PathoDx
Respiratory Virus Panel
R62400
IT
1. Finalità d’USO
Il kit Respiratory Virus Panel (RVP) PathoDxTM è un test diretto a
immunofluorescenza per la determinazione qualitativa di 7 comuni
virus respiratori (virus respiratorio sinciziale, influenza A, influenza
B, virus di parainfluenza 1, 2 e 3 e adenovirus) in campioni paziente
preparati a seguito di crescita in coltura cellulare. Categoria di
complessità CLIA: elevata.
2. Riassunto e spiegazione del test
Affezioni respiratorie virali in bambini e adulti causano una notevole
morbilità e mortalità, in particolare in bambini piccoli e anziani.
Circa il 75% delle malattie respiratorie acute è causato da virus. Con
la disponibilità di terapie anti-virali per alcuni virus, è importante
la determinazione di un’eziologia virale per le infezioni
respiratorie.19 L’utilizzo precoce e adeguato dell’efficace terapia
anti-virale può ridurre la morbilità e la mortalità associate a
infezioni virali del tratto respiratorio inferiore.
La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali viene generalmente
eseguita tramite sierologia e isolamento/conferma in coltura.
L’aspetto negativo della diagnosi sierologica è il ritardo e
l’inconveniente di ottenere sieri in fase acuta e convalescente.
L’isolamento/conferma in coltura è il metodo standard per la
maggior parte dei laboratori di virologia clinica. Anche se questo
metodo non è rapido come il rilevamento eseguito da campioni
diretti del paziente, l’isolamento/conferma in coltura è ancora il
metodo più sensibile per il rilevamento di patogeni respiratori
virali.
I campioni respiratori (aspirati nasofaringei o tamponi) vengono
sottoposti a test per la presenza di antigeni virali. Il test
dell’antigene virale eseguito tramite coltura “shell vial” migliorata
per centrifugazione e la coltura in provetta tradizionale forniscono
una diagnosi accurata di comuni eziologie virali delle infezioni del
tratto respiratorio.
L’aerosol con rivabirina viene usato per trattare la bronchiolite
e la polmonite causate dal virus RSV.8,9 Una diagnosi rapida e
precoce di infezioni RSV è critica al fine di iniziare la terapia
e di controllare le infezioni nosocomiali. È stato dimostrato
che l’immunofluorescenza è sensibile e specifica per la
determinazione degli antigeni RSV in secrezioni nasofaringee.10–13
Questi studi dimostrano che è possibile usare anticorpi altamente
specifici per l’RSV per la determinazione di antigeni in un
campione del paziente nonché in coltura cellulare.
L’isolamento della coltura cellulare di RSV può essere ottenuto
con numerose linee cellulari comprese le cellule HEp-2, HeLa,
A549 e Vero. L’effetto citopatico RSV (CPE) può essere visibile
appena 2 giorni dopo l’inoculo, tuttavia alcuni isolati possono
impiegare fino a 10 giorni.
Virus dell’influenza
I virus dell’influenza sono virus RNA a filamenti negativi della
famiglia delle Orthomyxoviridae. I virus dell’influenza A e
dell’influenza B comprendono una singola categoria con il virus
dell’influenza C in una categoria separata.
L’influenza A e in misura minore l’influenza B, mostrano la
variazione antigenica nell’emoagglutinina e nelle proteine
neuraminidasi. I sottotipi dell’influenza A sono identificati
dagli antigeni dell’emoagglutinina e della neuraminidasi,
rispettivamente H1-H13 e N1-N9.15 Annualmente si verificano
delle variazioni minori di questi antigeni, denominate deriva
antigenica. Le variazioni maggiori dovute a una ridistribuzione dei
segmenti del gene vengono denominate mutazione antigenica.
Tali variazioni possono causare malattie pandemiche ogni 1030 anni. I ceppi H1N1, H3N2 sono stati associati alla malattie
pandemiche negli esseri umani.15
Le infezioni dell’influenza sono associate a epidemie stagionali
di affezioni respiratorie, quali faringite, laringotracheobronchite,
bronchite e polmonite.17 Nell’emisfero settentrionale, la “stagione
dell’influenza” va da novembre ad aprile e da maggio a ottobre
nell’emisfero meridionale. Nei climi tropicali, l’influenza può
essere endemica con le epidemie che compaiono più volte in un
anno.15 In linea di massima, durante ciascun periodo epidemico
prevale un tipo di influenza, il tipo A o il B.18
Virus respiratorio sinciziale (RSV)
Il virus respiratorio sinciziale (RSV) è la principale causa di affezioni
virali acute dell’apparato respiratorio in neonati e bambini. La
malattia si presenta in circa il 10-40% dei bambini infettati per
la prima volta.1 Tale virus è responsabile del 50% di tutti i casi di
bronchiolite e del 25% di tutti i casi di polmonite durante i primi
mesi di vita.2,3 L’infezione RSV in bambini più grandi e in adulti
si manifesta in genere con i sintomi di un comune raffreddore,
tuttavia può anche causare un’infezione importante del tratto
respiratorio inferiore in adulti, in particolare negli anziani.1
L’isolamento e l’identificazione del virus è il metodo di laboratorio
standard per la diagnosi.15-17 L’inoculo in coltura di tessuto, invece
dell’inoculo nell’uovo è il metodo di isolamento più comune. Le
fiale “shell vial” amplificate tramite rotazione usate insieme alla
coltura di tessuto possono consentire una diagnosi all’incirca
entro un giorno. Il virus dell’influenza A e B può essere isolato
in colture in provetta o “shell vial” MRC-5, RD, A549, HL e MDCK
con o senza la presenza di tripsina.15,17 L’influenza B produce
in genere un valore CPE prima dell’influenza A, solitamente
entro 5-10 giorni dalla post-infezione. L’emoagglutinazione o
l’emoassorbimento possono essere eseguiti prima che il CPE
sia evidente con l’identificazione virale definitiva confermata da
anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina.
Il virus RSV è distribuito a livello mondiale e causa ogni anno nel
periodo invernale epidemie di malattie respiratorie, in particolare
nei climi temperati.3 Il virus è molto contagioso e i bambini infetti
diffondono il virus per 1-2 settimane dopo il ricovero in ospedale
e complessivamente fino a 2-3 settimane.4 A causa dell’elevata
infettività del virus RSV e della ricomparsa dell’infezione,
nonostante la presenza degli anticorpi5,6 in circolazione, il virus
RSV è diventato la causa più frequente di infezioni nosocomiali
nei reparti pediatrici.7
Virus della parainfluenza
I virus della parainfluenza (PIV) appartengono al genere
Paramyxovirus che comprende anche il virus RSV. Analogamente ai
virus dell’influenza, anche i virus della parainfluenza contengono
emoagglutinina, neura-minidasi e attività di fusione cellulare.
