformazione batterica con il prodotto della ligasi ottenuto precedentemente è stata effettuata una coltura di E. Coli TOP 10 trasformati in brodo di coltura liquido. Trascorso poi il tempo di incubazione necessario affinché vi sia un numero sufficiente di batteri contenenti il plasmide, si è proseguito con l’estrazione del plasmide dal battere e la quantificazione di quanto ottenuto con apparecchio Nanodrop. Tabella 5: risultati relativi alla quantificazione del plasmide phCMV1 con inserto dell’emoagglutinina di A/CA. Campione ng/μL 260/280 260/230 A/CA/04/09 136.8 1.83 2.14 26 4.1.6. Setting al FACS Il setting delle tre emoagglutinine è stato effettuato utilizzando l’apparecchio FACS Calibur per quanto riguarda A/NC e A/SC, mentre FACS Canto per quanto riguarda A/CA. Mostrerò unicamente i grafici dei risultati considerati come utilizzabili. A/CA/04/09 Analisi delle cellule trasfettate con 8 μg/mL del plasmide contenente la sequenza per l’emoagglutinina del virus A/CA/04/09. Figura 10: elaborazione del risultato con Flowjo 9.3.1. Il numero in alto a destra fa riferimento alla percentuale di cellule positive che presentano quindi la fluorescenza (cellule racchiuse all’interno del rettangolo di demarcazione). Sono anche quelle cellule che presentano sulla loro superficie cellulare l’emoagglutinina ricercata. La vitalità delle cellule é risultata essere del 67.9%. A/NC/20/99 e A/SC/01/18 Analisi delle cellule trasfettate con 2 μg/mL del plasmide contente la sequenza per l’emoagglutinina del virus A/NC/20/99 e A/SC/01/18. Figura 11: immagine ottenuta tramite elaborazione del risultato con Flowjo 9.3.1. Il numero in alto a destra fa riferimento alla percentuale di cellule positive che presentano quindi la fluorescenza (cellule racchiuse all’interno del rettangolo di demarcazione). Sono anche quelle cellule che presentano sulla loro superficie cellulare l’emoagglutinina ricercata. A sinistra A/NC/20/99 con vitalità del 95.6%, a destra A/SC/01/18 con vitalità del 89.7%. 27 4.2. Seconda parte del lavoro (analisi preliminari) Analisi di alcuni sieri forniti dall’IRB usando cellule 293T/17 trasfettate con le tre emoagglutinine settate precedentemente ed il plasmide avente la sequenza per l’emoagglutinina di A/Vietnam/1194/04. Analisi effettuata anche su cellule non trasfettate (chiamate Mock), per escludere eventuali legami aspecifici tra gli anticorpi presenti nel siero ed eventuali antigeni presenti sulla superficie cellulare delle 293T/17. Queste analisi preliminari sono state realizzate unicamente per poter valutare la funzionalità dell’esperimento; quindi la capacità da parte degli anticorpi contenuti nei sieri in analisi di riconoscere l’emoagglutinina espressa dopo la trasfezione cellulare. Mock A B C SC CA 28 NC VN Figura 12: sequenza di immagini relativa a sieri appartenenti allo stesso individuo (MTH). Colonna A sono sieri prelevati nel 2008 15 giorni dopo la vaccinazione stagionale, colonna B sono sieri prelevati nel 2009 14 giorni dopo la vaccinazione, mentre nella colonna C abbiamo i sieri prelevati nel 2010 14 giorni dopo la vaccinazione. In alto a desta all’interno di ciascuna immagine sono rappresentate delle percentuali relative al livello di riconoscimento dell’antigene specifico da parte degli anticorpi, sviluppati successivamente alla vaccinazione, contenuti nei sieri in analisi. Il quadrante in alto a destra delle figure ci mostra la percentuale di cellule che sono state riconosciute dagli anticorpi Mock A B C 29 SC CA NC VN Figura 13: sequenza di immagini relativa a sieri appartenenti allo stesso individuo (STH). Colonna A sono sieri prelevati nel 2008 14 giorni dopo la vaccinazione stagionale, colonna B sono sieri prelevati nel 2009 19 giorni dopo la vaccinazione, mentre nella colonna C abbiamo i sieri prelevati nel 2010 14 giorni dopo la vaccinazione. In alto a desta all’interno di ciascuna immagine sono rappresentate delle percentuali relative al livello di riconoscimento dell’antigene specifico da parte degli anticorpi, sviluppati successivamente alla vaccinazione, contenuti nei sieri in analisi Il quadrante in alto a destra delle figure ci mostra la percentuale di cellule che sono state riconosciute dagli anticorpi. 30 Tutti le immagini sopra rappresentate sono state realizzate con software Flowjo 9.3.1 (TREE STAR Inc., USA), un software utilizzato per elaborare i risultati ottenuti con il citometro a flusso (FACS) e che permette la realizzazione di dot plot di vario genere per facilitare la comprensione dei risultati ottenuti. Il grafico riportato nella prossima pagina, invece, è stato realizzato con GraphPad PRISM Version 5.0b (GraphPad Software Inc., USA) un programma ideale per la realizzazione di grafici statistici e di biostatistica. Figura 14: rappresentazione degli eventi positivi relativi ai due pazienti analizzati (MTH e STH). Lo schema in alto fa riferimento ai sieri del paziente STH, come si può ben notare la % di positività degli anticorpi contenuti nei sieri risulta nettamente maggiore per i due virus pandemici ma unicamente per il siero prelevato successivamente alla vaccinazione del 2010. Per il paziente MTH questi risultati non sono nettamente visibili con questo genere di schema. Ad ogni modo si può concludere che in questo caso abbiamo una risposta anticorpale uniforme per tutte le emoagglutinine virali in analisi. 