Mappatura dei
cromosomi eucariotici
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Mendel -> i caratteri di un individuo sono
specificati da geni e sono ereditari
Ma dove sono i “geni” nella cellula?
Morgan -> alcuni caratteri vengono
trasmessi di generazione in generazione
allo stesso modo di come vengono
trasmessi i cromosomi sessuali (ovvero
alcuni caratteri sono specificati da
particolari cromosomi che determinano il
sesso dell’individuo)
I geni sono sui cromosomi?
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Prova cruciale della
teoria cromosomica
Esperimento di Bridges
♀
atteso
♂
♀
XRXb occhi rossi ½
♂
XbY occhi bianchi ½
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ma da incroci su larga scala si puo’
generare una “progenie eccezionale”
xR y
xbxb
♀
♂
♀
♂
XRXb occhi rossi ½
atteso
XbY occhi bianchi ½
+
occhi bianchi XbXb?
occhi rossi, sterili
Progenie
eccezionale
primaria, 0.05%
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Progenie eccezionale secondaria
XbXb?
♀
♂
♀
♂
XRXb occhi rossi ½
XRY
atteso
XbY occhi bianchi ½
+
occhi bianchi XbXb?
occhi rossi, fertili
Progenie
eccezionale
secondaria, 4%
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Determinazione del sesso in Drosophila
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Determinazione cromosomica del
sesso in Drosophila e nell’uomo
Cromosomi sessuali
Specie
XX XY XXY XO
Drosophila
♀
♂
♀
♂
Homo Sapiens
♀
♂
♂
♀
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Determinazione del sesso in Drosophila
Rapporto X:A
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spiegazione
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Origine della
progenie eccezionale
primaria
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Origine della progenie eccezionale secondaria
XbXbY x XRY
Gameti XbXb /Y
Xb/XbY
X
Y
XbXb
XXbXb
XbXbY
Y
XY
YY
♂
♀
XR /Y
X
Y
Xb
XXb
XbY
XbY
XXbY
XbYY
♀
♂
4%
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Bridges confermo’ la sua ipotesi con
osservazioni citologiche dirette
¾Le ♀ eccezionali primarie
avevano cromosomi sessuali
di tipo XbXbY
¾I ♂ eccezionali primari
avevano cromosomi sessuali di
tipo XRO
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I geni sono sui
cromosomi e questo
spiega la
segregazione
meiotica di caratteri
indipendenti nella
formazione dei
gameti
AaBb
A e B su cromosomi
diversi-> segregazione
indipendente
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E se i geni si trovano
sullo stesso
cromosoma?
Geni associati
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Geni su cromosomi diversi
Geni associati
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Esperimento di Bateson & Punnett
-Studio di altri 2 caratteri del Lathyrus odoratus
1) colore del fiore (porpora/rosso)
PP
pp
2) forma del granulo pollinico (lungo/tondo)
LL
ll
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F2
P
Incrocio
PP/LL x pp/ll
F1
Pp/Ll
Porpora lungo
P-/LPorpora corto
P-/ll
Rosso lungo
pp/LRosso corto
pp/ll
autofecondazione
osservati
attesi
(Mendel)
4831
3911 (9)
390
1303 (3)
393
1303 (3)
1338
435 (1)
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Osservazioni
• I 2 caratteri non assortiscono in modo
indipendente ma sono accoppiati
(maggiore frequenza dei fenotipi
identici ai parentali)
• Deviazione dalla seconda legge di Mendel
• Accoppiamento dei caratteri (Coupling)
• La comprensione del fenomeno si
ottenne con gli esperimenti di Morgan
fatti su Drosophila
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Pp/Ll
Caratteri
indipendenti
Caratteri
accoppiati
parentale
PL
PL
Alta
probabilita’
ricombinante
Pl
Pl
Bassa
probabilita’
ricombinante
pL
pL
Bassa
probabilita’
parentale
pl
pl
Alta
probabilita’
Stessa
probabilita’
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Esperimento di Morgan. I
Studio di altri 2 caratteri 1) colore dell’occhio
2) grandezza dell’ala
P
x
Occhio rosso pr+pr+
Occhio porpora
pr pr
Ali normali
Ali vestigiali
vg vg
vg+ vg+
F1
Occhio rosso
Ali normali
pr+ pr / vg+ vg
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Testcross
F1
x
Occhio rosso
Occhio porpora
Ali normali
Ali vestigiali
pr+ pr / vg+ vg
pr pr / vg vg
Ci concentriamo solo sulla meiosi del doppio
eterozigote
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F2
osservati
attesi (Mendel)
Rosso Normale
pr+ pr/ vg+vg
1339
710 (1)
Rosso vestigiale
pr+ pr/ vg vg
151
710 (1)
Porpora Normale
pr pr/ vg+vg
154
710 (1)
Porpora vestigiale
pr pr/ vg vg
1195
710 (1)
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Osservazioni I.