Negli esseri umani sono stati identificati quattro sierotipi del virus
della parainfluenza (tipi 1, 2, 3 e 4). I tipi della parainfluenza 1, 2 e
3 vengono prontamente isolati tramite coltura cellulare mentre il
tipo di parainfluenza 4 è più difficile da coltivare.20,21
I virus della parainfluenza e il virus RSV comprendono i
patogeni virali respiratori più importanti nei neonati e bambini.
Le affezioni cliniche causate da virus della parainfluenza
comprendono
rinorrea,
tosse,
laringotracheobronchite,
bronchiolite e polmonite.22,23 I tipi 1 e 2 sono le cause principali
della laringotracheobronchite. Anche se l’infezione di tipo 3 può
produrre la laringotracheobronchite, il tipo 3 è secondo solo al
virus RSV come causa di bronchiolite e polmonite in neonati di età
inferiore a 6 mesi.21 In bambini più grandi e adulti, le infezioni del
virus della parainfluenza possono essere asintomatiche o simulare
il comune raffreddore. Il tipo 4 è stato associato solo a infezioni
lievi del tratto respiratorio superiore in bambini e adulti.21
L’isolamento della coltura cellulare dei virus della parainfluenza
viene generalmente eseguito con cellule del rene di scimmia
rhesus primaria o con linee cellulari del rene umano. Le linee
cellulari che sono state usate con successo per la diffusione dei
virus della parainfluenza comprendono RMK, HEK, LLC-MK2,
Vero, A549 e HEp-2.21 Il CPE della parainfluenza, se presente,
può essere rilevato solitamente entro 5-10 giorni dall’inoculo. La
presunta conferma dell’infezione del virus può essere ottenuta
effettuando il test dell’emoassorbimento di eritrociti della cavia
cobaya con identificazione finale del virus confermata da anticorpi
monoclonali coniugati con fluoresceina.21,22,24
Adenovirus
Gli adenovirus umani sono virus DNA a doppio filamento, senza
envelope che appartengono alla famiglia delle Adenoviridae.
Sono stati identificati 47 sierotipi umani con gran parte dei
sierotipi associati a infezioni respiratorie o oculari.25 L’affezione
del tratto respiratorio superiore è lieve. L’affezione del tratto
respiratorio inferiore causata dai tipi 3, 4, 7 e 21 può produrre
bronchite, laringotracheobronchite, bronchiolite e polmonite.26
Le infezioni da adenovirus negli adulti non sono significative,
ad eccezione delle infezioni in ospiti immunocompromessi ed
epidemie occasionali nel personale dell’esercito militare.27,28
3. PRINCIPIO del Metodo
Il kit Respiratory Virus Panel PathoDx è costituito da un reagente
di rilevamento contenente anticorpi monoclonali per ciascun virus
respiratorio e sette reagenti con anticorpi monoclonali specifici del
virus. Tutti i reagenti contengono anticorpi monoclonali coniugati
con fluoresceina. Le cellule fissate con acetone provenienti da
coltura di cellule positiva o da coltura “shell vial” vengono colorate
con Reagente per il rilevamento dei virus respiratori (RVP) e
Reagente di controllo negativo per virus respiratori (RVP). Il
reagente di rilevamento contiene anticorpi monoclonali coniugati
con fluoresceina per il virus RSV, influenza A, influenza B, i virus 1,
2 e 3 della parainfluenza e l’adenovirus. Essi reagiscono in modo
specifico agli antigeni virali sopra indicati, se presenti nella cellula.
Il Reagente di controllo negativo per virus respiratori (RVP)
contiene anticorpi di topo coniugati con fluoresceina che non
reagiscono con gli agenti virali. L’anticorpo non legato e il colorante
di contrasto Evans blue vengono eliminati con soluzione fisiologica
tamponata e il vetrino viene montato con glicerolo tamponato.
Con la microscopia a fluorescenza, gli antigeni virali rilevati dagli
anticorpi monoclonali presenti mostreranno una fluorescenza
verde-mela. Le cellule non infette si controcoloreranno di rosso
con Evans blue. Per identificare quale dei sette virus respiratori
è reattivo con il reagente di rilevamento, le preparazioni fissate
con acetone vengono colorate con ciascuno dei sette reagenti
specifici del virus, viene rimosso l’anticorpo non legato, vengono
montate con glicerolo tamponato e osservate sotto microscopia
a fluorescenza. Il virus o i virus responsabili mostreranno una
caratteristica fluorescenza verde-mela con cellule non infette che
si controcolorano di rosso.
4. Reagenti
COMPONENTI DEL KIT
Respiratory Virus Panel
1.
Reagente per il rilevamento dei
virus respiratori (RVP) (R62416)
2.
Reagente di controllo negativo per
virus respiratori (RVP) (R62412)
3.
Vetrini di controllo per virus
respiratori (R62414)
4.
Reagente per virus respiratorio
sinciziale (RSV) (R62411)
5.
Reagente per influenza A (R62405)
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
200 test (R62400)
1 boccetta contagocce
(cappuccio bianco)
1 boccetta contagocce
(cappuccio rosso)
1 confezione di vetrini
1 boccetta contagocce
(cappuccio grigio)
1 boccetta contagocce
(cappuccio blu)
Reagente per influenza B (R62406)
1 boccetta contagocce
(cappuccio viola)
Reagente per parainfluenza 1 (R62408) 1 boccetta contagocce
(cappuccio verde)
Reagente per parainfluenza 2 (R62409) 1 boccetta contagocce
(cappuccio arancione)
Reagente per parainfluenza 3 (R62410) 1 boccetta contagocce
(cappuccio bianco)
Reagente per adenovirus (R62407)
1 boccetta contagocce
(cappuccio giallo)
Liquido di montaggio per virus
1 boccetta contagocce
respiratori (RVP) (R62413)
(cappuccio blu)
Instruzioni per l’uso
1
5. DESCRIZIONE,
PREPARAZIONE
PER
L’USO
E
RACCOMANDAZIONI PER LA CONSERVAZIONE
Fare riferimento anche alla sezione Avvertenze e precauzioni di
impiego.
Questo prodotto è pronto per l’uso e non occorre ulteriore
preparazione. Conservare a 2-8°C, al riparo dalla luce. Usare entro
la data di scadenza riportata sull’etichetta. Il prodotto deve essere
portato a temperatura ambiente (15-28°C) prima dell’uso.
I componenti sono disponibili anche singolarmente.
Reagente per virus respiratorio sinciziale
(RSV)
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Reagente per influenza A
Reagente per influenza B
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Una boccetta contagocce contenente 15 ml
di fluido di montaggio composto da glicerolo
tamponato contenente sodio azide allo
0,098% come conservante.
Reagente per parainfluenza 2
Reagente per parainfluenza 3
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Vetrini di controllo per virus respiratori
Cinque vetrini confezionati singolarmente
in confezioni metallizzate sigillate, con
dessiccante. Ciascun vetrino di controllo ha
otto pozzetti. Ciascun pozzetto è chiaramente
marcato con il tipo di cellula infettata da virus
che si trova sul vetrino. Uno dei pozzetti
contiene cellule LLC-MK2 non infette. Il vetrino
è stato fissato con acetone. Prima dell’uso,
portare il vetrino a temperatura ambiente
(15-28°C) nella confezione metallizzata.