31 4.3. Seconda parte del lavoro (analisi effettiva dei campioni) (Media campione‐media bianco)/media ctr positivo In questa seconda parte del lavoro si è proseguito con l’analisi dei sieri provenienti dall’Istituto San Raffaele di Milano e alcuni sieri forniti dall’IRB collezionati 2‐4 settimane dopo vaccinazioni per l’influenza stagionale e pandemica negli anni 2008, 2009 e 2010. In totale si sono quindi analizzati 67 campioni di cui due controlli; uno positivo realizzato con MUFI6 e HUFI6 e uno negativo realizzato unicamente con MUFI6. Anche in questo caso sono state prima preparate delle 293T/17 trasfettate con le tre emoagglutinine di interesse, l’emoagglutinina dell’isolato H5N1 A/Vietnam/1194/04 (controllo) ed infine una condizione di controllo senza utilizzare il plasmide (Mock). I setting e le condizioni dello staining sono stati mantenuti come già prestabilito negli esperimenti precedenti. I risultati ottenuti con il FACS sono stati da prima elaborati con il software Flowjo 9.3.1 (allegati pp. 7‐ 12) e successivamente si è proseguito con l’elaborazione dei dati numerici tramite Microsoft Office Excel 2007 (allegati pp.13‐17). Come prima cosa si sono esportate tutte le medie geometriche dei valori di fluorescenza dei vari campioni calcolate tramite il software Flowjo 9.3.1, successivamente hai valori ottenuti è stato sottratto il corrispettivo valore del bianco (Mock) in quanto si tratta di un segnale aspecifico. Alla fine è stato effettuato un rapporto tra il valore ottenuto dalla sottrazione del bianco e il valore corrispondente al controllo positivo che fornisce il valore massimo di positività del campione. Il valore ottenuto dal rapporto tra media del campione e media del controllo viene riportato sull’asse delle y del mio grafico a colonne, mentre l’asse delle x corrisponde al campione in analisi. Per ogni antigene è stato decretata una soglia di positività osservando la capacità di trasfezione cellulare verso quell’antigene e quindi il livello di espressione del controllo positivo. Quindi tutti i valori inferiori al valore soglia sono da considerare negativi mentre tutti i valori superiori a questo valore soglia sono da considerare positivi; pertanto, grazie a questa discriminazione, si è potuto realizzare, oltre alle tabelle in Microsoft Office Excel 2007, anche degli istogrammi con il software GraphPad PRISM Version 5.0b. Per migliorare la comprensione del grafico sono stati suddivisi i campioni sia per anno di prelievo che per luogo di provenienza (o IRB o Istituto San Raffaele di Milano), in modo che il confronto risulti facilitato. A/CA/04/09 32 (Media campione‐media bianco)/media ctr positivo (Media campione‐media bianco)/media ctr positivo A/SC/1/18 A/NC/20/99 33 A/Vietnam/1194/04 (Media campione‐media bianco)/media ctr positivo Figura 15: Grafici relativi a tutti gli antigeni analizzati in questa seconda parte dell’esperimento. Sull’asse delle x abbiamo i sieri con i rispettivi nomi assegnati dai due istituti. D1‐D34 sono i sieri forniti dall’Istituto San Raffaele di Milano, mentre quelli con nominativi tutti diversi tra di loro sono quelli forniti dall’IRB. I sieri sono stati suddivisi per istituto, anno di vaccinazione e prelievo del siero. Sull’asse delle y sono riportati i risultati ottenuti al rapporto tra media del campione e del controllo positivo. La linea orizzontale y=1 per l’antigene CA e y=1 per tutti gli altri antigeni corrisponde alla soglia di positività dei campioni. 34 5. Discussione 5.1. Prima parte del lavoro In questa prima parte del lavoro ho impostato le condizioni generali degli esperimenti affinché, nella seconda parte del lavoro, si riuscissero ad ottenere i risultati corretti e attesi. Come primo passo ho dovuto settare la PCR per HA di A/CA/04/09 in modo che, con la corretta concentrazione di DNA e la corretta temperatura, si ottenesse una concentrazione finale di amplificato soddisfacente. Per arrivare al risultato finale ho testato due temperature diverse di anneal e due concentrazioni diverse di DNA, per un totale di quattro PCR diverse. Le temperature da porre in analisi sono state decise basandosi sulla temperatura di anneal fornita dalla ditta al momento della realizzazione dei primer e le concentrazioni di DNA usate sono state decise basandosi sul range di concentrazioni suggerite dal protocollo PCR fornitomi in laboratorio. Come risultato finale si é quindi ottenuto che la temperatura ideale di anneal corrisponde a 60°C e la concentrazione ideale di DNA corrisponde a 0.3 μg/μL. In questo modo la quantificazione del materiale genetico ottenuto è risultata soddisfacente (67.843 ng/μL), mentre gli altri campioni non hanno fornito alcun risultato visibile su gel di agarosio. Il passaggio successivo consiste nell’eseguire la digestione enzimatica, la ligasi e la trasformazione batterica per poter ottenere un numero sufficiente di plasmidi