Lavoro di diploma di Claudia Dagani, SSMT, 2013.

Claudia Da
agani
La
avoro di Diplo
oma 2013
Formazione
F
T
Tecnico in ana
alisi biomedic
che SSS
Scuola Sup
periore Medico
o Tecnica, Lo
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CORR
RELAZIONE TRA
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CITOGE
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ASTICHE
Lavo
oro svolto pres
sso Laborato
orio di Citogen
netica EOLAB
B, sede ORBV
V Bellinzona
Responsa
abili: Dr.ssa M
Monica Taborrelli e Dr.ssa Barbara
B
Dosssena
Indice
1 Riassunto/Abstract ..............................................................................................3
2 Introduzione .........................................................................................................4
2.1 Citogenetica .................................................................................................................... 4
2.1.1 Il ciclo cellulare ........................................................................................................... 4
1.1.1 I cromosomi ................................................................................................................ 6
2.1.2 Cariotipo umano ......................................................................................................... 7
2.1.3 Anomalie cromosomiche ............................................................................................ 8
2.1.4 Citogenetica convenzionale ........................................................................................ 9
2.1.5 Ibridazione fluorescente in situ ................................................................................. 10
2.2 Sindromi Mielodisplastiche ......................................................................................... 11
2.2.1 Diagnosi.................................................................................................................... 11
2.2.2 Quadro clinico........................................................................................................... 11
2.2.3 Classificazione.......................................................................................................... 12
2.2.4 Citogenetica nelle Sindromi Mielodisplastiche .......................................................... 13
2.2.4.1 Monosomia 5 o del(5q) ...................................................................................... 14
2.2.4.2 Monosomia 7 o del(7q) ...................................................................................... 14
2.2.4.3 Trisomia 8 .......................................................................................................... 14
2.2.4.4 del(17p13)/del p53 ............................................................................................. 15
2.2.4.5 del(20q) .............................................................................................................. 15
2.2.5 Prognosi ................................................................................................................... 15
3 Obiettivo .............................................................................................................19
4 Materiali e metodi ..............................................................................................20
4.1 Campioni.................................................................................................................. 20
4.2 Tecniche di coltura e trattamento del campione ................................................. 20
4.3 Bandeggio e acquisizione ...................................................................................... 21
4.4 Ibridazione in situ fluorescente (FISH) ................................................................. 21
4.4.1 Sonde ....................................................................................................................... 21
4.4.2 Procedimento ........................................................................................................... 25
5 Risultati...............................................................................................................27
6 Discussione........................................................................................................29
7 Conclusione .......................................................................................................32
1
8 Ringraziamenti ...................................................................................................33
9 Bibliografia .........................................................................................................34
Allegati .....................................................................................................................35
Indice delle Figure
Figura 1 Ciclo cellulare caratterizzato dall’alternanza tra Interfase (I) e Mitosi (M) [2] ............................................. 4
Figura 2 Ultima fase dell'interfase (G2) e fasi della mitosi [2] .................................................................................. 5
Figura 3 Tipi di cromosomi ....................................................................................................................................... 7
Figura 4 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio Q ................................................................................. 9
Figura 5 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio G ............................................................................... 10
Figura 6 Ideogramma Cromosoma 1 [3] ................................................................................................................ 10
Figura 7 Greenberg et al., sopravvivenza (A) e rischio di evoluzione leucemica (B) in pazienti con MDS in base
all'anomalia citogenetica [9] ................................................................................................................................... 17
Figura 8 Sonda Vysis LSI EGR-1(5q31)) [12] ........................................................................................................ 21
Figura 9 Sonda Vysis LSI/D5S721,D5S23(5p15.2) [12] ........................................................................................ 22
Figura 10 Cellula normale ibridata con Sonda Vysis LSI EGR-1/D5S721,D5S23 [12]........................................... 22
Figura 11 Sonda Vysis D7S522(7q31)/CEP7(5p11.1-q11.1) [12] .......................................................................... 22
Figura 12 Sonda Vysis D7S522(7q31) [12] ............................................................................................................ 23
Figura 13 Cellula normale ibridata con sonda Vysis D7S522/CEP7 [12] ............................................................... 23
Figura 14 Sonda Cytocell Cep8 [13] ...................................................................................................................... 23
Figura 15 Sonda Cytocell P53 Deletion [13] .......................................................................................................... 24
Figura 16 Sonda Cytocell p53 [13] ......................................................................................................................... 24
Figura 17 Sonda Cytocell del(20q12-13-12) [13] ................................................................................................... 24
Figura 18 Sonda Cytocell del(20q) [13] .................................................................................................................. 25
Figura 19 Analisi citogenetica monosomia 5 – del(5q)........................................................................................... 29
Figura 20 Analisi citogenetica monosomia 7 – del(7q)........................................................................................... 30
Figura 21 Analisi citogenetica trisomia 8 ................................................................................................................ 30
Figura 22 Analisi citogenetica del(17p13) .............................................................................................................. 30
Figura 23 Analisi citogenetica del(20q) .................................................................................................................. 31
Indice delle Tabelle
Tabella 1 Indicazione di specifiche anomalie strutturali [3] ...................................................................................... 8
Tabella 2 Classificazione MDS FAB [6] [7] ............................................................................................................ 12
Tabella 3 Classificazione MDS WHO [7]................................................................................................................ 13
Tabella 4 Sistema prognostico IPSS...................................................................................................................... 16
Tabella 5 Sistema prognostico R-IPSS .................................................................................................................. 18
Tabella 7 Casi con del(5q) / Monosomia 5 ............................................................................................................. 27
Tabella 8 Casi con del(7q) / Monosomia 7 ............................................................................................................. 27
Tabella 9 Casi con Trisomia 8................................................................................................................................ 28
Tabella 10 Casi con del(17p13) ............................................................................................................................. 28
Tabella 11 Casi con del(20q) ................................................................................................................................. 28
2
1 Riassunto
Abstract
L’analisi citogenetica in un contesto di sindrome
mielodisplastica (MDS) rappresenta un importante elemento
diagnostico e prognostico. Nel 40 - 60% dei pazienti affetti da
MDS sono infatti presenti aberrazioni cromosomiche ricorrenti
che possono essere evidenziate sia tramite analisi
citogenetica convenzionale che per mezzo dell’analisi FISH,
analisi citogenetica molecolare.
Cytogenetic analysis is an essential tool for diagnostic and
prognostic assessment of myelodysplastic syndrome (MDS).
About 40-60% of patients affected by MDS show recurrent
chromosomal aberrations, which can be detected either by
conventional cytogenetic analysis or by FISH analysis,
molecular cytogenetic analysis.
L’obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di
analizzare i risultati dell’analisi citogenetica svolta su
campioni di sangue midollare con diagnosi di sindrome
mielodisplastica confermata (dal 2009 al 2012, eseguite
presso il laboratorio di Citogenetica dell’Ente Ospedaliero
Cantonale), correlando le anomalie identificate con la
citogenetica convenzionale, ossia l’analisi del cariotipo, con
quelle studiate con la FISH
The aim of this diploma study was to interpret the results of
the cytogenetic analysis of samples of bone marrow blood
from patients affected by myelodysplastic syndrome
(submitted in years from 2009 to 2012, at the Laboratory of
Cytogenetics Cantonal Hospital). The purpose was to find
possible correlations between chromosomal abnormalities
identified by conventional cytogenetic analysis (by karyotype)
and those identified by FISH analysis.
Le anomalie rilevanti per un contesto di MDS, sulle quali si è
focalizzato questo studio sono: la delezione del braccio lungo
del cromosoma 5 (del(5q)) e 7 (del(7q), la monosomia del
cromosoma 5 (-5) e 7 (-7), la trisomia del cromosoma 8 (+8),
la delezione del braccio corto del cromosoma 17 (del(17p)) e
la delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (del(20q)).
The anomalies relevant to a context of MDS, which
represented the object of this correlation study were: the
deletion of the long arm of chromosome 5 (del(5q)) and 7
(del(7q), monosomy of chromosome 7 (-7), trisomy of
chromosome 8 (+8), deletion of the short arm of chromosome
17 (del(17p)) and deletion of the long arm of chromosome 20
(del(20q)).
I casi che all’analisi del cariotipo e/o all’analisi FISH hanno
presentato le anomalie studiate sono stati 27, per i quali
l’analisi FISH si è dimostrata fondamentale per
l’identificazione di: 6 casi su 15 di del(5q), 3 casi su 6 di -7, 2
casi su 2 di del(17p) e 1 caso su 9 di del(20q). La
correlazione tra citogenetica convenzionale e la FISH per
quanto riguarda la trisomia del cromosoma 8 è risultata totale
in tutti i casi presi in esame. Per la delezione del braccio
lungo del cromosoma 20, la correlazione è risultata quasi
completa: solo in un caso infatti, l’anomalia è stata
evidenziata solo per mezzo della FISH. Tuttavia in FISH la
delezione era presente in un piccolo clone (5%), motivo per
cui all’analisi del cariotipo tale aberrazione non è stata
rilevata.
27 cases presented one of the anomalies of interest, either by
the analysis of the karyotype and / or by FISH analysis. FISH
analysis was found to be essential for the identification in 6 of
15 cases for del(5q), in 3 of 6 cases for -7, 2 of 2 cases for
del(17p) and in 1 of 9 cases for del(20q). The correlation
between conventional cytogenetic and FISH regarding the
trisomy of chromosome 8 was 100% in all the 6 cases
examined. Concerning the deletion of the long arm of
chromosome 20, the correlation was nearly complete: in one
case, the abnormality was detected by FISH analysis only.
However, FISH detected the aberration in a small clone (5%);
this observation is considered to be the reason why the
karyotype analysis could not be useful for reporting this
aberration.
In conclusione, da questo studio è possibile affermare che,
nei casi in cui all’analisi citogenetica convenzionale vengono
evidenziate la presenza di trisomia del cromosoma 8 e la
delezione del braccio lungo del cromosoma 20, potrebbe non
essere necessario, all’arrivo del campione, pianificare l’analisi
FISH con le sonde specifiche per i cromosomi 8 e 20.
Based on the analysis of samples in the mean of this study, it
was possible to assert, that in cases where conventional
cytogenetic analysis detected the presence of trisomy of
chromosome 8 and the deletion of the long arm of
chromosome 20, FISH analysis seemed not be crucial for the
diagnosis, thus confirming high correlation between the two
techniques.