Estrarre il vetrino afferrandolo solo dai bordi.
Le cellule infette da virus sono composte
come segue:
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Reagente per parainfluenza 1
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Liquido di montaggio per virus respiratori
(RVP)
RSV
Influenza A­
Influenza B­
Parainfluenza 1­
Parainfluenza 2­
Parainfluenza 3­
Adenovirus 5­
Ceppo Long, ­ATCC® VR-26/HEp-2­
Ceppo A/Port Chalmers/1/73, ATCC® VR-810/MDCK­
Ceppo B/Maryland/1/59,­ATCC® VR-296/MDCK­
Ceppo C-35, ­ATCC® VR-94/LLC-MK2­
Ceppo Greer, ­ATCC® VR-92/LLC-MK2­
Ceppo C 243, ­ATCC® VR-93/LLC-MK2­
Ceppo adenoideo 75, ­ATCC® VR-5/A-549­
6. AVVERTENZE E PRECAUZIONI DI IMPIEGO
Reagente per adenovirus
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Una boccetta contagocce contiene 2,0 ml
(circa 40 test) di anticorpi monoclonali di
topo purificati coniugati con fluoresceina
e colorante di contrasto Evans blue in
una soluzione tamponata stabilizzata con
proteina, contenente sodio azide allo 0,098%
come conservante.
Esclusivamente per uso professionale.
Reagente per il rilevamento dei virus
respiratori (RVP)
1.
Per informazioni su componenti potenzialmente pericolosi,
fare riferimento ai prospetti informativi sulla sicurezza forniti
dal produttore e alle informazioni riportate sulle etichette dei
prodotti.
PRECAUZIONI DI SICUREZZA
Una boccetta contagocce contenente
10,0 ml (circa 200 test) di anticorpi
monoclonali di topo purificati coniugati
con fluoresceina specifici per i virus RSV,
influenza A, influenza B, i virus 1, 2 e 3 della
parainfluenza e l’adenovirus nonché colorante
di contrasto Evans blue in una soluzione
tamponata stabilizzata con proteina,
contenente sodio azide allo 0,098% come
conservante.
2.
Reagente di controllo negativo per virus
respiratori (RVP)
3.
Una boccetta contagocce contenente
10,0 ml di anticorpi IgG di topo purificati
coniugati con fluoresceina non reattivi
con alcun virus respiratorio e colorante
di contrasto Evans blue in una soluzione
tamponata stabilizzata con proteina,
contenente sodio azide allo 0,098% come
conservante.
4.
5.
Ai reagenti, come agente antibatterico, è stata aggiunta
la sodio azide a concentrazioni dello 0,098%. Per evitare
la formazione di azidi di metallo esplosive a contatto con
tubazioni in piombo o rame, i reagenti possono essere gettati
nella rete fognaria solo se diluiti e irrigati con grandi volumi
di acqua. Usare impianti di scarico privi di rame e piombo,
laddove possibile.
Campioni clinici: è necessario attenersi alle precauzioni di
sicurezza durante la manipolazione e il trattamento di tutti
i campioni clinici, poiché possono essere presenti organismi
patogeni. È necessario seguire buone pratiche di laboratorio
durante la manipolazione di colture sospette contenenti
virus infettivi.
Rifiuti: sterilizzare tutti i rifiuti prima dello smaltimento, in
conformità con le procedure di laboratorio standard e le
normative locali.
Nel Reagente è presente il colorante blu di Evans. Sebbene
la concentrazione presente sia inferiore alla percentuale
necessaria affinché il prodotto sia classificato come
cancerogeno, è necessario evitare il contatto con la pelle.
L’acetone (non fornito) è un solvente organico infiammabile.
Usare in una zona ben ventilata lontano da qualunque
potenziale sorgente di accensione.
PRECAUZIONI ANALITICHE
Questo prodotto non deve essere usato se (1) è trascorsa la data
di scadenza (2) o se sono presenti segni di deterioramento.
7. PRELIEVO, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEI
CAMPIONI
Tutti i campioni devono essere collocati nel terreno di trasporto
virale al più presto possibile e trasportati al laboratorio in ghiaccio.
Evitare di congelare i campioni. Se non è possibile inoculare il
campione entro due giorni, occorre congelarlo a –70°C. Usare
il terreno di trasporto virale (VTM), noto come non inibente la
crescita dei virus respiratori o delle cellule in coltura. I terreni
di trasporto virali consigliati sono M4®, M4RT® e M5®, Remel
Inc. I laboratori devono stabilire le procedure per il prelievo e il
trasporto dei campioni che meglio soddisfano le loro esigenze.
Le linee guida e le raccomandazioni sono contenute in numerosi
manuali da laboratorio.30-35
8. Procedura
MATERIALE FORNITO
Il kit Respiratory Virus Panel (R62400) contiene materiale
sufficiente per 200 test (fare riferimento a Componenti del kit).
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
1.
Vetrini per microscopio (a 2 pozzetti e a 8 pozzetti)
con pozzetti di 5-8 mm di diametro con rivestimento
idrofobo resistente all’acetone. I pozzetti devono essere
sufficientemente distanziati per evitare scambi di campione
o reagente. Usare vetrini puliti con acetone.
2.
Acetone - di qualità reagente o migliore, conservato in un
contenitore in vetro.
3.
Provette di coltura da 16×125 mm o fiale in vetro da una
dracma con 12 mm diametro, coprioggetto n. 1, contenente
cellule idonee per l’isolamento dei virus respiratori. Le
cellule del rene di scimmia primaria, MDCK, LLC-MK2,
HEp-2 o altre cellule note per essere sensibili a diversi virus
respiratori sono consigliate per l’isolamento.
4.
Centrifuga con una capacità di almeno 600-700×g per il
trattamento di campioni paziente.
5.
Ceppi di virus respiratori conosciuti come controlli, ad
esempio i seguenti ceppi American Type Culture Collection
(ATCC®) o isolati di laboratorio precedentemente identificati:
Virus
RSV­
Influenza A­
Influenza B­
Parainfluenza 1­
Parainfluenza 2­
Parainfluenza 3­
Adenovirus 5­
6.
7.
8.
9.
10.
Linea cellulare
Ceppo Long, ­ATCC® VR-26/HEp-2­
Ceppo A/Port Chalmers/1/73, ATCC® VR-810/MDCK­
Ceppo B/Maryland/1/59,­ATCC® VR-296/MDCK­
Ceppo C-35, ­ATCC® VR-94/LLC-MK2­
Ceppo Greer, A
­ TCC® VR-92/LLC-MK2­
Ceppo C 243, A
­ TCC® VR-93/LLC-MK2­
Ceppo adenoideo 75, ­ATCC® VR-5/A-549­
Terreno di mantenimento della coltura del tessuto [Eagle’s
Minimum Essential Medium con il 2% di siero bovino fetale,
15 mM HEPES, 0,8 g/l di bicarbonato di sodio e antibiotici
(100-250 U/ml di penicillina G e 100 µg/ml di streptomicina
o da 5 a 10 µg/ml di gentamicina o equivalente)].