da utilizzare nella seconda parte del mio lavoro. La trasformazione batterica é stata eseguita per tutte e tre le HA, mentre la digestione enzimatica e la ligasi sono state eseguite unicamente per l’HA dell’influenza suina. Infatti è l’unica sequenza alla quale ho dovuto cambiare il vettore (da pcDNA3 a phCMV1). I risultati ottenuti nella ligasi, come si vede bene dalla figura 7, tramite confronto dei tre diversi calcoli per determinare la corretta quantità di vettore e inserto da usare nell’esperimento, hanno fornito tutti dei risultati positivi. Osservando bene il gel di agarosio si é potuto notare che il calcolo che apparentemente risulta essere migliore é il primo (cioè il calcolo fornitomi dal laboratorio): (ng inserto x kbp vettore)/ (kpb inserto x6) = ng vettore. Purtroppo il sito della ditta New England BioLabs (USA), da dove ho ricavato le quantità di plasmide e rispettivamente di vettore da usare durante l’operazione di ligasi, non mi fornisce nessuna motivazione chiara sul perché di queste quantità specifiche [24]. I calcoli forniti invece dal laboratorio derivano da una calcolo fornito dalla ditta Promega (Svizzera) e sono stati adattati secondo le esigenze sperimentali del laboratorio stesso [25]. Alla fine di questa prima parte ho potuto settare le corrette concentrazioni di plasmide per le tre HA da usare durante il processo di trasfezione. I risultati sono stati visualizzati al FACS, e basandosi sulla percentuale di mortalità delle cellule e, rispettivamente, sulla percentuale di antigene di interesse presentato sulle cellule 293T/17 trasfettate ho potuto determinare la concentrazione ideale da utilizzare durante la trasfezione. Essendo il plasmide tossico per le cellule, é importante trovare una sorta di equilibrio tra la mortalità e la percentuale di antigene espresso. Ed é inoltre molto importante, relazionare tra di loro tutte le emoagglutinine trovando un valore simile per tutte e tre rendendo i risultati il più possibile omogenei tra di loro. Purtroppo quest’ultima parte risulta estremamente difficile da realizzare: infatti osservando i risultati precedenti ottenuti al punto 4.1.5. é ben visibile la differenza di espressione tra le tre HA, mentre per quanto riguarda la vitalità delle cellule i valori sono molto simili. 35 Come già suggerito precedentemente, questo passaggio serve per fornire una base solida dove poter costruire tutto il resto dell’esperimento di cross‐reattività, dimostrando quanto affermato nell’obiettivo del lavoro. 5.2. Seconda parte del lavoro (analisi preliminari) In questa seconda parte del lavoro sono state effettuate delle analisi preliminari unicamente su alcuni sieri forniti dall’IRB, in modo da poter valutare l’eventuale presenza di sostanze interferenti con il legame antigene anticorpo e quindi la funzionalità dell’esperimento stesso. Per migliorare la comprensione dei risultati sono stati testati anche i sieri degli stessi pazienti un anno prima e un anno dopo all’esecuzione della vaccinazione contro l’influenza suina. Queste due tipologie di sieri sono stati prelevati nel periodo 2008/2009 e rispettivamente nel periodo 2010/2011 successivamente all’esecuzione della vaccinazione contro l’influenza stagionale dell’anno in corso in un periodo di tempo che varia dai 14 ai 20 giorni dopo l’esecuzione della vaccinazione, quindi quando abbiamo una concentrazione di anticorpi massima. I sieri sono stati testati con una diluizione standard di 1/500. Come prima cosa si sono realizzate le trasfezioni delle cellule 293T/17 con i plasmidi contenenti le sequenze per le tre emoagglutinine in analisi ed un plasmide contenente la sequenza per l’emoagglutinina del virus Vietnam (H5), successivamente sono stati testati i sieri per poter osservare il risultato a contatto con i vari antigeni. L’analisi dei sieri con le cellule Mock, quindi le cellule che non sono state trasfettate con i plasmidi, ci permette di escludere un eventuale legame specifico tra gli anticorpi e gli antigeni di superficie delle cellule utilizzate. Come si può ben notare dai risultati ottenuti non c’è nulla di particolare che va segnalato. Mettendo a contatto i sieri con le cellule trasfettate con il plasmide contenente la sequenza dell’emoagglutinina del virus Vietnam, si determina invece la presenza di eventuali anticorpi diretti contro la stem delle emoagglutinine che potrebbero portarci ad una falsa interpretazione dei risultati. Infatti l’anticorpo secondario DyLight è in grado di legarsi alla regione costante degli anticorpi di origine umana; pertanto se abbiamo, oltre agli anticorpi di interesse che riconoscono delle regioni specifiche della globular head, anche degli anticorpi che riconoscono e si legano alla stem avremo un aumento della fluorescenza detettata dal FACS che potrebbe portare a delle conclusioni errate. Per evitare questo genere di problemi è stato aggiunto l’anticorpo murino MUFI6 capace di riconoscere e legarsi alle regioni della stem delle varie emoagglutinine impedendo o comunque riducendo il legame tra gli anticorpi contenuti nel siero e la stem stessa. L’anticorpo murino non viene legato