ANALISI CAMPIONI CRIOPRESERVATI PRELEVATI DALL’AZIENDA OSPEDALIERA “SPEDALI CIVILI DI BRESCIA” NELL’AMBITO DELL’INDAGINE RIGUARDANTE LA “STAMINA FOUNDATION” Laboratorio di Biologia Cellulare e Terapie Oncologiche Avanzate Dipar:mento di Scienze Mediche e Chirurgiche Materno Infan:li e dell’Adulto Università di Modena e Reggio Emilia Azienda Ospedaliera Universitaria di Modena Prof. Massimo Dominici [email protected] Azienda Ospedaliera – Universitaria di Modena
Roma, Senato della Repubblica, Commissione Sanità, 30 Luglio 2014 Le Potenzialità delle Staminali Lung injury Bone injury Graaf T, Blood 2003; Dominici M JBR 2001, PNAS 2004, Blood 2008, Blood 2009, TransplantaLon 2008 Come Agiscono le Staminali? DANNO ! • Staminali maMone à Differenziamento • Staminali di supporto à Rilascio di Molecole • Entrambe Horwitz EM & Dominici M Cytotherapy 2008 IL MIDOLLO OSSEO Cellule Staminali EmatopoieLche: ESC Cellule Staminali Mesenchimali: MSC CELLULE IMMUNITA’+ SANGUE Midollo ESC OSSO MSC Midollo Osseo Lichtman MA. Exp Hematol 1981 Le Staminali MSC sono Rare ANALISI CITOMETRICHE SUBITO DOPO ESTRAZIONE 0,01% MSC CELLULE IMMUNITA’ + SANGUE R2
ESC Il CD73, CD105, CD90 Sono marcatori di Staminali MSC Ecco Cosa Accade in Vitro Immagine Microscopica (100X) Dominici M et al. JBR 2001 & Transplantation 2008
Amplificazione in vitro Un’Appropriata Amplificazione in Vitro “Purifica” le Staminali Riducendo ed Eliminando Le Cellule dell’Immunità ANALISI CITOMETRICHE DOPO AMPLIFICAZIONE CELLULE IMMUNITA’ + SANGUE MSC ESC CD73, CD105, CD90: Sono marcatori di MSC L’Esperienza Americana-­‐USA 2007-­‐2011 (su ~115 casi sperimentali per la medicina rigeneraLva ) TIPO DI CELLULE FONTE TESSUTO MSC Infusioni singole o mulLple di 1-­‐5 milioni di cellule/kg se e.v. Bailey AM Sci Transl Med 2012 Donatori ed Indicazioni Cliniche Nella Medicina Rigenera:va Ratcliffe E et al Br Medical Bullein 2013 Trapianto Autologo ed Allogenico di MSC Isolamento ex-­‐vivo Isolamento ex-­‐vivo Trapianto Trapianto Paziente Espansione Purificazione CaraMerizzazione IdenLficazione Congelamento Autologo Cellule dell’immunità Staminali MSC Donatore Sano Espansione Purificazione CaraMerizzazione IdenLficazione Congelamento Allogenico Paziente Perchè è Necessario Eliminare L’Immunità nel Trapianto Allogenico di MSC? 1. Non servono 2. Sono dannose perchè provocano reazioni avverse legate alla capacità delle cellule del donatore di aggredire i tessu: del ricevente 3. Possono innescare una risposta del ricevente verso le cellule immunitarie trapiantate con una reazione „allergica“ anche mortale oltre che invalidare il trapianto 4. QuesL aspei non sono significaLvi per il trapianto Autologo !!!!!"#$$%$#!&''%(&)*+!,!-*(.%#!
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Quello che è stato compreso del “Protocollo STAMINA” Aspirato Midollare Isolamento Amplificazione In Laboratorio IN VENA Nel Midollo Spinale -­‐ Rachide Analisi Laboratorio Infusioni mulLple di 200.000 cellule TraMamento Con Acido ReLnoico Scongelamento Congelamento N2 VALUTAZIONI INIZIALI CAMPIONI “STAMINA” • I campioni sono staL consegnaL il giorno 01/08/2012 presso il ns. Laboratorio da Ufficiali autorizzaL dei NAS. • La valutazione ispeiva al momento della consegna dimostrava la presenza di due campioni in apparente buono stato di criopreservazione. • In sostanza poco/non leggibili i caraMeri siglaL sulle fiale da congelamento ANALISI IMMUNOFENOTIPICA E MORFOLOGICA DEI CAMPIONI POST-­‐SCONGELAMENTO • I campioni venivano quindi analizzaL immediatamente dopo scongelamento mediante parametri definiL da Dominici et al. (Cytotherapy 2006) • Le cellule venivano quindi poste in coltura al fine di: à monitorarne il comportamento in vitro à amplificarle per i test necessari a definirne le caraMerisLche biologiche e la staminalità (immunologia e differenziamento) à valutarne le capacità di divenire cellule della linea neuroectodermica (definito qui “neuronale” in senso lato) QUALI SONO LE MINIME DEFINIZIONI DI “NORMALITA’” PER CELLULE STAMINALI MSC? Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/Staminali Mesenchimali: il Normale Aspe[o in Coltura BM-­‐MSC Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/Staminali Mesenchimali: IL FENOTIPO IMMUNOLOGICO ATTESO Staminali MSC Cellule dell’immunità NON INDOTTI INDOTTI Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità in Cellule Stromali/
Staminali Mesenchimali: LA CAPACITA‘ DI DIFFERENZIARE GRASSO Osso Car:lagine Criteri Dominici & ISCT per Minima Definizione di Staminalità: SINTESI Oil Red
GRASSO Osso Alizarin Red