Terreno di mantenimento per coltura del tessuto privo di
siero.
Pipette sterili graduate: 10, 5 e 1 ml.
Pipette sterili di Pasteur.
Pinze con punta fine.
11.
Soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS: 0,01 M di
fosfato di sodio, 0,15 M di cloruro di sodio, pH 7,2-7,4, privo
di ioni di calcio e di magnesio). Come agente batteriostatico
è possibile aggiungere 0,05 g/dl di timerosal o 0,01 g/dl di
sodio azide.
12. Copri oggetto n. 1 da 22×50 mm.
13. Beaker, contenitore Coplin o flacone per lavaggio vetrini.
14. Carta assorbente per asciugare i vetrini.
15. Camera umida oscurata idonea per l’incubazione di vetrini.
16. Incubatore in grado di mantenere 30-36°C, dotato di
tamburo rotante, se si utilizzano provette di coltura.
17. Microscopio a fluorescenza con filtri per fluoresceina
(eccitazione massima - 490 nm; emissione massima - 520
nm) con obiettivi per ingrandimento pari a 160-250X e 400630X.
18. Centrifuga con supporto in grado di contenere fiale da
1 dracma (opzionale - solo per coltura “shell vial” migliorata
tramite centrifugazione).
PROCEDURA DEL TEST
Inoculazione di colture di cellule
Se è necessario usare le “shell vial” da una dracma, è vivamente
consigliato l’inoculo di colture in provetta per aumentare la
probabilità di isolare dei virus respiratori e per recuperare altri
virus. Le colture di cellule sensibili devono essere inoculate in
conformità con le procedure standard.2,10,11 Le colture di controllo
positive e negative sono composte da ceppi noti o da isolati di
virus respiratori e devono essere inoculate nelle “shell vial” e/o
nella coltura di routine insieme a ciascun gruppo di campioni
paziente per garantire che siano state osservate sia la procedura
della coltura che quella del rilevamento. Attenzione: adottare una
tecnica sterile per l’intera procedura di test.
NOTA: è stato riportato l’uso di un saggio “shell vial” migliorato
tramite centrifugazione [(600-700xg) per 1 ora a temperatura
ambiente (15-28°C)] per intensificare l’isolamento di alcuni
virus.14,16,22,26
Tamponi nasofaringei nel terreno di trasporto virale
È necessario agitare su vortex il campione per tampone con
numerosi granuli di vetro per 20-30 secondi, allo scopo di
rimuovere qualunque virus o cellula. Rimuovere il tampone dal
terreno e premerlo saldamente contro la parte interna della
provetta per spremere tutte le cellule, il virus e il fluido raccolti.
Secrezioni nasofaringee
Agitare i campioni su vortex con numerosi granuli di vetro per
ottenere il rilascio di qualunque virus associato alle cellule.
1.Preparazione dei campioni
Fase a Centrifugare l’eluato del tampone o la secrezione
nasofaringea trattata a 600×g per 5 minuti per ottenere
un pellet cellulare.
Fase b Rimuovere il sovranatante con una pipetta sterile e
conservare questo sovranatante di campioni trattati
per l’inoculo di “shell vial” e/o coltura in provetta.
Sospendere di nuovo il pellet cellulare con 5 ml di
soluzione fisiologica sterile tamponata di fosfato (PBS),
pH 7,0-7,6.
Fase c
Fase d
2.
Fase a
Fase b
Fase c
Fase d
Fase e
3.
Fase a
Fase b
Fase c
Fase d
Fase e
Fase f
Centrifugare le cellule a 600×g per 5 minuti e ripetere
ancora una volta il lavaggio PBS, se necessario, per
rimuovere qualunque muco residuo che possa produrre
una fluorescenza aspecifica.
Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere solo 100-200 µl del
sovranatante. Sospendere di nuovo il pellet cellulare
nel fluido restante pipettando delicatamente in su e in
giù per ottenere una sospensione uniforme.
Procedura della coltura in provetta
Rimuovere il terreno di coltura da una linea cellulare
adeguata coltivata in provette di coltura di vetro
(16×125 mm). Sciacquare il monostrato cellulare con
terreno di mantenimento della coltura di tessuto privo
di siero e aspirare.
Inoculare 0,2-0,5 ml di campione trattato in ciascuna
coltura in provetta. Si consiglia di eseguire un doppio
inoculo di tutti i campioni clinici per aumentare la
sensibilità.
Incubare le provette per un’ora a 33-36°C.
Rimuovere l’inoculo e aggiungere 2 ml di terreno
di mantenimento della coltura di tessuto, nuovo,
preriscaldato e privo di siero.
Incubare le provette a 33-36°C con o senza rotazione
ed esaminare regolarmente il monostrato della coltura
per un effetto citopatico (CPE). Alcuni virus mostrano
la caratteristica CPE che li porta all’identificazione. È
possibile eseguire l’emoassorbimento con eritrociti
della cavia cobaya freschi, ma è necessario lavare
le cellule della cavia cobaya prima di procedere alla
colorazione.
Trattamento e colorazione della coltura in provetta
Quando il monostrato della coltura mostra il CPE o
dopo un periodo di incubazione adeguato, rimuovere il
terreno di crescita dalla provetta e porlo in una provetta
sterile per un ulteriore passaggio, se necessario.
Sciacquare il monostrato con PBS sterile e aspirare.
Aggiungere 0,5 ml di PBS sterile.
Raschiare e rimuovere le cellule dalla superficie della
provetta utilizzando una pipetta di Pasteur. Usare una
pipetta nuova per ciascun isolato.
Utilizzando la stessa pipetta, aspirare delicatamente la
sospensione cellulare per ottenere una sospensione
a una sola cellula. Deve essere presente una quantità
sufficiente di cellule affinché la sospensione appaia
visibilmente torbida.
Porre 5-10 µl del campione trattato su ciascun pozzetto da
5-8 mm su un vetrino per microscopio da 2 pozzetti e su uno
da 8 pozzetti. Ripetere questa procedura per ciascuna
coltura cellulare da esaminare. Lasciare asciugare
completamente il campione all’aria.
Fissare i vetrini con acetone per 10 minuti a temperatura
ambiente (15-28°C). Rimuovere l’acetone dai vetrini e
asciugarli all’aria. Se non è possibile colorare i vetrini
immediatamente, conservarli dessiccati a 2-8°C per una
settimana al massimo prima della colorazione oppure
a –20°C per un anno al massimo.