nella regione costante dall’anticorpo secondario DyLight; in questo modo la fluorescenza è direttamente proporzionale alla presenza di anticorpi che si sono legati alla globular head dell’emoagglutinina. Grazie all’aggiunta dell’anticorpo murino possiamo essere sicuri che la percentuale ricavata dall’analisi al FACS delle tre emoagglutinine corrisponda effettivamente alla percentuale di anticorpo legato unicamente alla globular head. Pertanto confrontando le immagini relative alle tre emoagglutinine possiamo giungere alla conclusione che i sieri successivi alla vaccinazione eseguita nel 2010/2011 riconoscono molto bene sia la globular head del virus della spagnola che quello della suina confermando il nostro obiettivo del lavoro (soprattutto questo risultato lo si vede bene nel siero STH). Se osserviamo, oltre all’immagine, anche le percentuali ci accorgiamo infatti che numericamente si situano molto vicine tra di loro: nel primo caso abbiamo un 10.7% contro un 12.9% mentre nel secondo abbiamo un 31.1% contro un 29.6%. Per quanto riguarda il riconoscimento dell’emoagglutinina del virus stagionale invece la percentuale 36 risulta praticamente nulla per entrambi i pazienti. I sieri prelevati negli anni 2008/2009 e 2009/2010 non mostrano alcun segno di riconoscere e legare i tre antigeni in analisi. 5.3. Seconda parte del lavoro (analisi effettiva dei campioni) In questa seconda parte del lavoro si sono testati i sieri dei pazienti vaccinati contro l’influenza suina del 2009 (SOIV), per poter verificare la loro capacità di riconoscere e legarsi unicamente alle due emoagglutinine pandemiche come già precedentemente dichiarato nell’introduzione e nell’obiettivo del lavoro [1]. Le analisi sono state eseguite rispettando tutte le condizioni già usate nell’esperimento preliminare. Il numero di campioni è notevolmente aumentato in quanto sono compresi anche i sieri dei pazienti forniti dall’Istituto San Raffaele di Milano e anche alcuni sieri forniti dall’IRB degli anni 2008, 2009 e 2010. I sieri italiani sono stati prelevati successivamente a 1 mese dall’esecuzione della vaccinazione contro l’influenza suina con vaccino Focetria mentre gli altri sieri forniti dall’IRB sono stati prelevati successivamente a 14‐30 giorni dall’esecuzione della vaccinazione specifica (tempo necessario affinché il sistema immunitario riesca a riconoscere l’antigene e a sviluppare una risposta immunitaria). Come già evidenziato nell’introduzione, ricordo la composizione dei vaccini usati per poter facilitare la comprensione dell’analisi: Nome Tipologia Dose A (H1N1) A (H3N2) B Influvac 2008/2009 Stagionale 0.5 mL A/Brisbane/59/2007 Brisbane/10/2007 B/Florida/4/2006 Influvac 2009/2010 Stagionale 0.5 mL A/Brisbane/59/2007 A/Brisbane/10/2007 B/Brisbane/60/2008 Pandemrix10 Pandemico 0.5 mL A/California/7/2009 ‐ ‐ Focetria Pandemico 0.5 mL A/California/7/2009 ‐ ‐ Influvac 2010/2011 Stagionale 0.5 mL A/California/7/2009 A/ Perth/16/2009 B/Brisbane/60/2008 9 Osservando i grafici elaborati con software Prism (pp.32‐34) si può notare che i campioni prelevati nel 2010, quindi successivamente a una prima vaccinazione nel 2009 contro l’influenza suina e un richiamo successivo eseguito nell’inverno del 2010, hanno una risposta immunitaria maggiorata nei confronti dell’antigene in questione. Questo è dovuto al fatto che abbiamo lo sviluppo di una risposta immunitaria che può essere considerata secondaria all’antigene successivamente alla riesecuzione, nel 2010, della vaccinazione contenente l’emoagglutinina del virus della suina. Grazie a questa seconda vaccinazione abbiamo la formazione di una risposta immunitaria più rapida e quantitativamente più efficace verso l’antigene della suina [26]. Quanto detto è facilmente dimostrabile con la visualizzazione dei grafici relativi ai campioni negli anni 2008 e 2009 dove si può osservare chiaramente che la maggioranza dei campioni risulta essere negativa al riconoscimento dell’emoagglutinina della suina. 9 Influvac della ditta Solvay (Svizzera) 10 Pandemrix della ditta GlaxoSmithKline (Svizzera) 37 Figura 13: immagine rappresentante la risposta immunitaria primaria e la risposta immunitaria secondaria. In una risposta immunitaria secondaria (quindi entrata in contatto per la seconda volta con lo stesso antigene), avremo una risposta anticorpale quantitativamente maggiore verso quell’antigene e più rapida rispetto alla primaria [33]. Nei sieri del 2010, come già detto precedentemente, notiamo molto chiaramente una risposta immunitaria elevata per l’antigene della suina e quello dell’influenza spagnola del 1918; chiaro segno che effettivamente le due emoagglutinine in analisi mostrano una certa similitudine strutturale e, pertanto, risulta essere possibile il confronto a livello di risposta immunitaria. Osservando contemporaneamente i grafici ottenuti dall’analisi dei risultati per la suina e per la Spagnola possiamo notare che una risposta anticorpale significativa è visibile a partire dal 2009 con l’iniezione della prima dose di vaccino contro l’influenza suina. Nel 2010 questa risposta immunitaria risulta essere maggiorata