Il trascrittoma dell`ovocita MII umano

Il trascrittoma dell'ovocita MII umano
Cinzia Di Pietro
Università degli Studi di Catania
Dipartimento GF Ingrassia
Biologia Cellulare e Genetica Molecolare
G. Sichel
Complex Traits
L’ Infertilità
è
un Fenotipo Complesso
Complex
Conclusioni
Traits
Risultati
Complex Traits
Complex Traits
Complex Traits
Complex Traits
Durante la maturazione e il differenziamento dell’ovocita
meccanismi di REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA
determineranno
Il TRASCRITTOMA dell’ovocita maturo
mRNA – rRNA – tRNA – non coding RNAs
(piRNA, miRNA, long non coding RNA)
Introduzione
Regolazione dell’espressione genica
Introduzione
Meccanismi di regolazione post-trascrizionali:
microRNAs
poliadenilazione citoplasmatica
Introduzione
Quali informazioni possiamo trarre dallo studio
del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate per lo studio
del trascrittoma?
Cosa abbiamo imparato dallo studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del trascrittoma?
Quali informazioni possiamo trarre dallo studio
del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate per lo studio
del trascrittoma?
Cosa abbiamo imparato dallo studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del trascrittoma?
Il trascrittoma dell’ovocita non servirà
soltanto a guidare i processi di
differenziamento e maturazione ovocitaria
ma servirà all’embrione nei primissimi
stadi di sviluppo
Quali informazioni possiamo trarre
dallo studio del trascrittoma?
Il trascrittoma determina la qualità
dell’ovocita
La qualità dell’ovocita rappresenta uno dei
parametri più importanti del successo
riproduttivo
Quali informazioni possiamo trarre
dallo studio del trascrittoma?
Comprensione dei meccanismi molecolari
dell’ovogenesi e quindi possibilità di
intervenire con specifiche terapie nel caso di
disordini riproduttivi
Marcatori molecolari di qualità ovocitaria nei
cicli di PMA
Quali informazioni possiamo trarre
dallo studio del trascrittoma?
Quali informazioni possiamo trarre dallo studio
del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate per lo studio
del trascrittoma?
Cosa abbiamo imparato dallo studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del trascrittoma?
Quantificazione assoluta o relativa
assoluta: determinare il numero di copie di
specifici trascritti in una specifica cellula
relativa: comparare il profilo di espressione
tra il campione ed un calibratore
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
N° di geni analizzati (da 1 a ………)
Analisi di un singolo gene
Analisi High Troughput (HT)
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Reverse Transcription Real Time PCR
Numero ridotto di geni - quantificazione assoluta o relativa
Nury Steuerwald et al
Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by
real-time rapid cycle fluorescence monitored RT–PCR
Molecular Human Reproduction vol.5 no.11 pp. 1034–1039, 1999
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Microarray
Tecnologia HT - Quantificazione relativa
Bermúdez MG et al
Expression profile of individual human oocytes using microarray
tecnology
Reprod Biomed Online. 2004
Assou S et al
The human cumulus-oocyte complex gene-expression profile
Hum Rep 2006
Kocabas AM et al
The transcriptome of human oocytes
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
RT Profiler PCR Array
da 96 a 384 pozzetti – quantificazione relativa
TaqMan Array Micro Fluidic Cards
da 48 a 384 pozzetti- quantificazione relativa
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Fragouli E et al.
Transcriptomic profiling of human oocytes: association of meiotic
aneuploidy and altered oocyte gene expression.
Mol Hum Reprod 2010
Santonocito M et al.
The apoptotic transcriptome of the human MII oocyte:
characterization and age related changes.
Apoptosis. 2013
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Whole Transcriptome Amplification (WTA)
Tecnologia HT – quantificazione assoluta
Tang F et al
mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell
Nat Methods. 2009.
Park Sj et al.
Inferring the choreography of parental genomes during fertilization
from ultralarge-scale whole-transcriptome analysis.
Genes and Dev. 2013
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
The NanoString nCounter system
Riris S et al
Digital multiplex mRNA analysis of functional important genes in
single human oocytes and correlation of changes in transcript
levels with oocyte protein expression
Fertil Steril. 2014
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate
per lo studio del trascrittoma?
Quali informazioni possiamo trarre dallo studio
del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate per lo studio
del trascrittoma?