Adulte Feno:po Immunologico In Vitro Appropriato senza Contaminan: Car:lagine Alcian Blue
Staminali Capacità di Differenziamento I Criteri Applica: alle cellule “Stamina” • L’analisi immunofenoLpica mostrava una contaminazione fino al 18.8% di cellule CD45+ (in accordo con quanto visto nell’analisi citofluorimetrica effeMuata dall’IsLtuto Superiore di Sanità) di esse il 61.7% sono CD14+/
HLADR+ à contaminazione di cellule in grado di generare reazioni mortali • Il CD105 appariva inferiore al 15,8%. à Mancanza di marker di staminalità LIMITI RICONOSCIUTI: Anomalie in Coltura: Contaminan: Immunitari Campione cresciuto con terreno standard p rivo di siero bovino Campione cresciuto con “protocollo stamina” o[enuto “breve[o” (con siero bovino) I Protocolli di Infusione Stamina: il Punto di Vista Immunologico *+",$-'#%"('./010"(
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Allogenico da Paziente a Paziente à Contaminazione di cellule immunità in grado di generare reazioni avverse à Mancanza di marcatori di staminalità UN BIZZARRO ESEMPIO AGLI ATTI: Paziente XY “I TRAPIANTI ETEROLOGHI MULTIPLI” +,-."/%&'-(%012$2-(
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Allogenico Da Donatore Sano a Paziente XY 2° Infusione !! !"#$%&'%())(
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Allogenico da Paziente ZZ a Paziente XY 3° Infusione !!!! à Contaminazione di cellule immunità in grado di generare reazioni avverse à Mancanza di marcatori di staminalità LE “CELLULE STAMINA” DA NOI ANALIZZATE MOSTRANO ELEVATI LIVELLI DI CELLULE DELL’IMMUNITA’ IN GRADO DI GENERARE PERICOLOSE REAZIONI AVVERSE Oil Red
GRASSO GRASSO CELLULE STAMINA Car:lagine Alcian Blue
INDOTTO Osso Alizarin Red
NON INDOTTO Anomalie del Differenziamento COME DOVREBBE ESSERE Oil Red
GRASSO OSSO CELLULE STAMINA Car:lagine Alcian Blue
INDOTTO Osso Alizarin Red
NON INDOTTO Anomalie del Differenziamento COME DOVREBBE ESSERE Oil Red
GRASSO CARTILAGINE CELLULE STAMINA Car:lagine Alcian Blue
INDOTTO Osso Alizarin Red
NON INDOTTO Anomalie del Differenziamento COME DOVREBBE ESSERE LE CELLULE STAMINA NON RISPETTANO LE MINIME DEFINIZIONI DI NORMALITA’ PER CELLULE STAMINALI ADULTE QUALI LE CELLULE STROMALI/STAMINALI MESENCHIMALI: NON SONO STAMINALI TENTATIVO DI DIFFERENZIAMENTO “NEURONALE” • Al fine di monitorare le capacità differenziaLve delle cellule in oggeMo in senso “neuronale”, dopo 2 passaggi in coltura le cellule sono state indoMe secondo il protocollo descriMo nel BreveMo US 0149099 del 2012 in capo ai Sig. Vannoni e Molino. • Secondo il protocollo descriMo nel BreveMo US 0149099 del 2012, 6 ul/ml di una soluzione madre di Acido ReLnoico in etanolo 98% (1mg/ml corrispondente a 3x10-­‐3 M) sono staL aggiunL al mezzo di coltura (SIERO) per 2 ore • Al termine delle 2 ore di differenziamento sono state effeMuate analisi morfologiche ARTEFATTI nel Differenziamento “NEURONALE” NON INDOTTO 2 H Acido re:noico INDOTTO NON INDOTTO 2H Acido re:noico INDOTTO ARTEFATTI nel Differenziamento “NEURONALE” • Dopo 2 ore di induzione non si sono osserva: cambiamen: significa:vi nella stru[ura cellulare. • Abbiamo osservato struMure simil-­‐dendriLche ed assonali sia nei campioni indoi che nei controlli che apparentemente non appaiono indicaLve di un divenuto differenziamento. Medesimi risultaL sono staL oMenuL alle 24 ore. • TuMavia, anche la presenza di un’alterazione morfologica simil-­‐neuronale non pare indicaLva di una reale potenzialità rigeneraLva Lssutale come documentato nei seguenL lavori pubblicaL: •
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ReevaluaLon of in vitro differenLaLon protocols for bone marrow stromal cells: disrupLon of acLn cytoskeleton induces rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. Neuhuber B, Gallo G, Howard L, Kostura L, Mackay A, Fischer I. J Neurosci Res. 2004 Jul 15; 77(2):192-­‐204 InducLon of bone marrow stromal cells to neurons: differenLaLon, transdifferenLaLon, or arLfact? Lu P, Blesch A, Tuszynski MH. J Neurosci Res. 2004 Jul 15; 77(2):174-­‐91. Chemically-­‐Induced RAT Mesenchymal Stem Cells Adopt Molecular ProperLes of Neuronal-­‐Like Cells but Do Not Have Basic Neuronal FuncLonal ProperLes. Gabriela F. Barnabé, Telma T. Schwindt, Maria E. CalcagnoZo, Fabiana L. MoZa, Gilberto Mar[nez, Jr., Allan C. de Oliveira, Leda M. N. Keim, Vânia D'Almeida, Rosália Mendez-­‐Otero, Luiz E. Mello. PLoS ONE. 2009; 4
(4): e5222 LE CELLULE STAMINA NON RISPETTANO LE MINIME DEFINIZIONI DI NORMALITA’ PER CELLULE STAMINALI ADULTE QUALI LE CELLULE STROMALI/STAMINALI MESENCHIMALI E NON SONO IN GRADO DI GENERARE CELLULE “NEURONALI”