per entrambi le situazioni facilitando quindi la dimostrazione dell’obiettivo principale del mio lavoro: dimostrare la capacità dei sieri appartenenti ai pazienti vaccinati nel 2009 contro l’influenza suina di cross‐neutralizzare anche il virus dell’influenza spagnola del 1918. Come si è potuto notare durante l’analisi dei risultati la risposta anticorpale dei sieri risulta essere maggiorata nei confronti di entrambe le emoagglutinine solamente ad una seconda vaccinazione; cioè quando si è instaurata una risposta immunitaria secondaria. Per quanto riguarda l’analisi dell’emoagglutinina del virus influenzale stagionale del 1999, possiamo notare una considerevole risposta immunitaria da parte di tutti i sieri. Come possiamo vedere dal grafico, questa risposta risulta essere distribuita in modo omogeneo sull’arco di tutti e tre gli anni; pertanto può essere considerata come una semplice risposta anticorpale di tipo secondario ad epitopi conservati presenti negli antigeni presenti nei vaccini stagionali e pandemici usati per gli esperimenti. Il riconoscimento da parte di alcuni individui del virus H5 Vietnam è spiegabile con la presenza di anticorpi diretti contro regioni della stem dell’emoagglutinina. Il legame avviene nelle regioni della stem non bloccate dall’anticorpo monoclonale di origine murina MUFI6 [11]. 38 6. Conclusioni Alla fine di questo lavoro posso concludere di che: i sieri dei pazienti vaccinati contro l’influenza suina del 2009 (SOIV) sono in grado di riconoscere le emoagglutinine appartenenti ai due virus pandemici A/CA/04/09 e A/SC/01/18; riconoscimento che viene però migliorato durante una risposta immunitaria di tipo secondario a seguito della vaccinazione nell’anno 2010 che includeva come strain vaccinale il virus pandemico (ora definito stagionale) A/CA/04/09. Come già scritto precedentemente nell’introduzione la cross‐neutralizzazione di questi due antigeni così temporalmente distanti tra di loro è dovuta ad una maggior conservazione della struttura amminoacidica (95% della conservazione amminoacidica della globular head) rispetto ai virus stagionali che presentano invece un maggior numero di siti di glicosilazione (a livello dell’aminoacido asparagina) in grado di mascherare ampie regioni della superficie proteica dell’emoagglutinina, che non sono cosi disponibili quali siti antigenici [1]. Risulta essere molto difficile fare delle proposte di miglioramento per questo genere di esperimenti in quanto sono da prendere in considerazione diversi fattori e diverse variabili che possono influire in modo sia positivo che negativo sulla riuscita delle analisi. Per completare ulteriormente i dati sarebbe stato utile testare i sieri su virioni per verificare la loro effettiva capacità di inibire l’emoagglutinina, ma purtroppo questo tipo di esperimento richiede l’utilizzo di virioni interi non inattivati, e per ovvie ragioni di sicurezza il virioine della Spagnola del 1918 non risulta essere disponibile (solo pochissimi laboratori al mondo hanno il permesso di usarlo). Inoltre, avendo riscontrato che molti sieri anche un mese dopo la prima vaccinazione risultano poco o non del tutto reattivi con il virus vaccinale (suino), sarebbe stato interessante capire dopo quanto tempo si è prodotta una risposta anticorpale virus specifica in seguito alla prima vaccinazione e se questa risposta più o meno positiva verso il virus è da correlare a delle caratteristiche del paziente in analisi (tendenza a vaccinarsi tutti gli anni, età, sesso, …). 39 7. Bibliografia [1] Itoh Y et al. 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Ringraziamenti Ringrazio in primis l’Istituto di Ricerca in Biomedicina di Bellinzona (IRB) per avermi fornito i mezzi e l’opportunità di svolgere questo lavoro di diploma, in particolar modo il direttore dell’istituto di Antonio Lanzavecchia e la Group Leader Federica Sallusto. Successivamente ringrazio caldamente tutti gli operatori dell’istituto e non che mi hanno sostenuta e aiutata nella realizzazione del lavoro sia a livello pratico che teorico: Davide Corti (PhD) per la correzione della parte scritta del lavoro, la progettazione e il coordinamento del progetto in ambito pratico; Blanca M. Fernandez‐Rodriguez (TAB) per le spiegazioni e il supporto durante l’esecuzione degli esperimenti e David Jorrassay per la formazione e le spiegazioni riguardanti l’utilizzo del citometro a flusso (FACS). Ringrazio inoltre gli altri membri del laboratorio come Debora Pinna, Chiara Sillacci e Andrea Minola che mi hanno aiutata in alcune fasi durante lo svolgimento pratico del lavoro. Ringrazio inoltre la Dott.ssa Elisa Vicenzi dell’Istituto Scientifico San Raffaele di Milano (DIBIT) per avermi fornito i sieri necessari alla seconda fase degli esperimenti. 