Coupling tra
pr+ e vg+
e tra
pr vg
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Esperimento di Morgan. II
P
x
pr+ pr+ vg vg
occhio rosso
ala vestigiale
F1
pr pr vg+ vg+
occhio porpora
ala normale
occhio rosso
ala normale
pr+ pr vg+ vg
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Testcross
F1
pr+ pr vg+ vg
x
pr pr vg vg
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F2
osservati
attesi (Mendel)
Rosso Normale
pr+ pr/ vg+vg
157
558 (1)
Rosso vestigiale
pr+ pr/ vg vg
965
558 (1)
Porpora Normale
pr pr/ vg+vg
1067
558 (1)
Porpora vestigiale
pr pr/ vg vg
146
558 (1)
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Osservazioni II.
Repulsion tra
pr+ vg+
e tra
pr vg
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Spiegazione
I geni pr e vg sono fisicamente uniti sullo
stesso cromosoma, viaggiano insieme nella formazione dei gameti
I 2 caratteri vengono ereditati insieme nei gameti per questo motivo e’ maggiore
la frequenza dei fenotipi uguali ai parentali
1
2
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Come si spiega la comparsa dei non parentali?
Morgan sapeva che durante la meiosi i 2 cromatidi non
fratelli ma omologhi duplicati si appaiano a formare un
chiasma
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Ricombinanti
da assortimento indipendente
Fenotipi
Perentali
50%
Fenotipi
Ricombinanti
50%
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Ricombinanti
da crossing-over
Fenotipi
Perentali
>50%
Fenotipi
Ricombinanti
<50%
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Il crossing over non avviene sempre in tutte le meiosi
Il crossing over è un evento raro, solo una parte degli omologhi
ricombina; questo spiega perché prevalgono i cromosomi parentali.
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Ricombinanti nei cicli vitali aploidi
semplice da determinare
Non c’e’ eterozigosi che puo’
mascherare il carattere
recessivo
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Ricombinanti nei cicli vitali diploidi
Linee pure
omozigoti
testcross
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Importanza del testcross
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Osservazioni III.
La proporzione di progenie
ricombinante varia a seconda di
quali geni sono presi in esame
La frequenza di crossing over e
quindi di ricombinanti ottenuti
puo’ essere indicativa della
distanza tra 2 geni
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Il numero di crossing over che si puo’ verificare tra 2
geni e’ funzione della loro distanza
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Maggiore
è
la
distanza
tra
i
geni
associati, maggiore è la probabilità che si
verifichi
uno
scambio
nella
regione
compresa tra le due coppie e quindi
maggiore è la percentuale di meiosi nelle
quali si verifica uno scambio in questa
zona. Quindi, misurando la frequenza di
ricombinazione si può ottenere una
misura della distanza di mappa tra
coppie di geni.