L’analisi FISH tuttavia si è dimostrata utile nel rilevare
aberrazioni cromosomiche mirate, in base alla scelta della
sonda, che non risultano visibili con l’analisi del solo cariotipo
(la qualità di risoluzione dell’analisi del cariotipo è limitata ad
aberrazioni macroscopiche). Inoltre nella FISH, oltre ad
essere esaminato un numero di nuclei (200) nettamente
superiore rispetto all’analisi del cariotipo (20 metafasi), la
possibilità di utilizzare la tecnica su nuclei in interfase ne
amplia il campo di applicazione, rendendo possibili analisi
mirate anche in casi in cui non siano disponibili metafasi
d’idonea qualità e quantità.
However, through FISH analysis by using specific probes it
was possible to detect targeted chromosomal aberrations,
which were not visible by karyotype analyses: the quality of
resolution in karyotype analysis instead, is limited to
macroscopic aberrations. Moreover, using FISH the number
of analyzed nuclei (200) is significantly higher than in the
analysis of the karyotype (20 metaphases); and not least, the
possibility of using interphase nuclei for targeted analysis,
even in cases where metaphases of suitable quality and
quantity are not available, extend the field of application of the
cytogenetic analysis.
3
2 Introduzione
2.1 Citogen
netica
La ccitogenetica umana è nata
n
nel 19
956, anno in cui fu de
efinito l’esattto numero diploide di
crom
mosomi uman
ni in 46 da Tijo
T e Levan
n [1]. Questa
a pubblicazione costituissce il fondamento dello
o
svilup
ppo sia della
a citogenetic
ca umana cche della genetica medica. Negli annni successivi numerosi
furon
no gli studi che definirrono anoma
alie a livello
o cromosom
mico in pazzienti affetti da alcune
e
patologie umane
e. La prima
a osservaz ione di un’’aberrazione
e cromosom
mica signific
cativamente
e
a specifica neoplasia,
n
id
dentificata come
c
il crom
mosoma Phiiladelphia, caratteristico
c
o
associata ad una
in pa
azienti affetti da leucemia mieloide ccronica, costituì l’inizio di
d un campoo di ricerca che
c avrebbe
e
efinizione del
d significa
ato diagnostico e prog
gnostico di numerose aberrazionii
condotto alla de
mosomiche non
n casuali nelle
n
neopla sie.
crom
Gli E
Ematologi si avvalgono del
d contributto della citog
genetica per i problemi diagnostici, prognosticii
e terrapeutici di alcune mala
attie leucem
miche e di altri
a disordin
ni ematopoieetici. Nelle emopatie
e
lo
o
studio dei cromo
osomi è ese
eguito in ge
enere sulle cellule
c
del midollo
m
osseeo, poiché ili midollo, a
ggio di conttenere un’elevata quanttità di cellulle allo stato
o
differrenza di altrri tessuti, offfre il vantag
libero
o ed in attiva
a moltiplicaz
zione.
2.1.1 Il ciclo cellulare
e
La crrescita di un
n tessuto avv
viene tramite
e moltiplicaz
zione delle proprie
p
celluule, seguend
do una serie
e
di pro
ogrammate e ben defin
nite fasi. Il c iclo vitale di una cellula
a è caratterizzzato dall’alternanza di
interffase (I) e divisione cellu
ulare o mito
osi (M) (Figu
ura 1). L’inte
erfase ha loo scopo di preparare
p
la
a
cellulla alla mitossi per la qua
ale è necesssaria la duplicazione di
d tutte le coomponenti cellulari
c
e la
a
sintesi delle struttture necess
sarie alla rea
alizzazione della
d
divisione cellulare..
Il perriodo di rep
plicazione ce
ellulare in ccoltura dura generalmen
nte dalle 122 alle 48 orre. Poiché il
perio
odo mitotico dura meno di un’ora, pe
er gran parte
e del tempo la cellula sii trova in inte
erfase (I).
Figura 1 Ciclo cellulare caratte
erizzato dall’alte
ernanza tra Inte
erfase (I) e Mitossi (M) [2]
4
L’interfase I inizia con la fase G1, caratterizzata da un’attiva sintesi proteica e dalla formazione di
organuli citoplasmatici. Segue la fase S, in cui avviene la duplicazione del DNA: il corredo
cromosomico viene duplicato per mezzo della sintesi degli acidi nucleici, in modo tale che
ciascun cromosoma risulta costituito da due cromatidi identici. Segue infine la fase G2 in cui
vengono sintetizzate tutte le strutture necessarie per lo stadio mitotico. A mitosi terminata, prima
dell’inizio di un nuovo ciclo, la cellula può rimanere in uno stato di quiescienza per un tempo
anche prolungato (fase G0). Durante l’interfase, all’esterno del nucleo vi è un sistema di
microtubuli, essenziali per i vari processi dell’interfase, che si irradia all’interno del citoplasma a
partire da un centro singolo di organizzazione, definito come centrosoma. Il centrosoma è
costituito da due organelli chiamati centrioli; normalmente è localizzato vicino alla membrana
nucleare e anch’esso viene duplicato durante la fase S.
Figura 2 Ultima fase dell'interfase (G2) e fasi della mitosi [2]
La mitosi è un processo continuo che viene tradizionalmente suddiviso in quattro fasi: profase,
metafase, anafase e telofase. (Figura 2).
La divisione cellulare richiede la presenza di una struttura chiamata apparato mitotico che
comprende un fuso di microtubuli, disposti longitudinalmente ai due poli della cellula. L’apparato
mitotico è visibile nel citoplasma solo durante la fase M del ciclo, poiché esso si disaggrega
rapidamente al termine della mitosi.
Durante l’interfase il contenuto del nucleo rimane intatto e i cromosomi appaiono come aggregati
di cromatina indistinguibili. Nella profase, l’inizio della mitosi è caratterizzato da un graduale
compattamento dei singoli cromosomi, detto anche condensazione. Ogni cromosoma che si
condensa si è duplicato in interfase ed è così costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del
centromero. Con la condensazione, i cromosomi si trasformano da uno stato metabolicamente
attivo ad una condizione che li rende pronti per il successivo trasporto nelle cellule figlie. Un altro
cambiamento coinvolge il nucleolo, il quale inizia a frammentarsi, per poi scomparire. Diversi
importanti processi che caratterizzano la profase hanno lungo anche all’esterno del nucleo, nel
citoplasma. I centrosomi, che si sono duplicati in interfase, si dividono e sono chiaramente
5
distinguibili come due entità separate, visibili al microscopio ottico. Allo stesso tempo, i
microtubuli crescono e si contraggono rapidamente verso i propri centri di organizzazione dei
centrosomi. I centrosomi continuano a separarsi, migrando attorno alla membrana nucleare verso
le estremità opposte del nucleo.
Durante lo stadio della metafase i cromosomi sono liberi nel citoplasma, mentre i centrioli, fino a
questo momento appaiati, si separano l’uno dall’altro e migrano in direzione opposta, seguendo
un fascio di fibre che formano il fuso mitotico. Le coppie di cromatidi si muovono sul fascio di fibre
su un piano immaginario, detto piastra equatoriale, che taglia a metà la cellula. In questa fase i
cromosomi raggiungono il massimo grado di visibilità al microscopio ottico, grazie alla loro forte
spiralizzazione.
Durante l’anafase i due cromatidi di ciascun cromosoma si separano e si spostano, uno verso un
polo della cellula e l’altro verso il polo opposto. In questo modo ciascuna metà cellula riceve un
uguale numero di cromatidi.
Durante la telofase infine, i singoli cromatidi cominciano a decondensarsi e si riforma la
membrana nucleare. Con la divisione citoplasmatica infine si originano due cellule figlie, costituite
dallo stesso corredo genetico della cellula madre iniziale. Le cellule entrano poi di nuovo in
interfase e il ciclo si ripete. [2]
1.1.1 I cromosomi
Il DNA contiene l’informazione biologica sotto forma di unità definiti come nucleotidi. Quattro basi
azotate, adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T), sono le componenti essenziali dei
nucleotidi. Coppie di basi complementari (A con T, C con G), formano due filamenti antiparalleli
uniti da legami idrogeno. Il DNA nel nucleo è associato a molecole proteiche, con le quali forma
un materiale fibroso definito cromatina. Per mezzo di specifiche colorazioni, durante l’interfase, la
cromatina risulta visibile al microscopio ottico come una massa di materiale disperso. Quando la
cellula si appresta a dividersi, le sottili fibre di cromatina si condensano progressivamente
divenendo visibili in strutture singole definite cromosomi.
Il DNA contenuto nei cromosomi specifica la composizione dei geni nel genoma umano e la loro
espressione. Nelle cellule somatiche (diploidi), ogni cromosoma è presente in due copie che
costituiscono una coppia di cromosomi omologhi, uno di origine paterna ed uno di origine
materna. I cromosomi omologhi contengono un’informazione genetica uguale, con stessi geni,
disposti nella stessa sequenza. Ad ogni specifico locus essi possono avere forme identiche o
leggermente differenti di uno stesso gene, chiamati alleli.
Durante la metafase mitotica, i cromosomi appaiono al microscopio ottico ben definiti nei due
cromatidi. La costrizione primaria nei cromosomi, ossia la regione in cui i due cromatidi sono a
stretto contatto, viene definito centromero. A seconda della posizione del centromero, che divide
il cromosoma in due braccia, il braccio corto (p) ed il braccio lungo (q), è possibile distinguere 3
tipi di cromosomi (Figura 3):
- cromosomi metacentrici: centromero in posizione centrale
- cromosomi submetacentrici: centromero in posizione terminale
- cromosomi acrocentrici: centromero localizzato all’estremità del cromosoma; può presentare
dei satelliti (contenenti centinaia di copie di geni che codificano per gli RNA ribosomiali) [2] [3]
6
C. metacentrico
C. submetac
centrico
C. aacrocentrico
F igura 3 Tipi di cromosomi
c
2.1.2
2 Cariotiipo uman
no
Nella
a specie umana, il numero di crom osomi è 46, di cui 44 sono
s
chiamaati autosomi e 2 sono i
crom
mosomi sesssuali (XX ne
ella femmina
a e XY nel maschio). L’Internationnal System for Human
n
la guida di riferimento
Cytog
genetic Nom
menclature rappresenta
r
r
per
p l’analisi ccitogenetica
a umana [3].