Fase g
Fase h
Fase i
Fase j
Fase k
Fase l
Fase m
Fase n
Fase o
Fase p
Fase q
Fase r
Porre una goccia di Reagente per il rilevamento dei
virus respiratori (RVP) su un pozzetto di un vetrino
da 2 pozzetti contenente il campione, assicurandosi
che il reagente copra l’intero pozzetto. Ripetere
questa procedura per ciascun vetrino campione da
2 pozzetti.
Porre una goccia di Reagente di controllo negativo per
virus respiratori (RVP) sul pozzetto rimanente di un
vetrino da 2 pozzetti contenente il campione. Ripetere
questa procedura per ciascun vetrino da 2 pozzetti.
Porre il vetrino in una camera umida a 35-37°C per
15-30 minuti.
Porre il vetrino in un contenitore Coplin o in una
ciotola contenente PBS. Lavare il vetrino agitandolo
per 2-4 minuti compresa una sostituzione di PBS.
Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e
montare con Liquido di montaggio per virus respiratori
(RVP) e un coprioggetto. Rimuovere eventuali bolle
d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con carta
assorbente.
Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un
ingrandimento da 100 a 400. Prima di tutto, esaminare
i controlli positivi e negativi per garantire l’efficacia del
Reagente per il rilevamento dei virus respiratori (RVP).
Le cellule infettate dal virus sono evidenziate dalla
fluorescenza verde-mela. L’assenza di fluorescenza
verde-mela indica cellule che non sono infettate da
un virus. Vi è assenza di fluorescenza con i vetrini
colorati con il Reagente di controllo negativo per virus
respiratori (RVP).
Se i campioni da 2 pozzetti non mostrano alcuna
fluorescenza, i risultati vengono refertati come “nessun
virus respiratorio rilevato”.
Se i vetrini da 2 pozzetti mostrano tracce di fluorescenza
con il Reagente per il rilevamento dei virus respiratori
(RVP) e nessuna con il Reagente di controllo negativo
per virus respiratori (RVP), passare alla fase successiva
(o). I blocchi di cellule devono essere valutati con
attenzione poiché è possibile la cattura del coniugato.
Il Reagente di controllo negativo per virus respiratori
(RVP) è in grado di indicare l’entità di tale cattura.
Esaminare il vetrino da 8 pozzetti rimanente per tutti i
campioni e i controlli che mostrano la fluorescenza sul
vetrino da 2 pozzetti. Se i vetrini sono stati conservati
a 2-8°C, lasciare che si stabilizzino a temperatura
ambiente (15-28°C).
Aggiungere una goccia di ciascun singolo reagente di
identificazione dell’anticorpo monoclonale specifico
del virus in modo da coprire un pozzetto separato
del vetrino campione da 8 pozzetti. Ripetere questa
procedura per ciascun vetrino campione.
Porre il vetrino in una camera umida a 35-37°C per
15-30 minuti.
Porre i vetrini in un contenitore Coplin o in una ciotola
contenente PBS. Lavare il vetrino agitandolo per
2-4 minuti compresa una sostituzione di PBS.
Fase s
Picchiettare o assorbire il PBS in eccesso dal vetrino e
montare con Liquido di montaggio per virus respiratori
(RVP) e un coprioggetto. Rimuovere eventuali bolle
d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con carta
assorbente.
Fase t
Esaminare tramite microscopia a fluorescenza con un
ingrandimento da 100 a 400. Esaminare il vetrino di
controllo per virus respiratori per osservare il pattern
caratteristico di immuno-fluorescenza per ciascuna
cellula infettata dal virus con il rispettivo reagente
dell’anticorpo monoclonale specifico del virus. Non
vi è alcuna fluorescenza con il controllo della cellula
LLC-MK2 non infetta.
4.Procedura “shell vial”
Il numero di “shell vial” e di linee cellulari deve essere
determinato dall’operatore del laboratorio di virologia
che esegue questo saggio. Si consiglia anche di indicare
il numero e il tipo di provette di coltura cellulari
adeguate per l’incubazione simultanea con le “shell
vial”.
Fase a Adottando una tecnica sterile per l’intera procedura,
aspirare e gettare il terreno di manutenzione dalle
fiale “shell vial” da inoculare. Non lasciare asciugare il
monostrato cellulare.
Fase b Inoculare ciascuna “shell vial” con 0,2 ml di materiale
di campione e richiudere le fiale.
Fase c Centrifugare le fiale a 600-700×g per 45 minuti a
18-35°C.
Fase d Dopo la centrifuga, aspirare l’inoculo e lavare il
monostrato con 2 ml di PBS sterile o terreno di
mantenimento (preriscaldato a 35-37°C). Aspirare
l’eventuale liquido rimanente. Prima dell’incubazione,
aggiungere 2 ml di terreno di mantenimento della
coltura di tessuto nuovo.
Fase e Incubare le “shell vial” a 33-36°C per 2-4 giorni.
5.
Trattamento e colorazione delle “shell vial”
Fase a Aspirare il terreno di mantenimento in modo da non
distruggere il monostrato cellulare sul coprioggetto
all’interno della fiala.
Fase b Sciacquare due volte il monostrato con 1 ml di PBS,
aggiunto all’interno della fiala per evitare la distruzione
del monostrato cellulare.
Fase c Dopo aver aspirato il lavaggio finale, aggiungere
immediatamente 1 ml di acetone.
Fase d Aspirare l’acetone e aggiungere 1 ml di acetone nuovo.
Lasciare fissare le fiale per 10 minuti a temperatura
ambiente (15-28°C).
Fase e Rimuovere l’acetone e lasciare asciugare il monostrato
cellulare. Se il coprioggetto non deve essere colorato
immedatamente, richiudere la fiala e conservarla
a una temperatura di –20°C o inferiore. Quando il
coprioggetto è pronto per essere colorato, lasciare
che la fiala raggiunga la temperatura ambiente prima
di togliere il tappo.
Fase f
Sciacquare la fiala con 1 ml di PBS per aumentare
la coesione superficiale. Rimuovere il PBS prima di
aggiungere il Reagente per il rilevamento dei virus
respiratori (RVP).
Fase g
Fase h
Fase i
Fase j
Fase k
Aggiungere 2-3 gocce (circa 150 µl) di Reagente per
il rilevamento dei virus respiratori (RVP) alla fiala,
verificando che il reagente ricopra l’intero coprioggetto.
Richiudere la fiala e incubare a 35-37°C per
15-30 minuti.
Aspirare il Reagente per il rilevamento dei virus
respiratori (RVP) e lavare due volte con 1 ml di PBS.
Rimuovere il coprioggetto con una ago o pinze curve
e picchiettare delicatamente o toccare il bordo del
coprioggetto con carta assorbente per rimuovere la
quantità di PBS in eccesso.
Montare ciascun coprioggetto su un vetrino per
microscopio in vetro posizionandolo con il lato con
cellule rivolto verso il basso su una goccia di Liquido di
montaggio per virus respiratori (RVP).