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Mappa di associazione
F2
Sturtevant uso’ la percentuale
di ricombinanti come indice
quantitativo della distanza
lineare di 2 geni
21+23/400=0.11
11%
locus
locus
pr
vg
11.0
u.m. unita’ di mappa o cM
osservati
Rosso Normale
pr+ pr/ vg+vg
191
Rosso vestigiale
pr+ pr/ vg vg
21
Porpora
Normale
pr pr/ vg+vg
23
Porpora
vestigiale
pr pr/ vg vg
165
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La Mappatura genetica serve per
1.conoscere il genoma di una
specie e confrontarlo con quello
di specie vicine
2. Diagnosticare malattie
genetiche associate a determinati
geni (marcatori)
3. Migliorare varietà di interesse
zootecnico o agrario mediante
costruzione di ceppi particolari
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Frequenza di
ricombinazione (FR) di
0.01 (1%) corrisponde
per definizione a 1 u.m.
o 1 centiMorgan (cM)
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Incrocio a tre punti
P
F1
F2
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Distanza ed ordine dei loci sc/ec/cv
295/3248=0.09 x 100= 9% sc-ec
locus
locus
sc
342/3248=0.105 x 100= 10.5% ec-cv
ec
9.0
locus
locus
ec
cv
10.5
633/3248=0.195 x 100=19.5% sc-cv
locus
locus
sc
locus
ec
19.5
locus
cv
locus
sc
cv
19.5
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Altro caso
P sc/sc ec/ec vg/vg
X
sc+/sc+ ec+/ec+ vg+/vg+
sc/sc+ ec/ec+ vg/vg+ X
F1
Triplo eterozigote
F2
Parentali che
assortiscono in
modo
indipendente
con vg
sc ec vg
sc+ ec+ vg+
sc ec vg+
sc+ ec+ vg
sc ec+ vg
sc+ ec vg+
sc ec+ vg+
sc+ ec vg
sc/sc ec/ec vg/vg
Triplo recessivo
235
241
243
233
12
14
14
16
Non c’e’ rapporto
1:1:1:1:1:1:1:1
Geni associati
1008
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Distanza ed ordine dei loci sc/ec/vg
12+14+14+16/1008=0.055
x 100= 5.5% sc-ec
locus
locus
sc
ec
5.5
243+233+12+14/1008=0.498
x 100~ 50% ec-vg
locus
locus
ec
vg
50
243+233+14+16/1008=0.50
x 100=50% sc-vg
locus
locus
sc
vg
50
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Se la frequenza di ricombinazione e’ pari al 50% ci dobbiamo
chiedere se i geni sono associati o no-> situazione limite
In ogni caso, poiche’ la frequenza dei ricombinanti e’ 50%,
anche se sono sullo stesso cromosoma, li consideriamo NON
ASSOCIATI, poiche’ la loro distanza e’ talmente grande che
la probabilita’ che intervenga un crossing over a disgiungerli
e’ appunto pari al 100%. Allora il 50% dei gameti sara’ di tipo
parentale (non avra’ subito il crossing over) e il 50% di tipo
ricombinante (avra’ subito il crossing over)
A
B
a
b
A
a
b
B
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Altro caso II
P
v+/v+ cv/cv ct/ct
X
v/v cv+/cv+ ct+/ct+
v/v+ cv/cv+ ct/ct+ X v/v cv/cv ct/ct
F1
Triplo eterozigote
F2
V=vermillion
cv= crossveinless
ct= cute (ali con bordi
sfrangiati)
v cv+ ct+
v+ cv ct
v cv ct+
v+ cv+ ct
v cv ct
v+ cv+ ct+
v cv+ ct
v+ cv ct+
Triplo recessivo
580
592
45
40
89
94
3
5
Non c’e’ rapporto
1:1:1:1:1:1:1:1
Geni associati
1448
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Distanza ed ordine dei loci v/cv/ct
45+40+89+94/1448=0.185
x 100= 18.5% v-cv
locus
locus
v
cv
18.5
89+94+3+5/1448=0.132
x 100~ 13.2% v-ct
locus
locus
v
ct
13.2
45+40+3+5/1448=0.064
x 100=6.4% cv-ct
locus
locus
cv
ct
6.4
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locus
cv
0.064
locus
locus
ct
v
0.132
18.5
19.6
classi rare
v ct cv+
v+ ct+ cv
v ct+ cv+
v+ ct cv
Ricombinanti che derivano da
2 eventi di crossing-over
3
5
P
580
592
parentali
P
Doppio crossing-over
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Poiche’ si assume che la distanza di mappa e’
funzione lineare del numero di crossing-over,
ovvero dei ricombinanti, nel calcolare la distanza
v-cv dobbiamo considerare i ricombinanti rari 2
volte, perche’ prodotti da 2 processi di crossingover da cui:
45+40+89+94+3+3+5+5/1448=0.196 x 100= 19.6% v-cv
E’ stato possibile individuare il
doppio crossing-over poiche’ il gene
intermedio ct e’ in eterozigosi
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interferenza
Nella maggior parte degli organismi superiori la
formazione di un chiasma riduce la probabilità che un
altro chiasma si formi in una regione adiacente. Il
risultato netto di questa interferenza consiste nella
formazione di un minor numero di doppi crossing over
di quelli che si attendono rispetto alla distanza di mappa
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dimostrazione
Secondo la regola del prodotto, il prodotto delle frequenze dei
ricombinanti nelle regioni adiacenti dovrebbe essere uguale alla
frequenza dei doppi ricombinanti
Prodotto dei singoli crossing over
0.132 x 0.064=0.0084 x 1448= 12.23
ricombinanti
Ma in realta’ se ne formano solo 8!