L'ordinamento de
ei cromosom
mi di una ce
ellula viene definito
d
cario
otipo: i crom
mosomi sono
o disposti in
n
coppie di omolo
oghi, allineatti in ordine decrescente di grande
ezza. I 46 ccromosomi umani
u
sono
o
mi sessuali X e Y; la lunnghezza dei cromosomii
classsificati nelle coppie da 1 a 22, più i cromosom
decre
esce progressivamente passando d
dalla coppia 1 alla coppia 22, ad ecccezione dei cromosomii
21 e 22, il cui ord
dine di grand
dezza è inve
ertito.
Le 22
2 coppie di autosomi vengono
v
sud
ddivisi in 7 gruppi, cias
scuno dei quuali è indica
ato con una
a
letterra maiuscola
a dell’alfabetto, dalla A a
alla G:
-
grruppo A: gra
andi metacen
ntrici (cromo
osomi 1-3)
grruppo B: gra
andi submeta
acentrici (cro
romosomi 4--5)
grruppo C: sub
bmetacentric
ci di media g
grandezza (cromosomi 6-12)
grruppo D: acrrocentrici di media gran
ndezza, con eventuale presenza
p
di ssatelliti (cromosomi 13-15
5)
- grruppo E: piccoli submeta
acentrici (cro
romosomi 16
6-18)
- grruppo F: picccoli metacen
ntrici (cromo
osomi 19-20
0)
- grruppo G: picccoli acrocen
ntrici, con evventuale pre
esenza di satelliti (cromoosomi 21-22
2)
Il cro
omosoma X è anch’es
sso definito
o submetacentrico, me
entre il crom
mosoma Y è di taglia
a
di gruppo G,
corrisspondente a quella dei cromosomi
c
d
G ma non presenta sateelliti.
La d
descrizione del cariotipo include n
nell’ordine: il numero totale
t
dei ccromosomi, compresi i
crom
mosomi sesssuali; separa
ati da una vvirgola, veng
gono poi ind
dicati i crom
mosomi sess
suali: 46,XX
X
per u
un cariotipo normale femminile e 4
46,XY per un cariotipo normale maaschile. Nel caso in cuii
vengano descrittte eventuali anomalie cromosomic
che prima vengono
v
ripportate le an
nomalie dei
crom
mosomi sessuali e poi qu
uelle che coiinvolgono glli autosomi, in ordine nuumerico cres
scente.
7
2.1.3 Anomalie cromosomiche
Le anomalie dei cromosomi possono essere sia numeriche che strutturali e possono coinvolgere
uno o più autosomi, i cromosomi sessuali, o entrambi contemporaneamente.
Tra le anomalie cromosomiche di tipo numerico, la più importante dal punto di vista clinico è
l’aneuploidia, un difetto nel numero di cromosomi dovuto dalla presenza di cromosomi
soprannumerari o dalla perdita di cromosomi. L’aneuploidia si presenta generalmente come
monosomia (solo un elemento di una coppia di cromosomi) e la trisomia (tre cromosomi invece
della normale coppia di un particolare cromosoma).
I riarrangiamenti cromosomici strutturali sono il risultato di rotture cromosomiche, seguite da
ricostituzione cromosomica in una combinazione anomala. Le delezioni coinvolgono la perdita di
un segmento di cromosoma da cui risulta un cromosoma non bilanciato.
Un’anomalia cromosomica viene definita clonale quando:
- almeno 2 cellule sono caratterizzate dalla stessa anomalia strutturale o dalla stessa
acquisizione di materiale cromosomico
- almeno 3 cellule presentano la stessa perdita di materiale cromosomico
Le formule relative a diversi cloni cellulari vengono separate dal simbolo “/”; ciascuna formula è
seguita poi da una parentesi quadra “[ ]” ad indicare quante cellule formano il clone trovato.
Alcuni simboli utilizzati nella descrizione del cariotipo, vengono riportati alla Tabella 1.
Tabella 1 Indicazione di specifiche anomalie strutturali [3]
;
Usato nei riarrangiamenti strutturali per separare cromosomi o regioni.
-
Delezione. Indica cromosoma mancante, se il segno precede il cromosoma; cromosoma di minore
lunghezza, se il segno segue il cromosoma.
+
Cromosoma soprannumerario, se il segno precede il cromosoma; cromosoma di maggiore lunghezza, se
il segno segue il cromosoma.
˜
Indica un valore approssimativo e può riferirsi al range del numero dei cromosomi e ad uno specifico
segmento.
add
Materiale aggiuntivo di origine non definita.
del
Delezione.
der
Derivativo. Un cromosoma è definito derivativo quando presenta più di un riarrangiamento, oppure
quando presenta un riarrangiamento sbilanciato che coinvolge due o più cromosomi.
dup
Duplicazione.
inv
Inversione.
mar
Cromosoma marcatore.
s
Satellite. Il simbolo è preceduto dal cromosoma acrocentrico cui si riferisce.
t
Traslocazione.
8
Esempi di scrittura:
- 47,XY,+8[9]/46,XY[16]: in 9 metafasi su 25 analizzate è stato osservato un cariotipo maschile
di 47 cromosomi caratterizzato dalla trisomia del cromosoma 8. Nelle restanti metafasi è stato
osservato un cariotipo composto da 46 cromosomi maschile normale
- 46,XX,del(5)(q21qter)[23]/46,XX[2]: in 23 metafasi su 25 analizzate è stato osservato un
cariotipo femminile composta da 46 cromosomi caratterizzato dalla delezione terminale del
braccio lungo del cromosoma 5. Nelle restanti metafasi è stato osservato un cariotipo
composto da 46 cromosomi femminile normale
Quando la complessità del cariotipo è elevata al punto da non poter identificare dei cloni, ma
talune anomalie sono condivise da più cellule, può essere definito un cariotipo complesso, che
riporta il range di numero di cromosomi nelle cellule prese in considerazione e le anomalie la cui
frequenza rispetti la definizione di clonalità citogenetica. [3] [4]
2.1.4 Citogenetica convenzionale
La citogenetica convenzionale si avvale di diverse colorazioni di bandeggio che permettono di
evidenziare delle bande lungo i cromosomi, consentendo la classificazione di ogni coppia di
cromosomi con accuratezza in base alle caratteristiche specifiche del bandeggio.
Tra le tecniche più utilizzate nei laboratori di citogenetica vi è il bandeggio con mostarda di
quinacrina ed il bandeggio con Giemsa. Il bandeggio con mostrarda di quinacrina è definito
bandeggio Q e le bande evidenziate, all’osservazione con la luce ultravioletta, sono chiamate
bande Q (Figura 4). La produzione di diverse bande dipende dalla non uniforme organizzazione
del DNA, dove regioni eucromatiche, con tratti ricchi in coppie di Adenina e Timina (segmenti a
replicazione precoce), si alternano a regioni eterocromatiche con tratti ricchi in coppie di Guanina
e Citosina (segmenti a replicazione tardiva).
Il bandeggio G (Figura 5), ottenuto da trattamento con tripsina ed in seguito con il colorante
Giemsa è caratterizzato da un’alternanza di bande chiare e scure, che risultano corrispondenti e
sovrapponibili alle bande Q.
Figura 4 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio Q
9
Figura 5 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio G
Il centromero divide idealmente ogni cromatide di ciascun cromosoma nel suo braccio corto (p), e
nel braccio lungo (q). Ciascun braccio è poi ulteriormente suddiviso in regioni, numerate
consecutivamente a partire dal centromero verso l’estremità o terminus (ter) del braccio stesso.
All’interno di ciascuna regione vi sono le bande, anch’esse numerate progressivamente partendo
da quella più vicina al centromero. Le bande possono essere divise in sottobande (visibili nei
cromosomi della tarda profase, fusionati in una banda singola nei cromosomi metafasici), indicate
usando un punto decimale dopo il numero della banda seguito da numeri progressivi, partendo
sempre dal punto più vicino al centromero. Ad esempio la sigla 1p36.2, si riferisce alla
sottobanda 2 nella banda 6 appartenente alla regione 3 del braccio corto del cromosoma 1
(Figura 6). [2] [3] [5]
Figura 6 Ideogramma Cromosoma 1 [3]
2.1.5 Ibridazione fluorescente in situ
L’ibridazione fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation, FISH) è una tecnica
citogenetica che può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l’assenza di
specifiche sequenze di DNA su dei nuclei fissati su vetrino (ibridazione in situ), sia in cromosomi
metafasici che nella cromatina in interfase. Per l’analisi FISH si fa capo a sonde marcate con dei
fluorocromi che si legano in modo estremamente selettivo a sequenze nucleotidiche lungo i
cromosomi. La microscopia a fluorescenza permette infine individuare il sito di legame tra la
sonda e il cromosoma.
Nelle tecniche d’ibridazione in situ a scopo diagnostico vengono utilizzati diversi tipi di sonde. In
campo oncoematologico vengono prevalentemente utilizzate sonde di tipo centromerico o alfoidi
e locus specifiche.
La sonda centromero-specifica è costituita da un tipo di sequenze ripetute
nei centromeri. Sono state isolate sequenze alfoidi specifiche per il
cromosoma. L’ibridazione con una sonda centromero-specifica marcata
permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei centromeri di una
omologhi.
10
dette alfoidi, presenti
centromero di ogni
con un fluorocromo
coppia di cromosomi
L’ibridazione con una sonda locus specifica marcata con un fluorocromo permette la
visualizzazione di segnali fluorescenti a livello di una regione sul braccio corto o sul braccio lungo
di una coppia di cromosomi omologhi. [2] [3] [5]
2.2 Sindromi Mielodisplastiche
Le sindromi mielodisplastiche (Myelodysplastic Syndrome, MDS) rappresentano un gruppo di
disordini del midollo osseo che coinvolgono la cellula staminale emopoietica. Interessano
tipicamente ma non solo, i soggetti anziani: l’incidenza media è stimata a 3-5 casi ogni 100’000
persone per anno, mentre oltre i 70 anni di età, l’incidenza può superare i 20 casi ogni 100’000
persone per anno.
Le MDS sono caratterizzate da un’ematopoiesi inefficace, alterazioni morfologiche displastiche a
carico delle principali filiere emopoietiche (eritrociti, neutrofili e trombociti), citopenia periferica,
progressiva insufficienza midollare ed un aumentato rischio di progressione in leucemia acuta
mieloide (AML).
Il quadro diagnostico mielodisplasia può essere primitivo, senza identificazione cioè di alcuna
causa eziologicamente significativa, oppure secondario in seguito all’esposizione a fattori tossici
(solventi organici, pesticidi; assunzione di alchilanti o altri citostatici; esposizione a radiazioni
ionizzanti e a piombo; trattamenti con antibiotici;…).