Rimuovere dal coprioggetto eventuali bolle
d’aria e il fluido di montaggio in eccesso con
carta assorbente. Esaminare tramite microscopia
a fluorescenza utilizzando un ingrandimento da
100 a 400.
9. CONTROLLO DI QUALITÀ
I Vetrini di controllo per virus respiratori devono essere colorati
sia con Reagente per il rilevamento dei virus respiratori (RVP) che
con Reagente di controllo negativo per virus respiratori (RVP) con
ciascun lotto di campioni.
I controlli positivi per colture cellulari devono essere preparati
con isolati di virus respiratori di laboratorio conosciuti (ad es.,
provenienti dall’American Type Culture Collection, Rockville, MD)
o con isolati clinici identificati precedentemente.
I controlli negativi per colture cellulari devono essere infettati in
modo fittizio con un terreno di mantenimento, incubati e trattati
allo stesso modo dei campioni clinici.
I controlli delle colture cellulari dimostrano l’efficacia della
procedura di coltura delle cellule e l’intensità nonché il tipo di
fluorescenza dei reagenti per il rilevamento dei virus respiratori.
I vetrini di controllo e i vetrini di isolati virali conosciuti devono
essere letti prima di eseguire la lettura degli isolati paziente al
fine di determinare l’intensità di colorazione della fluorescenza e
il livello di colorazione aspecifica, se presente.
10. INTERPRETAZIONE DEL TEST
Esaminare i controlli prima degli isolati paziente. Per ulteriori
dettagli, fare riferimento alla sezione Controllo di qualità.
NOTA: i risultati devono essere interpretati da un tecnico
addestrato all’utilizzo di un microscopio a fluorescenza.
Preparazioni tradizionali di coltura in provetta
Risultato positivo: le aree di cellule provenienti da provette
positive sospette che mostrano una o più cellule con un pattern
caratteristico a fluorescenza verde-mela brillante su uno fondo
rosso di cellule non infette contro-colorate vengono considerate
positive per il virus respiratorio, a seconda del reagente usato.
Risultato negativo: le aree di cellule che mostrano solo una
colorazione di contrasto rosso scuro delle cellule e nessuna
fluorescenza verde-mela devono essere considerate negative per
i virus respiratori compresi quelli nel processo di colorazione. Vi
dovrebbe essere una fluorescenza aspecifica minima.
Preparazioni per coprioggetto “shell vial” colorati
Risultato positivo: i coprioggetto che mostrano una o più cellule
con un pattern granulare, citoplasmico a fluorescenza verde-mela
brillante su un fondo rosso di cellule contro-colorate e non infette
sono considerati positivi per uno dei 7 virus respiratori compresi
in questo kit. Le cellule infette possono apparire come cellule
singole o multinucleate, a seconda della durata e dello stadio
dell’infezione.
Risultato negativo: i coprioggetto in cui le cellule mostrano
solo una colorazione di contrasto rosso scuro sono considerati
negativi. I risultati negativi devono essere indicati come segue:
“Presumibilmente negativo per il virus RSV, Influenza A o B, virus
1, 2 o 3 della parainfluenza e l’adenovirus tramite saggio “shell
vial” cui devono seguire i risultati della coltura in provetta”. Vi
dovrebbe essere una fluorescenza aspecifica minima.
Tipo di colorazione fluorescente di cellule infette da virus
Il tipo di immunofluorescenza dipende dal virus causativo e dalla
relativa crescita e maturazione all’interno della cellula infetta. I
tipi di colorazione comuni osservati con i virus respiratori sono
descritti qui sotto.
Virus respiratorio sinciziale: la fluorescenza è citoplasmatica,
punteggiata con piccoli inclusioni.
Influenza A e B: la fluorescenza è nucleare, citoplasmatica o
entrambi. La colorazione nucleare è luminosa in modo uniforme
e la colorazione citoplasmatica è spesso punteggiata con grandi
inclusioni.
Parainfluenza 1, 2, 3: la fluorescenza è citoplasmatica, punteggiata
con inclusioni irregolari.
Adenovirus: la fluorescenza è nucleare, citoplasmatica o
entrambi. La colorazione nucleare è luminosa in modo uniforme
e la colorazione citoplasmatica è spesso punteggiata.
Cellule negative: le cellule non infette si coloreranno di rosso per
via della colorazione di contrasto Evans blue in ciascun reagente
di colorazione.
11. LIMITAZIONI
1.
L’acetone assorbirà l’umidità se non viene conservato
adeguatamente. Tale umidità causerà un intorbidamento
aspecifico durante il processo di fissazione. In tal caso, usare
una boccetta di acetone nuova e ripetere il saggio.
2.
Non congelare i campioni prima dell’inoculazione nella
coltura di cellule se non assolutamente necessario. Alcuni
virus possono non resistere al congelamento.
3.
Non lasciare asciugare sul vetrino i reagenti di colorazione
degli anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina.
L’eventuale asciugatura produrrà una colorazione aspecifica
in prossimità dei pozzetti. Verificare che vi sia colorazione
sufficiente per coprire il pozzetto.
4.
La fluorescenza di fondo non associata alla colorazione
superficiale può essere il risultato di un lavaggio insufficiente
che provoca la rimozione incompleta del coniugato di
fluoresceina. In tal caso, rimuovere il coprioggetto, lavarlo
completamente con PBS e rimontarlo.
5.
Una fluorescenza giallo-verde opaca può essere provocata
dal coniugato catturato dalle cellule aggregate che
rendevano difficoltosi la fissazione e il lavaggio. Evitare
l’osservazione di questa area del pozzetto.
6.
È necessario rimuovere la maggior quantità possibile di
muco da un campione per eliminare l’occorrenza di reazioni
falso-positive e falso-negative con gli anticorpi fluorescenti.
Prestare la massima attenzione durante l’interpretazione di
campioni di striscio diretti in presenza di muco.
7.
I vetrini colorati devono essere lavati accuratamente
per evitare che vi siano residui di reagente nei pozzetti
adiacenti. Se si verifica o si sospetta una doppia infezione,
si raccomanda di usare vetrini fissati, separati per ciascun
reagente specifico del virus sospetto per confermare tale
eventualità.
8.
La determinazione dei virus respiratori in campioni coltivati
dipende dal prelievo adeguato del campione, dal trasporto,
dalla tecnica di coltura del tessuto e dalla preparazione del
vetrino.
9.
È possibile riscontrare una colorazione aspecifica dovuta
al legame fra le regioni Fc dell’anticorpo e le proteine A
e G presenti in alcuni ceppi dello Staphylococcus aureus.
Il legame aspecifico potrebbe produrre risultati con un
presunto valore positivo ridotto.
10. Un risultato di test negativo di Respiratory Virus Panel
PathoDx non esclude la possibilità di un’infezione da virus
respiratorio nel paziente. L’interpretazione dei risultati
deve comprendere la valutazione clinica del paziente e
altre procedure diagnostiche. Se si sospetta fortemente la
presenza di un patogeno respiratorio virale è necessario
presentare un altro campione.