Stima dell’interferenza I
c.o.c.= coefficiente di
coincidenza
= 1 –c.o.c =1 –
Frequenza doppi
ricombinanti osservata
Frequenza doppi
ricombinanti attesa
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interferenza
doppio
singolo
AB
singolo
AC
BC
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esempio
Il cromosoma 3 del mais contiene 3 loci che possono portare gli alleli b
e b+, v e v+, Ig e Ig+. Un incrocio di tripli recessivi con triplo
eterozigote F1 per i 3 geni dà origine alla progenie F2 indicata in
tabella. Dite qual e’ la sequenza dei geni sul cromosoma, calcolate la
distanza di mappa tra i geni ed il coefficiente di coincidenza.
+ v Ig
b++
b + Ig
+v+
+ + Ig
bv+
+++
b v Ig
Parentali
305
275
128
112
74
66
22
18
1000
+ v Ig
b++
triplo
eterozigote
Si calcola la distanza b-v in base al
numero dei ricombinanti:
74+66+22+18/1000=0.18 x 100= 18 u.m.
Si calcola la distanza b-Ig in base al
numero dei ricombinanti:
128+112+22+18/1000=0.28= 28 u.m.
F2
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Si calcola la distanza v-Ig in base ai ricombinanti:
128+112+74+66/1000=0.38= 38 u.m.
Da cui si ricava che:
v
b
Ig
+
b
v
+
+
Ig
18 u.m. + 28 u.m.=
46 u.m.
18 u.m
28 u.m
38 u.m.
Nel calcolo v-Ig abbiamo omesso i doppi ricombianti. Sapendo ora che la
sequenza dei geni e’ v-b-Ig possiamo individuare i doppi ricombinanti,
ovvero le classi piu’ rare:
I parentali diventano:
v-Ig=128+112+74+66+22+22+18+18/1000=
0.46= 46
u.m.
v + Ig
+b+
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Calcolo del coefficiente di coincidenza
c.o.c.=
Frequenza doppi
ricombinanti osservata
FDR(O)
=
FDR(A)
Frequenza doppi
ricombinanti attesa
40
22+18
c.o.c.=
(0.18 x 0.28) x 1000
=
=
0.79
50.4
Interferenza = I = 1-0.79=0.21= 21%
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Natura del crossing over
Nel crossing over avviene uno scambio fisico di pezzi di
cromosomi omologhi (Creighton, McClintock)
Studio di 2 loci
sul cromosoma
9 del mais
nodo
Colore del
seme
Composizione
dell’endosperma
Cromosoma 9 del mais
Due forme: una aberrante
e una normale
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CC /wx wx
cc /Wx Wx
x
Ricombinanti
o
Evidenza di scambi
cromosomali nei
ricombinanti
Cc /Wx wx
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Mappa del cromosoma X di
Drosophila
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Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e
distanza di mappa
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Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e
distanza di mappa
Quando 2 geni sono
molto distanti tra loro si
perde la linarita’ tra
frequenza di crossing
over e distanza di
mappa. Si stima che fino
a 20 cM c’e’ linearita’.