La sopravvivenza dei pazienti affetti da MDS varia da alcuni mesi a diversi anni per cui risulta di
primaria importanza avere a disposizione un sistema classificativo e di valutazione prognostica
che permettano di predire la probabilità di sopravvivenza e di evoluzione in AML allo scopo di
definire il più corretto approccio terapeutico. [6] [7]
2.2.1 Diagnosi
Il percorso che porta a formulare una diagnosi di MDS si avvale di numerosi mezzi quali
l’emogramma, l’analisi morfologica dell’aspirato midollare, la biopsia osteomidollare e non da
ultimo, l’analisi citogenetica su sangue midollare.
2.2.2 Quadro clinico
La maggior parte dei pazienti affetti da MDS presenta sintomi correlati alla citopenia: per lo più si
manifesta anemia; meno frequenti invece la neutropenia e la trombocitopenia.
Quasi tutti i pazienti affetti da MDS presentano un valore di emoglobina poco inferiore alla norma
(<12 g/dL per le donne, <14 g/dL per gli uomini), anche se spesso si può presentare un quadro
anemico di grave entità. L’anemia è generalmente macrocitica o, meno frequentemente,
normocitica, con anisopoichilocitosi, ipocromia e presenza di emazie con punteggiatura basofila.
Il quadro anemico è generalmente riconducibile ad un’inefficace eritropoiesi, la cui natura peraltro
rimane poco chiara.
Il quadro clinico conseguente alla leucopenia (<2.5 x109/L) nelle MDS è contrassegnato dalla
comparsa di frequenti infezioni che possono peraltro rappresentare la più frequente causa di
morte di questi malati. La maggior parte delle infezioni è di tipo batterico, con manifestazioni di
tipo pneumonico e setticemico. Accanto alla riduzione quantitativa dei neutrofili, le infezioni in
11
pazienti con MDS sono caratterizzate anche da un’alterata funzionalità di questi elementi, in
particolare da un deficit di attività chemiotattica, fagocitica e di killing.
Una diminuzione del tasso piastrinico è relativamente comune nel corso di una MDS; anche se
generalmente non di grave entità (< 100 x109/L), può rappresentare l’unico segno d’esordio della
malattia. Spesso la trombocitopenia è associata ad alterazioni morfologiche delle piastrine
(piastrine giganti o agranulari) ed a disturbi funzionali delle stesse, quali un tempo di
sanguinamento allungato anche in presenza di valori piastrinici normali e ridotta aggregazione
all’adrenalina ed al collagene. Una caduta rapida a valori molto bassi del tasso piastrinico (< 10
x109/L) può segnalare l’evoluzione verso una forma di leucemia acuta, con manifestazioni di
ecchimosi o di vasti ematomi in occasione di traumi.
2.2.3 Classificazione
Il primo sistema di classificazione fu proposto nel 1982 dal gruppo Franco Americano Britannico
(FAB). Questa classificazione distingue cinque forme e si avvale esclusivamente dei criteri
morfologici come la citopenia, la displasia midollare, la presenza di cellule immature o blastiche
nel sangue periferico e midollare, come descritto nella Tabella 2.
Tabella 2 Classificazione MDS FAB [6] [7]
Sangue periferico midollo osseo
AR
ARSA
AREB
AREB-t
LMMC
Blasti
- Sangue Periferico %
- Midollo Osseo %
<1
<5
<1
<5
<5
5-20
>5
20-30
<5
5-20
Morfologia
- Diseritropoiesi
- Disgranulopoiesi
- Dismegacariopoiesi
±
±
-
+
±
±
+
+
+
+
+
+
±
±
±
Conta monocitaria
N
N
N
N
>1x10 /l
Reticolociti
D
D
D
D
D
Eritrociti
D
D
D
D
D
Leucociti
N/D
N/D
D
D
D/A
Trombociti
N/D
N/D
D
D
D
Morfologia Midollo
osseo
- Cellularità
- Diseritropoiesi
- Disgranulopoiesi
- Dismegacariopoiesi
N/A
+
±
±
A
+
±
±
A
+
+
+
A
+
+
+
A
+
+
+
Sideroblasti ad anello
<3%
>15%
±
±
±
Evoluzione in AML
15%
15%
30-60%
100%
40%
9
AR: Anemia Refrattaria; ARSA: AR con sideroblasti ad anello; AREB: AR con eccesso di blasti; AREB-t: AREB in trasformazione
leucemica; LMMC: Leucemia mielomonocitica cronica.
N: normale; A: Aumentato; D: Diminuito
12
Nel 2001 l’organizzazione mondiale della sanità (World Health Organisation, WHO) ha proposto
una nuova classificazione, che riprende in considerazione molti criteri e definizioni del sistema
FAB, definendo però con maggior precisione alcuni sottotipi. Questa classificazione distingue
sette forme principali, come descritto nella Tabella 3, in cui è compresa la sindrome associata
alla delezione del braccio lungo del cromosoma 5 (del(5q)), quale anomalia cromosomica isolata.
Tabella 3 Classificazione MDS WHO [7]
Sangue Periferico
Midollo osseo
Citopenia unilineare o bilineare
Assenza o rari blasti <1%
Displasia unilineare; ≥10% delle cellule della
linea interessata
Blasti <5%
Anemia
Assenza di blasti
Solo displasia eritroide
Blasti >5%
Sideroblasti ad anello ≥15%
CRDM
Citopenia
Assenza o rari blasti <1%
Assenza di corpi di Auer
9
Monociti <1x10 /L
Displasia >10% delle cellule in 2 o più linee
mieloidi
Assenza di corpi di Auer
Sideroblasti ad anello ±15%
AREB-1
Citopenia
Blasti <5%
Assenza di corpi di Auer
9
Monociti <1x10 /L
Displasia unilineare o multilineare
Blasti 5-9%
Assenza di corpi di Auer
AREB-2
Citopenia
Blasti 5-19%
Corpi di Auer ±
9
Monociti <1x10 /L
Displasia unilineare o multilineare
Blasti 10-19%
Corpi di Auer ±
MDS-NC
Citopenia
Assenza o rari blasti <1%
Assenza di corpi di Auer
Displasia non equivoca in <10% delle cellule in
una o più linee mieloidi
Blasti <5%
Anemia
Assenza o rari blasti <1%
Conteggio trombocitico normale o aumentato
Megacariotici con nucleo ipolobato normali o
aumentati
Blasti <5%
Isolata del(5q)
Assenza di corpi di Auer
CRDU, AR,
RN, RT
ARSA
MDS associata a
del(5q) isolata
CRDU: Citopenia Refrattaria con Displasia Unifilare; AR: Anemia Refrattaria; RN: Neutropenia Refrattaria; RT: Trombocitopenia
Refrattaria; ARSA: Anemia Refrattaria con sideroblasti ad anello; CRDM: Citopenia Refrattaria con Displasia Multifiliare; AREB:
Anemia Refrattaria con Eccesso di Blasti; MDS-NC: MDS non classificabili
2.2.4 Citogenetica nelle Sindromi Mielodisplastiche
Circa il 40 - 60% dei casi di MDS, sono caratterizzati da anomalie citogenetiche ricorrenti, a
dimostrazione della clonalità della malattia. Gli elementi delle tre serie maturative midollari
(eritrociti, neutrofili e trombociti) derivano tutte dalla stessa cellula progenitrice multipotente che
ha acquisito un’alterazione genetica ad impronta displastica.
La presenza di un cariotipo normale non esclude la possibilità di una diagnosi di MDS. Tuttavia,
se la malattia viene identificata clinicamente, un cariotipo normale conferisce una prognosi
favorevole.
Tra i casi che presentano anomalie citogenetiche, le anomalie più frequenti sono di tipo non
bilanciato, con la perdita di frammenti (del(5q), del(7q), del(20q), del(17p13)) o di interi
cromosomi (-5,-7) o ancora, per la presenza di cromosomi soprannumerari (+8).
13
La perdita del cromosoma Y (-Y) è stata osservata in diversi disordini maligni, ma è anche un
fenomeno associato con l’avanzare dell’età. La perdita del cromosoma Y non esclude una MDS.
Nel caso in cui la malattia viene identificata clinicamente, quest’anomalia è associata ad una
prognosi favorevole. [8] [7] [4]
2.2.4.1 Monosomia 5 o del(5q)
La delezione del braccio lungo (del(5q)) e la monosomia del cromosoma 5 (-5) sono stati
dimostrati in numerosi disordini ematopoietici, ma soprattutto in pazienti affetti da MDS e
leucemia mieloide acuta. L’anomalia cromosomica del(5q) è il risultato di delezioni interstiziali di
vario tipo a livello del braccio lungo del cromosoma 5. I punti di rottura più frequentemente
coinvolti vanno da 5q12-14 (breakpoint prossimale) a 5q31-33 (breakpoint distale), anche se vi
sono notevoli variazioni per quanto riguarda la lunghezza del segmento deleto. La delezione che
viene osservata più frequentemente (90%) coinvolge il segmento da q31 a q31-33. Non è ancora
noto il gene critico che viene perso con il materiale genetico contenuto nella delezione; esiste
tuttavia una mappatura piuttosto ampia del braccio lungo del cromosoma 5, che fornisce
informazioni su un gran numero di geni in esso contenuti. Si tratta di geni implicati nella crescita
cellulare, in modo particolare di geni che codificano per fattori di crescita delle cellule midollari e
per i loro recettori.
L’utilizzo della citogenetica molecolare suggerisce l’esistenza di più di una regione critica nel
segmento deleto e di conseguenza la possibilità della perdita di un gene oncosoppressore. Tra
questi, il gene EGR-1, un oncosoppressore che viene espresso nelle cellule mieloidi e gioca un
ruolo importante nella differenziazione dei blasti mieloidi.
La presenza della del(5q) come unica anomalia conferisce nel paziente una prognosi favorevole.
Una MDS associata alla singola del(5q) pare maggiormente espressa nelle donne;
morfologicamente è caratterizzata da megacariocitosi con nuclei non lobati o ipolobati, anemia
refrattaria macrocitica e da un conteggio dei trombociti normale o eventualmente aumentato.
2.2.4.2 Monosomia 7 o del(7q)
La monosomia del cromosoma 7 (-7) o la delezione del suo braccio lungo (del(7q)), determina
nel paziente affetto da MDS una prognosi sfavorevole. Queste anomalie ricorrono non solo nelle
MDS e AML, ma anche in altre neoplasie mieloidi. Non sono tuttora noti i geni persi nel
cromosoma 7. Si suppone che anche in questo caso vi siano delle regioni che contengano geni
oncosoppressori, la cui perdita contribuisce alla trasformazione neoplastica.