11. Gli effetti della terapia antivirale sulla performance di questo
kit sono sconosciuti.
12. Gli anticorpi monoclonali contenuti in questo kit per RSV
e l’adenovirus sono specifici del gruppo e pertanto non
possono essere usati per determinare la specificità del tipo.
13. Una prolungata esposizione alla luce del vetrino colorato
ridurrà anche l’intensità della fluorescenza.
14. I reagenti (tutti i reagenti coniugati con fluoresceina) sono
forniti pronti per l’uso e sono ottimizzati per rilevare i relativi
antigeni virali. La diluizione o un’alterazione del reagente
attivo può produrre perdita di sensibilità o diminuzione di
fluorescenza.
15. L’intensità della fluorescenza osservata dipende dalle
proprietà del microscopio per fluorescenza utilizzato. Il
tipo di microscopio e l’obiettivo, l’età e il tipo di sorgente
luminosa, il gruppo filtro e lo spessore, ecc., sono tutti
fattori che possono influire sulle prestazioni del test.
L’uso del controllo positivo aiuta a monitorare il corretto
funzionamento del microscopio a fluorescenza.
16. Per usare il terreno di mantenimento per la coltura del tessuto
privo di siero può essere necessario aggiungere o cambiare
frequentemente il terreno per il mantenimento delle colture
cellulari.
12. RISULTATI ATTESI
I risultati varieranno in base alla posizione geografica, all’età
della popolazione, alla condizione socio-economica, al periodo
dell’anno, al tipo di laboratorio (ospedale, riferimento, ricerca,
ecc.) e alla manipolazione dei campioni.36-40
13. Caratteristiche di Prestazione
Per dimostrare la specificità del kit Respiratory Virus Panel
PathoDx, sono stati effettuati degli studi per il rilevamento virale
e batterico con ciascun reagente per anticorpo monoclonale
specifico del virus. Qui di seguito sono indicati i risultati ottenuti
quando i vetrini dell’antigene fissati sono stati colorati. Tutti gli
organismi provengono dall’American Type Culture Collection
(ATCC®), se non diversamente specificato.
Tutti gli anticorpi monoclonali specifici del virus non hanno
mostrato alcuna fluorescenza durante il test sulle seguenti linee
cellulari:
ORGANISMO
ANALIZZATO­
Adenovirus
Tipo 3 ATCC® VR 3­
Tipo 5 ATCC® VR 5
Tipo 7 ATCC® VR 7­
Tipo 10 ATCC® VR 11­
Tipo 14 ATCC® VR 15­
Influenza A
A2 ATCC® VR-1OO­
A2 ATCC® VR-544­
A1 ATCC® VR-546
A ATCC® VR-810­
Influenza B
ATCC® VR-103
ATCC® VR-295­
ATCC® VR-296­
ATCC® VR-523­
RSV
Long ATCC® VR-26­
9320 ATCC® VR-955­
Parainfluenza 1
C-35 ATCC® VR-94­
Parainfluenza 2
Greer ATCC® VR-92­
Parainfluenza 3
C 243 ATCC® VR-93­
Virus Coxsackie
A9 ATCC® VR-186­
B4 ATCC® VR-184­
Citomegalovirus
AD-169 ATCC® VR-538­
Echovirus
Tipo 4 ATCC® VR-34­
Tipo 20 ATCC® VR-50­
Tipo 22 ATCC® VR-52­
Herpes Simplex
Tipo 1 ATCC® VR-539­
Tipo 2 ATCC® VR-540­
Morbillo
Isolato clinico
Parotite
Isolato clinico
Rinovirus
Tipo 39 ATCC® VR-340­
Varicella-zoster
Isolato clinico
Rene di scimmia verde africana
Rene di scimmia cynomolgus primaria
Rene di scimmia Rhesus primaria
Rene di scimmia Rhesus
HF (prepuzio umano)
Rene canino Madin-Darby
RSV­
–­
Anticorpi monoclonali specifici del virus
Inf A Inf B PIV 1­ PIV 2­ PIV 3­ Adeno
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
14. Performance clinica
Il Respiratory Virus Panel PathoDx è stato valutato in due centri
clinici negli Stati Uniti medio-occidentali per determinare la
performance clinica del “panel” e dei suoi singoli componenti per
rilevare la presenza di sette virus respiratori.
Il primo centro clinico ha condotto due studi. Il primo studio
comprendeva 150 campioni nuovi e 50 campioni retrospettivi
selezionati a caso. I campioni sono stati prelevati da pazienti di
sesso maschile e femminile con un’età compresa fra 8 giorni e
91 anni. I campioni erano principalmente nasofaringei. I campioni
nuovi e i campioni retrospettivi (totale n = 200) sono stati
analizzati tramite procedura di coltura “shell vial” con l’utilizzo di
saggi RVP PathoDx e Kit A, un saggio disponibile in commercio per
il rilevamento degli stessi sette virus respiratori. Inoltre i campioni
sono stati analizzati tramite la procedura definitiva della coltura
cellulare e i test dei singoli virus tramite Kit A. I risultati per questi
test sono contenuti nella tabella qui sotto.
Il confronto fra il test della coltura “shell vial” Respiratory Virus
Panel PathoDx e il test del singolo virus del Kit A ha dimostrato
che il test della coltura “shell vial” PathoDx ha rilevato tutti i
campioni risultati positivi tramite il test del singolo virus del Kit A,
ad eccezione di un campione RSV.
Risultato
positivo: “Shell
vial” PathoDx
17­
42­
12­
12­
11­
10­
12­
Tipo di campioni
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
Tutti gli anticorpi monoclonali specifici del virus non hanno
mostrato alcuna fluorescenza durante il test sui seguenti batteri:
Bordetella pertussis­
Branhamella catarrhalis­
Chlamydia trachomatis­
Corynebacterium diphtheriae­
Haemophilus influenzae­
Klebsiella pneumoniae­
Legionella pneumophila­
Mycoplasma hominis­
Mycoplasma pneumoniae­
Mycoplasma salivarium­
Pseudomonas aeruginosa­
Staphylococcus aureus­
Staphylococcus aureus­
Streptococcus pneumoniae­
Streptococcus pyogenes­
ATCC® 10380­
ATCC® 8176­
ATCC® VR348B­
ATCC® 19409­
ATCC® 9006­
ATCC® 33495­
ATCC® 33152­
ATCC® 23114­
ATCC® 15531­
ATCC® 23064­
ATCC® 9027­
ATCC® 25178­
ATCC® 12598­
ATCC® 10813­
ATCC® 10389­
A-549­
Vero­
HEp-2­
LLC-MK2­
WI-38­
MRC-5­
RSV­
Grippe A­
Grippe B­
Parainfluenza 1­
Parainfluenza 2­
Parainfluenza 3­
Adenovirus
“Shell vial” Kit A
Positivo
Negativo
Pos.
129­
1­
Neg.