Cosa abbiamo imparato dallo studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del trascrittoma?
Complex Pathways
Apoptosis
L’apoptosi è una pathway complessa
controllata geneticamente.
ANTI
PRO
E’ costituita da una componente
pro ed una anti.
L’outcome della cellula è dettato da
ANTI
PRO
il prevalere di una componente
rispetto all’altra
Apoptosi nell’ovocita umano
I Step (preliminare pools )
Abbiamo valutato l’espressione di 84 geni codificanti proteine del
macchinario apoptotico mediante Real Time RT-PCR analizzando i
profili di espressione in:
Ovociti MII
Old
Cellule del
cumulo Old
Ovociti MII
Young
Cellule del
cumulo
Young
Apoptosi nell’ovocita umano
Ovociti vs Cellule del Cumulo
Ovociti vs Cellule del Cumulo
La maggior parte dei
geni è down regulata
negli Ovociti
BCL2L10
Guillemin et al. J Mol Med 2009
TP73
Tomasini R et al. Genes Dev. 2008
Tomasini R et al PNAS 2009
Cellule del Cumulo Old vs Young
PRO
ANTI
Ovociti Old vs Young
36 geni differenzialmente espressi
Prevalenza di geni pro up-regolati
Prevalenza di geni anti down-regolati
Risultati
58 geni sono espressi negli ovociti MII
2 geni (BCL2L10 e TP73) sono altamente espressi negli ovociti
80 geni sono espressi nelle cellule del cumulo
Maggiori variazioni negli ovociti rispetto alle cellule del cumulo
Maggiore predisposizione all’apoptosi negli ovociti di donne aged
Apoptosi nell’ovocita
umano
Risultati
II Step (validazione negli ovociti)
Numero di ovociti umani a disposizione è limitato
Selezionare i geni più interessanti da validare su singoli ovociti
Studio Risultati
della network
GeniRisultati
selezionati
Centralità
Fold Change
Isoforme
BCL2, CFLAR (posizione di centralità)
BCL2L11, BAD, NAIP, CD40, TNFRSF10A,TNFRSF21 (fold changes)
TP73, BCL2L1, MCL1 (presentano isoforme alternative con funzione pro o anti)
GeniRisultati
selezionati
Old
Young
Young
Old
Risultati
Risultati
BCL2, CFLAR, BCL2L11, BAD, NAIP, CD40, TNFRSF10A,TNFRSF21, TAp73, BCL2L1, MCL1
Santonocito et al Apoptosis 2012
Risultati
Risultati
Guglielmino et al Cell Cycle 2011
Discussioni
Risultati
CFLAR
Discussioni
Risultati
Riris et al Fertil Steril 2014
Discussioni
Risultati
Regolazione a livello trascrizionale – Epigenetica - microRNAs
Discussioni
Risultati
La down-regolazione di TAp73 negli ovociti old non sembra essere dovuta
a metilazione del promotore
Guglielmino et al Cell Cycle 2011
Discussioni
Risultati
Discussioni
Risultati
Conclusioni
Risultati
Ovociti MII di donne di avanzata età riproduttiva hanno una
maggiore predisposizione ad attivare l’apoptosi
Ovociti MII di donne di avanzata età riproduttiva sono in
difetto di “controllori” del ciclo cellulare
Tanto ancora …….da fare!!!!
Quali informazioni possiamo trarre dallo studio
del trascrittoma?
Quali tecniche vengono utilizzate per lo studio
del trascrittoma?
Cosa abbiamo imparato dallo studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del
trascrittoma?
Difficoltà di correlare uno specifico fenotipo
a specifici profili di espressione genica
Variabilità tra ovociti provenienti da una
stessa donna
Quali sono i limiti dello studio del
trascrittoma?
Quali sono i limiti dello studio del
trascrittoma?
Fresh
oocytes
Vitrificated thawed
oocytes
Quali sono i limiti dello studio del
trascrittoma?
Di Pietro C et al. Fertil Steril 2010
Conclusioni
Risultati
Collaborazioni
Risultati
Marilena Vento - Placido Borzì - Paolo Scollo
Servizio di PMA Azienda Ospedaliera Cannizzaro Catania
Maria Rosa Guglielmino - Manuela Santonocito - Rosalia Battaglia
Dipartimento GF Ingrassia Università degli Studi Catania