2.2.4.3 Trisomia 8
Quest’anomalia è molto frequente nei disordini mieloidi. La presenza di trisomia del cromosoma 8
conferisce nel paziente una prognosi intermedia.
14
2.2.4.4 del(17p13)/del p53
La delezione del gene p53 (del p53), localizzato sul braccio corto del cromosoma 17 alla banda 3
della regione 1 (17p13) è un’anomalia piuttosto rara nel quadro diagnostico di una MDS. La
proteina 53 (p53) è un oncosoppressore coinvolto nella patogenesi di numerose neoplasie
umane, incluse quelle ematologiche.
L’assenza del gene p53 determina nel paziente con una MDS, una prognosi sfavorevole, con un
aumentato rischio di evoluzione in AML. Il quadro morfologico nel sangue periferico è spesso
caratterizzato dalla presenza di cellule pseudo Pelger-Huët, neutrofili di grandezza scarsa e
vacuolati.
2.2.4.5 del(20q)
La delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (del(20q)) è una anomalia ricorrente nei
disordini mieloidi maligni. All’interno di questa regione sono contenuti tra i diversi geni
d’interesse, il PTPRT ed il MYBL2. Il gene PTPRT codifica per un enzima, il receptor-type
tyrosine-protein phosphatase T, appartenente alla famiglia delle proteine tirosina fosfatasi,
molecole che svolgono un ruolo determinante in alcuni processi cellulari come la crescita, la
differenziazione, il ciclo mitotico, e non da ultimo la trasformazione oncogenica in quanto
oncosoppressore. Il gene MYBL2 (Myb-related protein B) codifica per una proteina appartenente
alla famiglia delle MYB (MYeloBlastosis), fattori di trascrizione che giocano un ruolo essenziale
nella regolazione dell’ematopoiesi.
La clinica dei pazienti che presentano questa anomalia è caratterizzata da una malattia a basso
rischio, generalmente con un’anemia refrattaria, una bassa probabilità di evoluzione in leucemia
acuta, ed una buona sopravvivenza. Morfologicamente, la presenza della del(20q) è associata ad
una prominente displasia nelle linee eritropoietica e megacariopoietica. La presenza come unica
anomalia conferisce nel paziente una prognosi favorevole.
2.2.5 Prognosi
Nel 1997 è stato proposto un sistema prognostico a punteggio, l’International Prognostic Scoring
System for Myelodysplastic Syndromes (IPSS). [9]
Questo sistema, come descritto nella Tabella 4, formula un punteggio (Score) prendendo in
considerazione la citopenia, la percentuale di blasti midollari e le alterazioni citogenetiche.
Vengono infine classificati diversi gruppi di rischio, che differiscono significativamente per
probabilità di sopravvivenza e per evoluzione leucemica.
15
Tabella 4 Sistema prognostico IPSS
Score
Parametro
0
0.5
1.0
1.5
0-1
1-2
-
-
Favorevole
Intermedio
Sfavorevole
-
<5
5-10
-
11-20
Grado di citopenia*
Citogenetica**
Blasti midollari %
2.0
21-30
*Citopenia:
- Emoglobina <10 g/dL
9
- Trombociti <100x10 /L
9
- Conteggio assoluto dei neutrofili <1.8x10 /L
**Citogenetica:
- Favorevole: normale, -Y, del(5q), del(20q)
- Sfavorevole: complesso (≥3 anomalie), anomalie cromosoma 7
- Intermedio: altre anomalie
Gruppo rischio
IPSS score
Basso
0
Intermedio
0.5 - 2.0
Alto
2.5 - 3.5
Per mezzo dell’analisi di Kaplan-Meier vengono rappresentante la sopravvivenza (Figura 7A) ed
il rischio di evoluzione leucemica (Figura 7B) in base alle diverse anomalie cromosomiche. In
questo studio sono stati identificati diversi gruppi di pazienti, secondo le anomalie citogenetiche
che essi presentavano.
Secondo il metodo di Kaplan-Meier [10] ciascun gruppo di pazienti affetti da MDS è stato seguito
per un totale di circa 18 anni dalla diagnosi. Alla fine del periodo di osservazione ciascun
paziente appartenente al rispettivo gruppo, caratterizzato da:
- una condizione: “0” ad indicare che la condizione non è avvenuta (ad es. paziente
sopravvissuto o nessuna evoluzione leucemica avvenuta) o “1” ad indicare che la condizione
è avvenuta (paziente deceduto o un’evoluzione leucemica avvenuta)
- il tempo dell’osservazione
La probabilità (P) del verificarsi di una condizione (ad esempio, la sopravvivenza) a qualsiasi
momento dell’osservazione (tempo x), è calcolata secondo la formula seguente:
PTempo x = (numero di soggetti viventi all’inizio dello studio – numero di soggetti deceduti)/
numero di soggetti viventi all’inizio dello studio
Per un determinato lasso di tempo (“tempo di osservazione”) per ogni gruppo di individui che
presentano uguali e specifiche anomalie citogenetiche, viene così formulato il decorso della
malattia, in ragione della probabilità del verificarsi o meno dell’evento di interesse (della
condizione, ad esempio l’evento “morte” o l’evento “leucemia mieloide acuta”).
16
Figura 7 Greenberg et al., sopravvivenza (A) e rischio di evoluzione leucemica (B) in pazienti con MDS in base all'anomalia
citogenetica [9]
Nel 2012 è stato pubblicato uno studio rivisitato, rispetto al precedente sistema prognostico a
punteggio, il Revised International Prognostic Scoring System for Myelodysplastic Syndromes (RIPSS) (Tabella 5), nel quale vengono definiti in totale 7 gruppi a rischio anziché i 5 precedenti.
[11]
17
Tabella 5 Sistema prognostico R-IPSS
Score
Parametro
0
Emoglobina
0.5
≥10
(g/dL)
Trombociti
9
(x10 /L)
Conteggio
assoluto dei
neutrofili
≥100
50-100
≥0.8
<0.8
1.0
1.5
8 - <10
<8
2.0
3.0
4.0
Molto
sfavorevole
<50
9
(x10 /L)
Citogenetica*
Molto
favorevole
Favorevole
Intermedia
Sfavorevole
≤2
>2 - <5
5-10
>10
Blasti
midollari (%)
* Citogenetica:
- molto favorevole: -Y, del(11q)
- favorevole: normale, del(5q), del(12p), del(20q), doppia del(5q)
- intermedio: del(7q), +8, +19, i(17q)
- sfavorevole: -7, inv(3)/t(3q)/del(3q), doppia -7/del(7q), complesso con 3 anomalie
- molto sfavorevole: complesso con più di 3 anomalie
Gruppo rischio
Sopravvivenza media
IPSS-R score
(anni)
Rischio medio del
25% di evoluzione in
AML (anni)
Molto basso
≤1.5
8.8
>14.5
Basso
>1.5 - 3.0
5.3
10.8
Intermedio
>3 - 4.5
3.0
3.2
Alto
>4.5 - 6
1.6
1.4
Molto alto
>6
0.8
0.7
18
3 Obiettivo
L’obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di analizzare i risultati dell’analisi
citogenetica di campioni con diagnosi di sindrome mielodisplastica confermata, giunti dal 2009 al
2012, presso il laboratorio di Citogenetica dell’Ente Ospedaliero Cantonale, al fine di correlare le
anomalie identificate con la citogenetica convenzionale con quelle osservate con l’ibridazione
fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation, FISH), tecnica di citogenetica molecolare,
per una corretta e completa analisi citogenetica.
Attraverso questo studio di analisi si vuole determinare perciò in quale misura, l’analisi FISH offra
informazioni supplementari, oltre alla sola analisi del cariotipo, rispetto ad alcune aberrazioni
cromosomiche ricorrenti, tipiche nelle sindromi mielodisplastiche.
19
4 Materiali e metodi
In ambito oncoematologico, le tecniche che permettono di studiare i cromosomi sono l’analisi del
cariotipo e l’analisi FISH.
4.1 Campioni
Sono stati considerati in analisi i campioni giunti presso il laboratorio di Citogenetica (EOLAB)
dell’Ospedale San Giovanni di Bellinzona negli anni dal 2009 al 2012, con un sospetto
diagnostico di MDS (prima diagnosi).
Per confermare il sospetto diagnostico di MDS sono stati visionati, oltre all’esito dell’analisi
citogenetica, i risultati dell’analisi morfologica dell’aspirato midollare eseguita nel laboratorio di
ematologia morfologica dell’Ospedale San Giovanni di Bellinzona (LEM) ed i risultati delle analisi
eseguite sulla biopsia osteomidollare presso l’Istituto Cantonale di Patologia di Locarno (ICP).
I campioni utilizzati per l’analisi citogenetica, sono prelievi di sangue midollare anticoagulati con
litio eparina, che presentavano un sospetto diagnostico di MDS.
4.2 Tecniche di coltura e trattamento del campione
Le indagini citogenetiche richiedono la presenza di cellule in attività mitotica. 0.5 mL di sangue
midollare è messo in coltura in sospensione nel terreno di crescita Marromax (4 mL, pronto
all’uso) all’intero di una provetta a becco di clarino sterile che garantisca lo scambio gassoso. Il
terreno contiene elementi nutritivi, fattori di crescita e sistemi tampone. Le colture sono allestite in
camera sterile sotto una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità e poste in termostato a
37°C, con il 5% di contributo di CO2.
Per un’indicazione di MDS si effettuano due colture indipendenti a tempi diversi: una a 24 ore e
l’altra a 48 ore.
Al termine del periodo d’incubazione, alle colture vengono aggiunti 50 μL di Colcemid, una
soluzione di colchicina, e si incuba nuovamente la provetta nel termostato a 37° fornita di CO2
per un minimo di 4h e un massimo di 6h. La colchicina è in grado di inibire la formazione delle
fibre del fuso mitotico consentendo di bloccare le cellule in divisione allo stadio di metafase, in cui
i cromosomi presentano il grado di condensazione ottimale per lo studio.
Successivamente alle ore di incubazione con colchicina, viene eseguito il processamento del
campione. L’uso di una soluzione ipotonica (4 mL di 0.65% KCl) consente il rigonfiamento delle
cellule e la conseguente dispersione controllata dei cromosomi metafasici, che ne migliora la
visibilità. I successivi trattamenti con una soluzione di 5% acido acetico (4 mL) ed in seguito con
soluzione di fissativo (4 mL, di cui: 3 parti di metanolo e 1 parte di acido acetico glaciale)
permettono di bloccare i processi degenerativi e rimuovono detriti dal preparato ed alcune
proteine dai cromosomi.