42 I. Allegati I. Plasmide phCMV1 (Genlantis, San Diego CA) Figura 14: struttura del plasmide phCMV1 (altamente consigliato per la codificazione di proteine nella loro struttura nativa) con sequenza di MCS e localizzazione dei vari siti di taglio di alcuni enzimi di restrizione 1 Introduction The phCMV series of vectors are designed to achieve significantly higher expression levels than traditional human cytomegalovirus (CMV) promoter‐based constitutive expression vectors. Through their maximized CMV promoter activity, the maximized levels of protein expressed from the phCMV vectors will allow you to easily proceed to subsequent protein detection and functional studies. In order to achieve maximum expression levels, the CMV promoter/enhancer sequence in the phCMV vectors have been systematically modified so that only the necessary sequences that confer high transcriptional activity are retained. In addition to the optimized CMV promoter, the phCMV vector includes the intron A from the human CMV immediate‐early (IE) gene and an efficient artificial terminator to ensure the highest transcription levels possible. The backbones of the phCMV vectors have also been rigorously engineered to provide both high plasmid yield in E. coli and enhanced expression levels in vivo. This makes the phCMV vectors ideal tools for routine protein expression studies as well as animal injection experiments. The phCMV vectors consistently deliver superior expression levels when compared with other commercially available CMV promoter‐based expression vectors. It is not unusual to obtain protein expression levels from phCMV that are several fold higher than those obtained from other popularly used vectors. In addition, because phCMV vectors use the Kan/Neo gene for selection in both bacteria and cultured cell lines, they offer smaller vector sizes and improved transfection efficiency. In summary, the three phCMV vectors offer the following benefits: • Maximized high‐level expression with optimized CMV promoter. • G418 resistance gene for the selection of stable cell lines. • Optional N‐ or C‐terminal HA fusion tags for simplified protein detection and purification with anti‐ HA antibodies and affinity resins. • Extensive multiple cloning region for convenient and easy cloning. • Small vector sizes for efficient transfection Figura 15: caratteristiche principali del vettore 2 II. Plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) Figura 16: struttura del plasmide pcDNA3.1 Figura 7: caratteristiche principali del vettore pcDNA 3.1 3 III. Sequenze delle 3 emoagglutinine in analisi nel lavoro di diploma i. HA A/CA/04/09 ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGA ACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACA AGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATC CTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACACCTAGTTCAGACAAT GGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAG GTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGC TGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTA CATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCT CTATCAGAATGCAGATACATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAG ACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTC GAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCA GATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAAACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATA TACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAAT ATCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGA TGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCA TTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCA ACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCG AACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAA GAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAACGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGC ATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGA TGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTTTGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGT AGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCTAATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATT ii. HA A/SC/1/18 CCCGGGTACCGTCAAAATGGAGGCAAGACTGCTGGTCCTGCTGTGCGCCTTCGCCGCTACTAATGCTGACACTATCTG TATCGGCTATCACGCCAACAATTCTACTGACACCGTGGATACCGTCCTGGAGAAGAACGTGACAGTCACTCACAGTGT GAACCTGCTGGAAGACTCACATAATGGAAAGCTGTGCAAGCTGAAAGGCATCGCCCCCCTGCAGCTGGGGAAATGCA ACATTGCTGGGTGGCTGCTGGGAAATCCTGAGTGTGATCTGCTGCTGACAGCCAGCTCCTGGTCCTACATCGTGGAGA CAAGTAACTCAGAAAATGGCACTTGCTACCCTGGGGACTTTATTGATTATGAGGAACTGAGAGAGCAGCTGAGCAGC GTGAGCAGCTTCGAGAAGTTTGAAATCTTCCCAAAAACTTCCTCTTGGCCCAACCACGAAACCACAAAGGGAGTGACC GCCGCTTGTTCTTACGCCGGCGCTAGTTCATTCTATCGGAATCTGCTGTGGCTGACCAAGAAAGGCAGCTCCTACCCAA AGCTGAGCAAATCCTATGTGAACAATAAGGGGAAAGAGGTGCTGGTCCTGTGGGGAGTCCACCATCCCCCTACCGGC ACAGACCAGCAGTCTCTGTACCAGAACGCAGATGCCTATGTGAGTGTCGGGTCTAGTAAGTACAATCGGCGGTTCACC CCTGAGATCGCAGCACGACCAAAAGTGCGGGACCAGGCAGGACGAATGAACTACTATTGGACACTGCTGGAGCCTG GGGATACTATCACCTTTGAAGCAACTGGAAACCTGATTGCCCCATGGTATGCTTTCGCACTGAATCGCGGATCTGGCA GTGGGATCATTACTAGCGACGCACCAGTGCACGATTGCAACACCAAGTGTCAGACACCCCATGGCGCCATCAACTCAA GCCTGCCCTTCCAGAATATCCACCCTGTGACCATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTCAGAAGCACTAAACTGAGGATGG CCACCGGCCTGCGCAATATCCCCTCAATTCAGAGCCGAGGCCTGTTTGGGGCCATCGCTGGCTTCATTGAGGGCGGGT GGACCGGGATGATCGACGGATGGTACGGCTATCACCATCAGAACGAACAGGGAAGCGGCTACGCTGCAGACCAGAA GTCCACCCAGAATGCCATCGATGGGATTACAAACAAGGTCAATTCCGTCATTGAGAAAATGAACACACAGTTTACTGC