0­
70­
Risultato
positivo: test
singolo Kit A
18­
42­
12­
12­
11­
10­
12­
Concordanza
94%­
100%­
100%­
100%­
100%­
100%­
100%­
“Shell vial” PathoDx
Sensibilità relativa Specificità relativa
100%­
98,6%­
Concordanza: 99,5%
Limiti di confidenza del 95% rispettivamente per la sensibilità
relativa e la specificità: 97,2%-100% e 92,4%-100%.
Il secondo studio in questo centro comprendeva 168 isolati
retrospettivi di coltura cellulare congelati costituiti da 29 campioni
negativi per tutti i sette virus e 139 campioni positivi per uno o più
di sette virus. Tutti i campioni sono stati sottoposti a screening
tramite procedure di coltura cellulare di entrambi i saggi per virus
respiratori PathoDx e Kit A.
Coltura cellulare Kit A
Positivo
Negativo
Concordanza: 99,4%
Coltura cellulare PathoDx
Positivo
Negativo
138­
1­
0­
29­
I campioni positivi del secondo studio sono stati confermati
tramite le procedure per virus in coltura cellulare di entrambi i
saggi per virus respiratori PathoDx e Kit A.
Tipo di campioni
RSV­
Grippe A­
Grippe B­
Parainfluenza 1­
Parainfluenza 2­
Parainfluenza 3­
Adenovirus
Risultato positivo:
coltura cellulare
PathoDx
30­
30­
21­
7­
13­
7­
30­
Risultato
positivo: coltura
cellulare Kit A
30­
30­
21­
7­
14­
7­
30­
Positivo
Negativo
Virus della parainfluenza:
21. Vainionpaa, R. and T. Hypia. 1994. Clin. Microbiol. Rev. 7:265-275.
Concordanza
22. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston. 1993. Manual of Clinical Virology.
Raven Press, New York, NY.
100%­
100%­
100%­
100%­
93%­
100%­
100%­
23. Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag,
New York, NY.
Il secondo centro clinico, anch’esso situato nella parte mediooccidentale degli Stati Uniti, ha interessato 185 pazienti di sesso
maschile e femminile scelti a caso di età compresa fra 1 giorno e
91 anni. Sono stati forniti nuovi campioni, principalmente
nasofaringei. Tutti i 185 campioni sono stati analizzati tramite
procedura per coltura “shell vial” utilizzando entrambi
i saggi PathoDx e Kit B Respiratory Viral Screen Indirect
Immunofluorescence, con i seguenti risultati.
“Shell vial” Kit B
20. Johnston, S.L.G. and C.S. Siegel. 1991. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
14:131-134.
“Shell vial” PathoDx
Positivo
Negativo
43
2
4
136
15. BIBLIOGRAFIA
RSV:
Prelievo e trattamento dei campioni:
30. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston, 1993. Manual of Clinical Virology.
Raven Press, New York, NY. 54-63.
3.
White D.O., and F. Fenner, 1986. Medical Virology. 3 ed. Academic
Press, New York, NY.
34. Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag,
New York, NY. 39-59.
4.
Hall C.B., et al.1976. J. Pediatr. 89:1-15.
35. Spector, S. and G. Lancz.1986. Clinical Virology Manual. Elsevier, New
York, NY. 15-29.
5.
Parrott R.H., et al. 1974. Prev. Med. 3:473-480.
Epidemiologia:
6.
Welliver, R.C. 1988. Clin. Microbiol. Rev. 1:27-39.
7.
Balows, A., W.J. Hausler Jr., K.L. Hermann, H.D. Isenberg, and H.J.
Shadomy. 1991. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed., ASM,
Washington, D.C.
36. Gorbach, S.L., J. G. Bartlett, and N.R. Balcklow. 1992. Infectious
Diseases, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA.
8.
Hall C.B., et al. 1983. N. Engl. J. Med. 308:1443-1447.
9.
Taber, L.H., et al. 1983. Pediatrics. 72:613-618.
37. Fields, B.N., D.M. Knipe, P.M. Howley, R.M. Chanock, J.L. Melnick, T.P.
Monath, B. Roizman, and S.E. Straus. 1996. Fields Virology. 3rd ed.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA.
38. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 1998. Updated: respiratory syncytial
virus activity - United States, 1997-98 season. 48:1043-1045.
11. Kaul A., et al. 1978. Am. J. Dis. Child. 132:1088-1090.
39. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 1997. Updated: influenza activity United States, 1997-98 season. 50:1192-1194.
12. Laur, B.A. 1982. J. Clin. Microbiol. 16:411-412.
40. Halstead, D.C., and S.G. Jenkins. 1998. South. Med. J. 5:433-436.
16. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston. 1993. Manual of Clinical Virology.
Raven Press, New York, NY.
17. Spector, S. and G. Lancz. 1986. Clinical Virology Manual. Elsevier, New
York, NY.
18. Lui, K.J. and A.P. Kendal. 1987. Am. J. Public Health. 77:712-716.
19. Dolin, R., et al. 1982. N. Engl. J. Med. 307: 580-584.
Data di scadenza
Fabbricante
29. Gary, G.W., et al. 1979. Characteristics of noncultivable adenoviruses
associated with diarrhea in infants: a new subgroup of human
adenoviruses. 10:96-103.
Fields, B.N., D.M. Knipe, J.L. Melnick, R.M. Chanock, B. Roizman, and
R.E. Shope. 1985. Virology. Raven Press, New York, NY.
15. Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag,
New York, NY. 247-260.
Numero lotto
28. Foy, H.M., et al. 1968. Arch. Environ. Health. 17:795-802.
2.
Virus dell’influenza:
Limiti di temperatura
27. Brandt, C.D., et al. 1969. Am. J. Epidemiol. 90:484-500.
33. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken.
2003. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed., Vol II. ASM, Washington,
D.C.
14. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston. 1993. Manual of Cinical Virology.
Raven Press, New York, NY.
Consultare le Istruzioni per l’uso
26. Wiedbrauk, D.L. and S.L.G. Johnston 1993. Manual of Clinical Virology.
Raven Press, New York, NY. 54-63.
Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag,
New York, NY. 247-260.
13. Minnich, L. and C.G. Ray. 1982. J. Clin. Microbiol. 12:391-394.
Per uso in laboratorio
Adenovirus:
1.
10. McQuillin J., and P.S. Gardner. 1968. Br. Med. J. 1:602-605.
Dispositivo medico per la diagnostica in vitro
25. Balows, A., W.J. Hausler Jr., K.L. Hermann, H.D. Isenberg and H.J.
Shadomy. 1991. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. ASM,
Washington, D.C.
32. Spector, S. and G. Lancz. 1986. Clinical Virology Manual. Elsevier, New
York, NY. 15-29.
rd
Numero catalogo
24. Wenzel, R.P., et al. 1972. J. Am. Med. Assoc. 221:294-295.
31. Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis
of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag,
New York, NY. 1-11.
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