La sospensione dei nuclei così ottenuta, viene strisciata su vetrini, che saranno infine destinati
all’analisi del cariotipo (quindi alla colorazione in bandeggio) o all’analisi FISH.
20
4.3 Bandeggio e acquisizione
I vetrini allestiti, vengono lasciati una notte nel termostato a 37°C, dopodiché si procede alla
colorazione.
I vetrini sono colorati con mostarda di Quinacrina (Quinacrine dihydrochloride), che fornisce il
bandeggio Q. Ogni vetrino viene inizialmente idratato in una serie di diluizioni di etanolo al 100%,
90%, 80%, 70% per 5 minuti ciascuno ed infine in acqua per 2 minuti. I vetrini vengono poi
immersi nella soluzione di mostarda di Quinacrina per 15-20 minuti e da ultimo, lavati nella
soluzione tampone McIlvaine.
I vetrini dapprima lasciati asciugare al buio, vengono montati con soluzione tampone McIlvaine e
copri oggetto per l’analisi al microscopio a fluorescenza.
Al microscopio a fluorescenza si acquisiscono da entrambe le colture (24h e 48h), almeno 20
metafasi di cellule per caso per mezzo del Software Cytovision®. Viene ricostruito il cariotipo
delle varie metafasi ed ogni cromosoma viene attentamente analizzato, al fine di ricercare
eventuali anomalie.
4.4 Ibridazione in situ fluorescente (FISH)
4.4.1 Sonde
Vysis LSI EGR-1(5q31)/D5S721, D5S23(5p15.2) [12]
La sonda locus specifica LSI EGR1/D5S23, D5S721 (Figure 8 e 9) viene utilizzata per detettare
la delezione del locus 5q31 contenente il gene EGR-1. La sonda LSI D5S23, D5S721 è
impiegata nel determinare se la delezione è a carico dell’intero cromosoma 5 o solo del
corrispettivo braccio lungo.
In una cellula normale ibridata si osservano due segnali arancioni e due verdi (Figura 10). In una
cellula contenente la delezione del braccio lungo vi è un solo segnale arancione e due segnali
verdi; in caso di monosomia invece, è presente un solo segnale arancione e uno verde.
Figura 8 Sonda Vysis LSI EGR-1(5q31)) [12]
21
Figura 9 Sonda Vysis LSI/D5S721,D5S23(5p15.2) [12]
Figura 10 Cellula normale ibridata con Sonda Vysis LSI EGR-1/D5S721,D5S23 [12]
Vysis LSI D7S522(7q31)/CEP7 [12]
La sonda D7S522/CEP7 (Figure 11 e 12) viene utilizzata per detettare la delezione del locus
D7S522 e la regione centromerica del cromosoma 7, localizzati rispettivamente ai locus 7q31 e
7p11.1-q11.1.
In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 13).
In una cellula contenente la delezione del braccio lungo vi è un solo segnale arancione e due
segnali verdi; in caso di monosomia invece, è presente un solo segnale arancione ed uno verde.
Figura 11 Sonda Vysis D7S522(7q31)/CEP7(5p11.1-q11.1) [12]
22
Figura 12 Sonda Vysis D7S522(7q31) [12]
Figura 13 Cellula normale ibridata con sonda Vysis D7S522/CEP7 [12]
Cytocell Cep 8 alpha satellite probe [13]
La sonda Cytocell Cep 8 è utilizzata per detettare la trisomia 8.
In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni (Figura 14), mentre in
una cellula con la trisomia vi sono tre segnali arancioni.
Figura 14 Sonda Cytocell Cep8 [13]
Cytocell p53(17p13) deletion [13]
La Cytocell sonda p53(17p13) (Figura 15) è utilizzata per detettare la delezione del gene p53.
In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 16).
In una cellula contenente la delezione vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi.
23
Figura 15 Sonda Cytocell P53 Deletion [13]
Figura 16 Sonda Cytocell p53 [13]
Cytocell del(20q) deletion [13]
La sonda Cytocell del(20q) si utilizza per ricercare la delezione del braccio lungo del cromosoma
20 (Figura 17). La sonda prossimale, marcata in rosso, copre una regione di 301 kb nel 20q12,
all’interno del PTPRT. Nel 20q13.12 un’altra sonda, marcata in verde, copre la regione del gene
MYBL2.
In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 18).
In una cellula contenente la delezione vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi.
Figura 17 Sonda Cytocell del(20q12-13-12) [13]
24
Figura 18 Sonda Cytocell del(20q) [13]
4.4.2 Procedimento
Ogni sonda (con eventuali tamponi di ibridazione) è conservata a -20°C e viene portata a
temperatura ambiente prima dell’uso. Data la presenza nelle sonde di fluorocromi fotosensibili
alla luce, vi è la necessità di mantenere le sonde al riparo dalla luce.
Per le sonde Vysis e per la sonda Cytocell Cep 8 in una Eppendorf vengono aggiunti 8 L del
rispettivo tampone di ibridazione (Vysis o Cytocell) con 2 L di sonda.
Le sonde Cytocell rimanenti sono invece pronte all'uso.
Successivamente alla fissazione dei nuclei su vetrino viene effettuato un pretrattamento che
permette di eliminare RNA e proteine:
- soluzione 2xSSC per 5 min a temperatura ambiente
- soluzione 1xPBS per 5 min a temperatura ambiente
- soluzione 1xPBS per 5 min a temperatura ambiente
I vetrini sono in seguito sottoposti a disidratazione in una serie di diluizioni di etanolo al 70%,
80%, 90% e 100% per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente
I vetrini vengono posti in termostato a 37°C ad asciugare.
La FISH viene eseguita per mezzo dello strumento ThermobrideTM S500 (Abbott Molecular).
Dispensare per ogni vetrino 10 L di sonda o della miscela della specifica sonda preparata
(descritto precedentemente per ogni sonda), coprire delicatamente con il coprioggetto e sigillare
con una soluzione collante gommosa e far asciugare completamente.
I vetrini vengono caricati nell’Hybride, il quale viene impostato per eseguire due processi:
- Melt T 75°C per 1 minuto: il DNA bersaglio e la sonda, opportunamente selezionata, sono
denaturati ad alta temperatura, in modo da separare i due filamenti della doppia elica del DNA
- Hyb T 37°C, over night: ibridazione delle sequenze complementari tra sonda e sequenza
bersaglio
Terminata l’ibridazione, la sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico, viene
rimossa per mezzo di lavaggi stringenti. Vengono rimossi il coprioggetto e le tracce di colla. I
vetrini vengono così lavati come segue:
25
-
0.4xSSC/0.3% NP40 per 2 minuti a 73° in agitazione
2xSSC/0.1% NP40 per 2 minuti a temperatura ambiente in agitazione
2xSSC/0.1% NP40 per 2 minuti a temperatura ambiente in agitazione
2xSSC per 2 minuti a temperatura ambiente in agitazione
disidratazione in una serie di diluizioni di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per 5 minuti
ciascuno a temperatura ambiente in agitazione
I vetrini vengono lasciati asciugare ed infine montati i vetrini con 10 L di colorante di contrasto
DAPI (Cytocell rispettivamente Vysis, a dipendenza della sonda utilizzata).
L’ibridazione della sonda viene infine analizzata con un microscopio a fluorescenza; l’analisi
viene eseguita, per ogni sonda, su 200 nuclei in interfase.
26
5 Risultati
In base ai risultati ottenuti dall’analisi citogenetica, e tenendo conto dei referti di analisi
morfologica su aspirato midollare ed i referti di analisi di biopsia osteomidollare, i casi
diagnosticati di MDS sono stati 41 (i risultati completi sono riportati negli Allegati).
All’analisi citogenetica, questi 41 casi presentavano:
-
anomalie dei cromosomi 5, 7, 8, 17 e 20
nessuna anomalia
la perdita del cromosoma Y negli uomini
altre anomalie
I casi che all’analisi del cariotipo e/o all’analisi FISH presentavano anomalie dei cromosomi 5, 7,
8, 17 e 20 in particolare sono stati 27. Nelle seguenti tabelle (Tabelle 6-10) vengono riportati i
risultati raggruppati a seconda del cromosoma analizzato.