Quando le distanze tra
geni sono molto grandi
si tende a sottostimarle
se ci si basa sulla
frequenza di
ricombinazione
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Il crossing-over è molto meno
frequente nella regione
cromosomica intorno al
centromero e nelle altre regioni
eterocromatiche ( = povere di
geni ), rispetto alle regioni
eucromatiche
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Crossing over mitotico
Scoperto in Drosophila (Stern)
y colore giallo del corpo
sn setole corte e ricurve
incrocio
y+ sn/y+ sn
♀
y sn+/Y
x
y+ sn/y sn+
♂
♀ selvatiche
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Macchie gemelle in Drosophila
Troppo
(Stern)
frequenti per
essere un
evento
mutazionale
In femmine y+ sn / y sn+
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Crossing over mitotico
Separazione dei
cromatidi fratelli
Macchia gialla
Macchia singed
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Mappe di linkage dei
cromosomi umani
Problematiche:
-
Impossibile eseguire incroci controllati con
individui testcross (piu’ facile per l’X)
- Numero limitato di figli, insufficiente per
eseguire un calcolo affidabile delle distanze di
mappa
- I geni umani posso essere separati da distanze
molto grandi (necessita’ di individuare dei
marcatori)
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Mappe di associazione tramite analisi di alberi
genealogici
Gli individui
che
manifestano
la sindrome
nail-patella
(dominante)
NPS1
presentano il
gruppo B
4/13=0.30=30
%=30 u.m.
In realta’ la
distanza
NSP1-locus
dei gruppi
sanguigni e’
10 u.m.
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MAPPAGGIO FISICO
localizza i geni sui cromosomi dando una
posizione espressa con misure fisiche
reali, cioè il numero di paia di basi (bp).
1) a bassa risoluzione: permette di
posizionare un gene su un cromosoma o in
una regione del cromosoma;
2) ad alta risoluzione: localizza i geni con
una precisione fino al singolo nucleotide
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Mappaggio mediante ibridazione
in situ con fluorescenza (FISH)
Metodo diretto di visualizzazione della
posizione di un gene. Impiega sonde a
DNA o RNA marcate con fluorocromi che
ibridano su DNA denaturato di
cromosomi metafasici.
I cromosomi marcati vengono osservati al
microscopio a fluorescenza.
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Un gene clonato puo’ essere usato per trovarne la
posizione sui cromosomi mediante FISH
Tre diverse specie di conifere
Sonde: 5, 8S, 26S, 18S rosa; SGR-31 DNA satellite (verde)
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Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici
uomo-topo
I cromosomi umani
vengono persi
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Per eliminare gli ibridi topo/topo o uomo/uomo e per evitare
la perdita dei cromosomi umani si usa un terreno selettivo
Terreno HAT
H hypoxantina
A aminopterina blocca la sintesi de novo degli acidi nucleici
T timidina
Le cellule
murine mancano
dell’enzima TK
fornito dalle
cellule umane
mentre le cellule
umane mancano
dell’hgprt
fornito dalle
murine
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Selezione degli ibridi somatici col sistema
HAT
Mediante selezione in terreno HAT si possono ottenere ibridi
somatici contenenti il gene umano che conferisce resistenza
Vie di sintesi
dei nucleotidi
Si ottiene da
bloccata da
normale
precursori
semplici
aminopterina
Via di salvataggio
delle pirimidine
Timidina
chinasi (TK)
Mutante TK-
Timidina->acido
timidilico
Via di salvataggio
delle purine
HGPRT
ipoxantina
->guanina
Mutante
HGPRT-
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Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici
uomo-topo
Sendai virus
o PEG
Estrazione dei cromosomi
e loro analisi per
l’individuazione
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Una volta selezionate le cellule ibride vengono organizzate
in una banca di linee che contengono ciascun differente
cromosoma umano
La presenza di uno specifico prodotto genico e’
correlata con la presenza di uno specifico
cromosoma umano
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Gli ibridi uomo/topo sono utili per determinare
marcatori biochimici di cui può essere fatto uno
screening a livello cellulare con approccio
biochimico, come pure per proteine di superficie
(FACS)
Ibrido con antigene
umano di superficie
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