TGTGGGAAAAGAATTCAACAATCTGGAGAGGCGCATCGAAAACCTGAATAAGAAAGTGGACGATGGCTTTCTGGATA TTTGGACCTACAACGCCGAGCTGCTGGTCCTGCTGGAGAATGAACGGACACTGGACTTCCACGATTCAAACGTGAGA AATCTGTATGAAAAGGTCAAAAGCCAGCTGAAGAACAATGCTAAAGAGATCGGGAATGGATGTTTCGAGTTCTACCA TAAGTGCGACGATGCATGTATGGAGAGCGTGAGGAACGGCACATACGACTATCCCAAGTATTCCGAGGAATCTAAAC TGAATCGCGAGGAAATTGATGGGGTGAAGCTGGAATCCATGGGAGTCTACCAGATCCTGGCTATCTACTCTACTGTG GCATCCTCTCTGGTGCTGCTGGTCAGTCTGGGGGCTATCTCCTTCTGGATGTGCTCAAATGGGTCCCTGCAGTGTAGA ATCTGTATCTAAAGCGGCCGCGACT 4 iii. HA A/NC/20/99 CCCGGGTACCGTCAAAATGAAAGCCAAACTGCTGGTCCTGCTGTGCACCTTCACCGCAACCTACGCCGACACTATCTG TATTGGGTATCACGCTAACAACTCCACCGACACAGTGGATACCGTCCTGGAGAAGAACGTGACTGTCACCCACAGTGT GAACCTGCTGGAAGACTCACATAATGGGAAGCTGTGCCTGCTGAAAGGAATCGCACCACTGCAGCTGGGAAACTGCA GCGTGGCAGGATGGATTCTGGGGAATCCCGAGTGTGAACTGCTGATCTCCAAGGAGTCATGGAGCTACATTGTGGAG ACTCCAAACCCCGAAAATGGAACCTGCTACCCCGGCTATTTTGCCGATTATGAGGAACTGCGGGAGCAGCTGAGCTCC GTGTCTAGTTTCGAGAGATTTGAAATCTTCCCTAAAGAATCAAGCTGGCCAAATCACACAGTGACTGGGGTCTCCGCC TCTTGTAGTCATAACGGAAAGTCCTCTTTCTACCGAAATCTGCTGTGGCTGACAGGCAAAAACGGGCTGTACCCTAATC TGTCAAAGAGCTATGTGAACAATAAGGAGAAAGAAGTGCTGGTCCTGTGGGGAGTCCACCATCCACCTAACATCGGG AATCAGCGCGCTCTGTACCACACCGAGAACGCATATGTGAGCGTGGTCAGTTCACATTACAGCCGGCGGTTCACCCCA GAGATCGCAAAGCGACCTAAAGTGCGGGACCAGGAAGGCAGGATTAATTACTATTGGACACTGCTGGAGCCCGGCG ATACTATCATTTTCGAAGCCAACGGGAATCTGATCGCTCCTTGGTATGCATTTGCCCTGAGCCGCGGATTCGGATCCGG AATCATTACTTCTAACGCCCCTATGGACGAGTGCGATGCTAAGTGTCAGACCCCACAGGGCGCCATCAACAGCTCCCT GCCATTTCAGAATGTGCACCCCGTCACTATTGGAGAGTGCCCTAAATACGTGCGGAGCGCCAAGCTGAGGATGGTCA CCGGCCTGCGCAACATCCCATCCATTCAGAGCCGGGGCCTGTTTGGCGCTATCGCAGGATTCATTGAGGGAGGATGG ACCGGAATGGTGGACGGATGGTACGGATATCACCATCAGAATGAACAGGGATCTGGCTACGCCGCTGATCAGAAGA GTACCCAGAACGCTATCAATGGGATTACAAACAAAGTGAATAGCGTCATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCA GTGGGCAAGGAGTTCAACAAGCTGGAGAGGCGCATGGAAAACCTGAATAAGAAAGTGGACGATGGCTTTCTGGACA TTTGGACATACAACGCAGAGCTGCTGGTCCTGCTGGAGAATGAAAGAACTCTGGACTTCCACGATTCTAACGTGAAAA ATCTGTATGAGAAGGTCAAAAGCCAGCTGAAGAACAATGCTAAAGAGATCGGGAACGGATGTTTCGAGTTCTACCAT AAGTGCAACAATGAGTGTATGGAATCCGTGAAAAACGGCACATACGACTATCCCAAGTATAGTGAGGAATCAAAGCT GAATCGGGAGAAAATTGATGGGGTGAAGCTGGAAAGCATGGGAGTCTACCAGATCCTGGCAATCTACTCCACTGTGG CCTCTAGTCTGGTGCTGCTGGTCTCTCTGGGGGCTATTTCATTTTGGATGTGCTCTAACGGGTCCCTGCAGTGTAGGAT CTGTATCTAAAGCGGCCGCGACT Le sequenze sono state eseguite dalla ditta Microsynth e visualizzate con programma per il computer chiamato FinchTV. 5 IV. Confronto tra la sequenza amminoacidica delle tre emoagglutinine in analisi Figura 21: sequenze aminoacidiche delle tre emoagglutinine in analisi. In verde sono evidenziati gli amminoacidi altamente conservati della stem, in blu quelli altamente conservati della globular head mentre in rosso sono evidenziati gli amminoacidi glicosilati che determinano quindi un notevole cambiamento a livello del riconoscimento anticorpale dell’emoagglutinina. Come si può ben notare i cambiamenti più significativi sono a carico dell’emoagglutinina del virus influenzale New Caledonia (influenza stagionale). L’allineamento delle sequenze amminoacidi che è stato effettuato con CLC Maniworkbench 6 V. Risultati ottenuti al FACS ed elaborato con Flowjo 9.3.1 Schema dei campioni analizzati che può essere applicato ai risultati riportati immediatamente sotto; da notare che tutti i sieri sono stati diluiti 1/500 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 D28 D29 D30 D31 D32 D33 D34 STH 08 MTH08 SNA 08 RBE 08 GDA 08 DCO 08 ALA 09 EBR 09 GCO 09 STH 09 JCH 09 MTH 09 STH 09 ISA 09 GNDA 09 DPI 09 DCO 09 DLI 10 DCO 10 HSR 10 DPI 10 GBO 10 RBE 10 STH 10 MTH 10 AKA 10 CSI 10 TBR 10 STH10 MMI 10 BGU 10 CTR + CTR - MOCK 7 A/CA/04/09 8 A/SC/1/18 9 A/NC/20/99 10 Vietnam 11 12 VI. Risultati elaborati con Flowjo 9.3.1 e rivisti con Microsoft Office Excel 2007 Tabella A Normalizzazione dei risultati (media geometrica) T1 D1 T1 D2 T1 D3 T1 D4 T1 D5 T1 D6 T1 D7 T1 D8 T1 D9 T1 D10 T1 D11 T1 D12 T1 D13 T1 D14 T1 D15 T1 D16 T1 D17 T1 D18 T1 D19 T1 D20 T1 D21 T1 D22 T1 D23 T1 D24 T1 D25 T1 D26 T1 D27 T1 D28 T1 D29 T1 D30 T1 D31 T1 D32 T1 D33 T1 D34 STH 14D 2008 MTH 15D 2008 SNA 14D 2008 RBE 14D 2008 GDA 15D 2008 DCO 15D 2008 ALA 14D 2009 EBR 1 MO 2009 GCO 14D 2009 STH FLU 2009 JCH 17D 2009 Mock 444 368 268 256 455 312 632 304 298 209 301 382 308 230 263 223 276 327 346 242 366 397 302 418 819 430 462 495 312 416 448 259 224 341 196 265 329 502 416 295 288 224 300 183 262 CA 159 711 311 749 306 549 584 543 1379 662 783 525 425 345 467 618 295 711 490 498 468 1473 513 964 1544 560 1346 927 387 1175 873 414 807 877 383 529 474 612 471 451 335 1132 673 307 1018 13 SC 3151 2075 1318 1611 1503 1744 2305 1825 6375 2565 2479 1611 1785 1278 1793 2817 1120 1929 1800 3221 1317 7898 2186 1583 4768 2899 7164 3170 2373 4406 1426 1819 3192 1933 924 1660 3197 3569 3966 7006 1323 6419 4384 640 3574 NC 1864 2156 1030 1557 1393 880 1860 1009 4123 1115 756 1518 1227 705 981 1603 2354 1445 1621 1514 1383 2229 2085 1197 1615 1569 1306 766 1776 929 3011 2112 3357 1954 1049 1098 1147 1543 3605 5963 1976 1771 2608 2589 1595 VN 477 551 373 573 526 465 792 896 658 490 388 522 549 