Tabella 6 Casi con del(5q) / Monosomia 5
No. caso
Cariotipo
FISH
1
46,XY[4]
76% del(5q31)
2
46,XY[3]
28% del(5q15.2), -7
3
44~46,XY,-3[13],+8[13],-21[3], del(5)(q31qter)[4][cp22]
52% del(5q31)
4
47,XX,del(5)(q13.qter),+8[8]/46,XX[11]
81% del(5q31)
5
42~46,XX,-10[3],-11[3],-19[3],-21[3][cp33]
69% del(5q31), 55% del(17p13)
6
40~46,XX,-X[3],add(2)(q37)[17],del(3)(p14,pter)[6],
-5[4],del(7)(q31,qter)[5],-9[4]add(9)(p23)[4],-21[4],-22[3],+mar[8][cp23]
34% del(5p15.2), del(5q31), del(7q31)
7
45,XY,-21[4]/46,XY[16]
28% del(5q31), 18% del(7q31)
8
46,XY[18]
7% del(5q31)
9
46,XX,t(3;10)(p13;q24),del(5)(q15;q34)[8]/47,XX,sl,+8,del(20)(q13.1qter)[1]/
57,XX,sdl1,+1,+6,+8,+13,+15,+15,+16,+21,+22,+22[1]
26% 3 copie locus (5p15.2), 34% del(5q31), 5%
trisomia 8, 22% tetrasomia 8, 20% 3 copie locus
(20q12), del(20)(q13.1)
10
43,XY,del(5)(q21qter),del(7)(q21.3qter),add(12)(p13),-18,
-19[10]/43,XY,-5,del(7)(q21.3qter),-12,-14,-18,-19,+m1,+m2[6]/46,XY[2]
30% del(5q31), del(7q31)
11
46,XX,del(5)(q14q34)[9]/46,XX[8]
44% del(5q31)
12
46,XX,del(5)(q13q31-q33)[2]/46,XX[16]
10% del(5q31)
13
46,XX,del(5)(q12q31-33)[4]746,XX[20]
18% del(5q31)
15
46,XX,del(5)(q12q31-33)[2]/46,XX[10]
10% del(5q31)
16
42,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),add(17)(p12),-18,-20,
-21,+m1[16]/43,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),-13,add(17)(p12),-18,-20,21,+m1,+m2[7]/46,XY[3]
85% del(5q31), del 17p, 92% monosomia 20
Tabella 7 Casi con del(7q) / Monosomia 7
Cariotipo
No. caso
FISH
1
46,XY[3]
28% del(5q15.2), -7
2
46,XY,t(3;3)(q21q26)[5]/46,XY[16]
7% -7
3
40~46,XX,-X[3],add(2)(q37)[17],del(3)(p14,pter)[6],
-5[4],del(7)(q31,qter)[5],-9[4]add(9)(p23)[4],-21[4],-22[3],+mar[8][cp23]
34% del(5p15.2), del(5q31), del(7q31)
4
40~46,XY,-7[5],-19[3],+mar[7][cp20]
18% del(7q31), -7
5
45,XY,-21[4]/46,XY[16]
28% del(5q31), 18% del(7q31)
6
43,XY,del(5)(q21qter),del(7)(q21,qter),add(12)(p13),-18,-19[10]/43,XY,
-5,del(7)(q21.3qter),-12,-14,-18,-19,+m1,+m2[6]/46,XY[2]
30% del(5q31), del(7q31)
27
Tabella 8 Casi con Trisomia 8
Cariotipo
No. caso
FISH
1
47,XX,+8[3]/46,XX[19]
2
48,XX,+8,+9[14]/46,XX[6]
14% +8
10% +8
3
46,XX,t(3;10)(p13;q24),del(5)(q15;q34)[8]/47,XX,sl,+8,del(20)
(q13.1qter)[1]/57,XX,sdl1,+1,+6,+8,+13,+15,+15,+16,+21,+22,+22[1]
26% 3 copie locus (5p15.2), 34% del(5q31), 5%
+ 8, 22% tetrasomia 8, 20% del(20)(q13.1)
4
47,XY,+8[6]/46,XY[18]
45% + 8
5
46,XY,del(20)(q12)[21]/47,XY,+8[2]/46,XY[3]
12% +8, 73% del(20)(q11.2-q13.1)
6
47,XX,+8[13]/46,XX[8]
44% +8
Tabella 9 Casi con del(17p13)
Cariotipo
No. caso
FISH
1
42~46,XX,-10[3],-11[3],-19[3],-21[3][cp33]
69% del(5q31), 55% del(17p13)
2
42,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),add(17)(p12),-18,-20,
-21,+m1[16]/43,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),-13,add(17)(p12),-18,
-20,-21,+m1,+m2[7]/46,XY[3]
85% del(5), del(17p13), 92% -20
Tabella 10 Casi con del(20q)
Cariotipo
No. caso
FISH
1
46,XY,del(20)(q11.2q13.1)[14]/46,XY[10]
70% del(20)(q12/q11)
2
46,XY,del(20)(q11.2)[18]/46,XY[5]
80% del(20)(q12)
3
45,X,-Y[3]/46,XY[17]
5% del(20)(q12/q11)
4
46,XY,del(20)(q12)[17]/46,XY[3]
76% del(20)(q11.2-q13.1)
5
46,XX,t(3;10)(p13;q24),del(5)(q15;q34)[8]/47,XX,sl,+8,
del(20)(q13.1qter)[1]/57,XX,sdl1,+1,+6,+8,+13,+15,+15,+16,+21,
+22,+22[1]
26% 5(p15.2), 34% del(5q31), 5% +8, 22%
tetrasomia 8, 20% del(20)(q13.1)
6
46,XY,del(20)(q12)[21]/47,XY,+8[2]/46,XY[3]
12% +8, 73% del(20)(q11.2-q13.1)
7
46,XY,del(20)(q11q13)[18]/46,XY[4]
80% del(20q)
8
46,XY,del(20)(q11q13)[7]/46,XY[8]/92,XXYY[6]
28% del(20q)
9
42,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),add(17)(p12),-18,-20,
-21,+m1[16]/43,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),-13,add(17)(p12),-18,
-20,-21,+m1,+m2[7]/46,XY[3]
85% del(5), del(17p13), 92% -20
28
6 Discuss
sione
In du
ue casi il num
mero delle metafasi
m
ana
alizzate non era sufficien
nte a garanttire una corrretta analisi.
Menttre con l’ana
alisi FISH, in
n entrambi i casi sono state
s
osserva
ate anomaliee quali la de
elezione del
bracccio lungo de
el cromosom
ma 5 nel 7 6% delle ce
ellule analiz
zzate (Tabeella 6, caso 1) e sia la
a
delezzione del braccio
b
lung
go del crom
mosoma 5 (Tabella 6, caso 2) cche la monosomia dell
crom
mosoma 7 de
el 28% (Tabe
ella 7, caso 1).
Anom
malie coinvo
olgenti il cromosoma 5 ssono state osservate
o
in
n 9 casi su 15 analizzatti sia con la
a
citogenetica convenzionale (CC) che co
on l’analisi FISH.
F
Mentre
e in 6 casi l’’analisi FISH
H ha messo
o
in evidenza anom
malie non ev
videnziate co
on la CC (Figura 19). Di questi 6 caasi in partico
olare:
- in due, non si è ottenuto un numero ssufficiente di
d metafasi (T
Tabella 6, caasi 1 e 2)
- du
ue altri casi presentavano un cariottipo complesso (con più
ù di tre anom
enetiche); in
n
malie citoge
FIISH la del(5q
q) è risultata
a al 69% in u
un caso, e nell’altro
n
all’8
85% (Tabellaa 6, casi 5 e 16)
- in un caso, l’a
analisi del cariotipo
c
ha mostrato un
n’anomalia non
n caratterristica in un contesto dii
MDS (la monosomia del cromosoma
a 21) ed in FISH
F
era pre
esente la deel(5q) nel 28
8% (Tabella
a
6, caso 7)
- un
n caso prese
entava un cariotipo
c
nor male, e in FISH
F
si è evidenziata la presenza della
d
del(5q))
in quantità piu
uttosto bassa (7%) (Tab
bella 6, caso
o 8)
del(5q
q) / Mon
nosomia 5
6
Cariotipo - FISH
FIS
SH
9
Figura 19 Anallisi citogenetica
a monosomia 5 – del(5q)
malie coinvo
olgenti il crom
mosoma 7 ssono state ev
videnziate in
n 3 casi su 6 sia con la CC che con
n
Anom
la FIS
SH (Figura 20)
2 mentre in 3 casi, l’an
nalisi FISH ha messo in
n evidenza aanomalie non osservate
e
con l’analisi FISH
H; di questi ultimi:
u
- da
a un caso, come già detto
d
preced
dentemente
e, non si è ottenuto unn numero sufficiente dii
metafasi (Tab
bella 7, caso
o 1)
- in un caso il cariotipo
c
pre
esentava un’’altra anoma
alia (t(3;3)), mentre in F ISH è stata evidenziata
a
la monosomia
a del cromos
soma 7, ancche se in una percentua
ale piuttosto bassa (7%)) (Tabella 7,
ca
aso 2)
- un
n caso all’analisi del ca
ariotipo pressentava un’anomalia non caratteri stica in un contesto di
MDS (la monosomia del cromosoma
a 21) e alla FISH
F
la del((7q) era pressente nel 18
8% (Tabella
a
7, caso 5)
29
del(7q
q) / Mon
nosomia 7
3
3
Cario
otipo - FISH
FISH
H
Figura 20 Anallisi citogenetica
a monosomia 7 – del(7q)
In 6 ccasi su 6, la
a presenza di
d trisomia d el cromosom
ma 8 (Figura
a 21) è stataa evidenziatta sia con la
a
CC cche con la FISH.
Trisom
mia 8
Cariiotipo - FISH
FISH
H
6
Figura 2
21 Analisi citoge
enetica trisomia 8
La presenza di delezione del
d braccio corto del crromosoma 17 del(17p113) (Figura 22) è stata
a
e casi solo con
c l’analisi FISH (Tabe
ella 9, casi 1 e 2).
riscontrata in due
de
el(17p13
3)/p53
Cario
otipo - FISH
FISH
H
2
Figura 2
22 Analisi citoge
enetica del(17p13)
30
Infine
e, la presenza di dele
ezione del braccio lun
ngo del cro
omosoma 200 (Figura 23)
2 è stata
a
osservata in 8 casi
c
su 9, sia con la CC
C che con l’analisi FISH
H, mentre inn un solo ca
aso l’analisi
H si è rivelatta diagnostic
ca. Questo caso in parrticolare presentava l’annomalia in FISH
F
in una
a
FISH
perce
entuale rela
ativamente bassa
b
(5%),, al limite in
nferiore del cut-off diaggnostico di laboratorio,
ossia
a il valore so
oglia minimo
o di detezion
ne. (Tabella 10, caso 3).
del(20
0q)
1
Cariotipo - FISH
FIS
SH
8
Figura 23 Analisi cito
ogenetica del(20
0q)
31
7 Conclusione
Questo studio di correlazione su alcune anomalie citogenetiche prese in esame, evidenziate con
le due metodiche (analisi citogenetica convenzionale e analisi FISH) nelle sindromi
mielodisplastiche fornisce diversi spunti di riflessione.
L’analisi FISH si è rivelata uno strumento diagnostico fondamentale per l’identificazione di:
- 6 casi con delezione del braccio lungo del cromosoma 5
- 3 casi di delezione del braccio lungo del cromosoma 7 o una monosomia del cromosoma 7
- due casi di delezione del braccio corto del cromosoma 17
La correlazione tra citogenetica convenzionale e la FISH per quanto riguarda la trisomia del
cromosoma 8 è risultata totale in tutti i casi presi in esame.
Per la delezione del braccio lungo del cromosoma 20, la correlazione è risultata quasi completa.
Solo in un caso, l’anomalia è stata evidenziata solo per mezzo della FISH. Tuttavia in FISH la
delezione era presente in un piccolo clone (5%), motivo per cui risulta legittimo il fatto che
l’analisi del cariotipo non abbia segnalato tale aberrazione.
Tuttavia attraverso l’analisi FISH è possibile rilevare aberrazioni cromosomiche mirate, in base
alla scelta della sonda, che non risultano visibili con l’analisi del solo cariotipo. La qualità di
risoluzione dell’analisi del cariotipo oltre a dipendere dal grado di condensazione dei cromosomi
e dal momento della mitosi in cui essi si trovano, è limitata ad aberrazioni macroscopiche.