492 728 449 544 1025 510 455 616 751 587 724 796 472 447 444 316 435 474 317 381 293 269 423 672 657 1060 534 599 594 938 299 477 MTH 14D 2009 STH 19D 2009 ISA 17D 2009 GNDA 1 MO 2009 DPI 17D 2009 DCO 14D 2009 DLI 21D 2010 DCO 14D 2010 HSR 14D 2010 DPI 14D 2010 GBO 21D 2010 RBE 14D 2010 STH 14D 2010 MTH 14D 2010 AKA 21D 2010 CSI 14D 2010 TBR 21D 2010 STH 14D 2010 MMI 14D 2010 BGU 14D 2010 HUFI6 MUFI6 245 196 277 314 574 334 423 304 437 591 282 597 182 273 271 462 319 199 310 305 322 156 627 318 615 1056 849 2209 679 2274 3330 3251 2579 2078 3037 3604 2250 540 1737 3038 2035 846 1004 215 2553 928 2693 2610 3270 12490 1589 10630 5528 5443 5738 6414 6845 6702 7886 2421 14334 14853 14714 4291 8790 320 1439 801 1248 819 1669 4067 914 3336 1873 2072 991 1321 562 1794 2145 2442 4195 1405 3114 1324 2658 215 Tabella B Sottrazione dei valori normalizzati del bianco ai valori ottenuti dai vari antigeni in analisi T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 CA -285 343 43 493 -149 237 -48 239 1081 453 482 143 117 115 204 395 19 384 144 256 102 1076 211 546 SC 2707 1707 1050 1355 1048 1432 1673 1521 6077 2356 2178 1229 1477 1048 1530 2594 844 1602 1454 2979 951 7501 1884 1165 14 NC 1420 1788 762 1301 938 568 1228 705 3825 906 455 1136 919 475 718 1380 2078 1118 1275 1272 1017 1832 1783 779 VN 33 183 105 317 71 153 160 592 360 281 87 140 241 262 465 226 268 698 164 213 250 354 285 306 939 372 637 627 748 432 344 331 595 705 304 517 296 630 459 2689 312 1657 1523 1724 1640 835 T1 D25 T1 D26 T1 D27 T1 D28 T1 D29 T1 D30 T1 D31 T1 D32 T1 D33 T1 D34 STH 14D 2008 MTH 15D 2008 SNA 14D 2008 RBE 14D 2008 GDA 15D 2008 DCO 15D 2008 ALA 14D 2009 EBR 1 MO 2009 GCO 14D 2009 STH FLU 2009 JCH 17D 2009 MTH 14D 2009 STH 19D 2009 ISA 17D 2009 GNDA 1 MO 2009 DPI 17D 2009 DCO 14D 2009 DLI 21D 2010 DCO 14D 2010 HSR 14D 2010 DPI 14D 2010 GBO 21D 2010 RBE 14D 2010 STH 14D 2010 MTH 14D 2010 AKA 21D 2010 CSI 14D 2010 TBR 21D 2010 STH 14D 2010 MMI 14D 2010 BGU 14D 2010 HUFI6 MUFI6 725 130 884 432 75 759 425 155 583 536 187 264 145 110 55 156 47 908 373 124 756 382 122 338 742 275 1875 256 1970 2893 2660 2297 1481 2855 3331 1979 78 1418 2839 1725 541 682 59 3949 2469 6702 2675 2061 3990 978 1560 2968 1592 728 1395 2868 3067 3550 6711 1035 6195 4084 457 3312 2308 732 2416 2296 2696 12156 1166 10326 5091 4852 5456 5817 6663 6429 7615 1959 14015 14654 14404 3986 8468 164 796 1139 844 271 1464 513 2563 1853 3133 1613 853 833 818 1041 3189 5668 1688 1547 2308 2406 1333 1194 605 971 505 1095 3733 491 3032 1436 1481 709 724 380 1521 1874 1980 3876 1206 2804 1019 2336 59 -23 42 -15 -51 4 19 26 58 157 -48 73 158 343 155 644 239 311 370 638 116 215 694 176 360 313 174 98 -79 27 158 114 22 -80 114 357 188 2227 -7 1458 1213 1419 1318 679 Tabella C Successivamente all’esecuzione del rapporto tra campioni e controllo positivo T1 D1 T1 D2 CA -0.418 0.503 SC 0.320 0.202 15 NC 0.608 0.765 VN 0.025 0.139 T1 D3 T1 D4 T1 D5 T1 D6 T1 D7 T1 D8 T1 D9 T1 D10 T1 D11 T1 D12 T1 D13 T1 D14 T1 D15 T1 D16 T1 D17 T1 D18 T1 D19 T1 D20 T1 D21 T1 D22 T1 D23 T1 D24 T1 D25 T1 D26 T1 D27 T1 D28 T1 D29 T1 D30 T1 D31 T1 D32 T1 D33 T1 D34 STH 14D 2008 MTH 15D 2008 SNA 14D 2008 RBE 14D 2008 GDA 15D 2008 DCO 15D 2008 ALA 14D 2009 EBR 1 MO 2009 GCO 14D 2009 STH FLU 2009 JCH 17D 2009 MTH 14D 2009 STH 19D 2009 ISA 17D 2009 GNDA 1 MO 2009 DPI 17D 2009 DCO 14D 2009 DLI 21D 2010 DCO 14D 2010 HSR 14D 2010 DPI 14D 2010 0.063 0.723 -0.218 0.348 -0.070 0.350 1.585 0.664 0.707 0.210 0.172 0.169 0.299 0.579 0.028 0.563 0.211 0.375 0.150 1.578 0.309 0.801 1.063 0.191 1.296 0.633 0.110 1.113 0.623 0.227 0.855 0.786 0.274 0.387 0.213 0.161 0.081 0.229 0.069 1.331 0.547 0.182 1.109 0.560 0.179 0.496 1.088 0.403 2.749 0.375 2.889 4.242 3.900 0.124 0.160 0.124 0.169 0.198 0.180 0.718 0.278 0.257 0.145 0.174 0.124 0.181 0.306 0.100 0.189 0.172 0.352 0.112 0.886 0.222 0.138 0.466 0.292 0.791 0.316 0.243 0.471 0.115 0.184 0.350 0.188 0.086 0.165 0.339 0.362 0.419 0.793 0.122 0.732 0.482 0.054 0.391 0.273 0.086 0.285 0.271 0.318 1.436 0.138 1.219 0.601 0.573 16 0.326 0.557 0.402 0.243 0.526 0.302 1.637 0.388 0.195 0.486 0.393 0.203 0.307 0.591 0.890 0.479 0.546 0.545 0.435 0.784 0.763 0.333 0.341 0.488 0.361 0.116 0.627 0.220 1.097 0.793 1.341 0.690 0.365 0.357 0.350 0.446 1.365 2.426 0.723 0.662 0.988 1.030 0.571 0.511 0.259 0.416 0.216 0.469 1.598 0.210 1.298 0.615 0.634 0.080 0.241 0.054 0.116 0.121 0.449 0.273 0.213 0.066 0.106 0.183 0.199 0.353 0.171 0.203 0.530 0.124 0.162 0.190 0.269 0.216 0.232 -0.017 0.032 -0.011 -0.039 0.003 0.014 0.020 0.044 0.119 -0.036 0.055 0.120 0.260 0.118 0.489 0.181 0.236 0.281 0.484 0.088 0.163 0.527 0.134 0.273 0.237 0.132 0.074 -0.060 0.020 0.120 0.086 GBO 21D 2010 RBE 14D 2010 STH 14D 2010 MTH 14D 2010 AKA 21D 2010 CSI 14D 2010 TBR 21D 2010 STH 14D 2010 MMI 14D 2010 BGU 14D 2010 HUFI6 MUFI6 3.368 2.172 4.186 4.884 2.902 0.114 2.079 4.163 2.529 0.793 1.000 0.087 0.644 0.687 0.787 0.759 0.899 0.231 1.655 1.731 1.701 0.471 1.000 0.019 17 0.304 0.310 0.163 0.651 0.802 0.848 1.659 0.516 1.200 0.436 1.000 0.025 0.017 -0.061 0.086 0.271 0.143 1.690 -0.005 1.106 0.920 1.077 1.000 0.515