La FISH inoltre si è rivelata particolarmente utile nei casi in cui, all’analisi citogenetica
convenzionale il cariotipo risulti normale o se per diversi motivi, non si sia ottenuto un numero
sufficiente di metafasi a garantire il risultato dell’analisi. Per mezzo della FISH, oltre ad essere
esaminato un numero di nuclei (200) nettamente superiore rispetto all’analisi del cariotipo (20
metafasi), la possibilità di utilizzare la tecnica su nuclei in interfase ne amplia il campo di
applicazione, rendendo possibili analisi mirate anche in casi in cui non siano disponibili metafasi
d’idonea qualità e quantità.
Concludendo dallo studio fatto, si può osservare che nei casi in cui all’analisi citogenetica
convenzionale vengono evidenziate la presenza di trisomia del cromosoma 8 e la delezione del
braccio lungo del cromosoma 20, potrebbe non essere necessario, all’arrivo del campione,
pianificare l’analisi FISH con le sonde specifiche per i cromosomi 8 e 20.
32
8 Ringraziamenti
Ringrazio in modo particolare la Dr.ssa Monica Taborelli per avermi permesso di svolgere il mio
stage presso il Laboratorio di Citogenetica di EOLAB e per l’assegnazione di questo lavoro di
diploma. Un ringraziamento particolare alla Dr.ssa Taborelli e alla Dr.ssa Barbara Dossena per
avermi introdotta nel lavoro della citogenetica, per avermi seguita nello sviluppo di questo lavoro
e per la disponibilità dimostratami in questi mesi. Ringrazio in modo sentito anche la Dr.ssa
Gloria Gaudio per l’insegnamento, disponibilità e supporto e Michela Gisi (TAB), per
l’insegnamento delle basi pratiche durante tutto il mio percorso di stage.
Un ringraziamento inoltre a tutte le persone che in un modo o nell’altro, mi hanno supportato per
la realizzazione di questo lavoro e a tutti coloro che mi hanno accompagnato lungo il mio
percorso formativo.
33
9 Bibliografia
[1] J.H Tjio, A. Levan, «The chromosome number of man,» Hereditas, n. 42, pp. 1-6, 1956.
[2] V. Ventruto, G. Sacco, F. Leonardo, Citogenetica Umana, Milano: Springer, 2001.
[3] L.G. Shaffer, J. McGowan-Jordan, M. Schmid, ISCN 2013: An Internaional System for
Human Cytogenetic Nomenclature, Basel: Karger, 2013.
[4] L. J. Cambell, Cancer Cytogenetics, New York: Springer, 2011.
[5] Sudbery P., Genetica Molecolare Umana, Bologna: Zanichelli, 2000.
[6] G. Castoldi, V. Liso, Malattie del sangue e degli organi ematopoietici, Terza a cura di,
Milano: McGraw-Hill, 2001.
[7] World Health Organisazion Classification of Tumor, WHO Classification of Tumors of
Haematopoietic and Lymphoid Tissues, Lyon: IARC, 2008.
[8] S. Heim, F. Mitelman, Cancer Cytogenetics, Hoboken, New Jersey: Wiley-Blackwell, 2009.
[9] Greenberg et al., «International Scoring System for Evaluating Prognosis in Myelodysplastic
Syndromes,» Blood, n. 89, pp. 2079-2088, 1997.
[10] M. K. Goel, P. Khanna, J. Kishore, «Understandig survival analysis: Kaplan-Meier estimate,»
International Journal of Ayurveda Research, p. 274–278, Oct_Dec 2010.
[11] Greenberg et al., «Revised International Prognostic Scoring System for Myelodysplastic
Syndromes,» Blood, pp. 2454-2465, 2012.
[12] «Abbott molecular,» [Online]. Available: http://www.abbottmolecular.com. [Consultato il
giorno 15 marzo 2013].
[13] «Cytocell,» [Online]. Available: http://www.cytocell.com. [Consultato il giorno 15 marzo 2013].
34
Allegati
Risultati
Risultati dell’analisi dei 41 campioni di prime diagnosi di MDS eseguite dal 2009 al 2012 Tabella
11.
Tabella 11 Risultati analisi citogenetica MDS prime diagnosi (2009-2012)
Cariotipo
FISH
46,XY[21]
Neg
46,XX[20]
Neg
45,X,-Y[14]/46,XY[8]
Neg
45,XY,-Y[4]/46,XY[20]
Neg
46,XY[22]
Neg
46,XX[20]
Neg
46,XX[19]
Neg
46,XY[23]
Neg
45,X,-Y[12]/46,XY[10]
Neg
46,XY[22]
Neg
46,XY[22]
Neg
46,XY[22]
Neg
45,X,-Y[16]/46,XY[7]
Neg
46,XY[4]
76% del(5q31)
46,XY,del(20)(q11.2q13.1)[14]/46,XY[10]
70% del(20)(q12/q11)
44~46,XY,-3[13],+8[13],-21[3], del(5)(q31qter)[4][cp22]
52% del(5q31)
47,XX,del(5)(q13.qter),+8[8]/46,XX[11]
81% del(5q31)
46,XY,t(3;3)(q21q26)[5]/46,XY[16]
7% monosomia 7
42~46,XX,-10[3],-11[3],-19[3],-21[3][cp33]
69% del(5q31), 55% del(17p13)
40~46,XX,-X[3],add(2)(q37)[17],del(3)(p14,pter)[6],5[4],del(7)(q31,qter)[5],-9[4]add(9)(p23)[4],-21[4],-22[3],+mar[8][cp23]
34% del(5p15.2), del(5q31), del(7q31)
40~46,XY,-7[5],-19[3],+mar[7][cp20]
18% del(7q31), monosomia 7
46,XY,del(20)(q11.2)[18]/46,XY[5]
80% del(20)(q12)
45,XY,-21[4]/46,XY[16]
28% del(5q31); 18% del(7q31)
46,XY[3]
28% del(5q15.2), monosomia 7
47,XX,+8[3]/46,XX[19]
14% trisomia 8
48,XX,+8,+9[14]/46,XX[6]
10% trisomia 8
46,XY[18]
7% del(5q31)
45,X,-Y[3]/46,XY[17]
5% del(20)(q12/q11)
46,XY,del(20)(q12)[17]/46,XY[3]
76% del(20)(q11.2-q13.1)
46,XX,t(3;10)(p13;q24),del(5)(q15;q34)[8]/47,XX,sl,+8,del(20)(q13.1qt
er)[1]/57,XX,sdl1,+1,+6,+8,+13,+15,+15,+16,+21,+22,+22[1]
26% 3 copie locus (5p15.2); 34% del(5q31); 5%
trisomia 8;22% tetrasomia 8; 20% 3 copie locus
(20q12), del(20)(q13.1)
43,XY,del(5)(q21qter),del(7)(q21.3qter),add(12)(p13),-18,19[10]/43,XY,-5,del(7)(q21.3qter),-12,-14,-18,19,+m1,+m2[6]/46,XY[2]
30% del(5q31), del(7q31)
46,XX,del(5)(q14q34)[9]/46,XX[8]
44% del(5q31)
47,XY,+8[6]/46,XY[18]
45% trisomia 8
35
46,XY,del(20)(q12)[21]/47,XY,+8[2]/46,XY[3]
12% trisomia 8; 73% del(20)(q11.2-q13.1)
46,XX,del(5)(q13q31-q33)[2]/46,XX[16]
10% del(5q31)
46,XX,del(5)(q12q31-33)[4]746,XX[20]
18% del(5q31)
46,XY,del(20)(q11q13)[18]/46,XY[4]
80% del(20q)
47,XX,+8[13]/46,XX[8]
44% trisomia 8
46,XY,del(20)(q11q13)[7]/46,XY[8]/92,XXYY[6]
28% del(20q)
46,XX,del(5)(q12q31-33)[2]/46,XX[10]
10% del(5)
42,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),add(17)(p12),-18,-20,21,+m1[16]/43,XY,add(5)(q13),-10,add(12)(p13),-13,add(17)(p12),18,-20,-21,+m1,+m2[7]/46,XY[3]
85% del(5q), del(17p), 92% monosomia 20
Reagenti utilizzati
- Marrow MaxTM Bone Marrow Medium, GIBCO®, Invitrogen. Pronto all’uso. Conservare a 4°C
- KaryoMAX® Colcemid® Solution, Liquid 10g/ml in HBSS, GIBCO®, Invitrogen. Pronto
all’uso. Conservare a 4°C
- Soluzione ipotonica KCl 0.56%: 2.8g di KCl, 500 ml di acqua demineralizzata. Conservare a
4°C. Riscaldare a 37°C prima dell’uso
- Soluzione di Ibraimov (acido acetico al 5%): 2.5 ml di acido acetico, 47.5 ml di acqua
demineralizzata. Da preparare al momento
- Soluzione fissativa (3 metanolo + 1 acido acetico): 30 ml di metanolo, 10 ml di acido acetico.
Da preparare al momento
- Scala alcoolica 100%, 90%, 80%, 70%
- Acqua demineralizzata
Citogenetica convenzionale:
- Quinacrine Mustard Dihydrochloride 5mg, Sigma-Aldrich: da sciogliere in 100 ml di acqua
demineralizzata. Conservare a 4°C al buio
- Tampone McIlvane pH=7: 17.8 ml soluzione A (acido citrico anidro (C6H8O7) 21g/L),
82.2 ml soluzione B (fosfato di sodio bibasico diidrato (Na2HPO4 2H20) 35.6 g/L). Conservare
a 4°C
Citogenetica molecolare:
- SSC Buffer 20X Concentrate, Sigma-Aldrich, 1L. Pronto all’uso. Diluire secondo necessità.
Conservare a TA
- PBS pH 7.4 W/0, GIBCO®, Invitrogen, 500 ml. Pronto all’uso. Conservare a TA
- Scala alcolica 70%, 80%, 90%, 100%
- 0.4 x SSC/0.3% NP40: 10 ml SSC 20X, 490 ml di H20 di acqua demineralizzata, 1500 L di
NP40 (NP40, Vysis, 1000 L). Conservare a 4°C
- 2 x SSC/0.1% NP40: 50 ml SSC 20X, 450 ml di H20 di acqua demineralizzata, 500 L di
NP40. Conservare a 4°C
- DAPI, Cytocell, 500 L. Pronto all’uso. Conservare a -20°C al riparo dalla luce
- DAPI II, Vysis, 500 L. Pronto all’uso. Conservare a -20°C al riparo dalla luce
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