tecniche immunochimiche - Progetto e

TECNICHE
IMMUNOCHIMICHE
Tutte le tecniche immunochimiche si
basano sull’impiego di anticorpi
• Struttura tipica di
un’immunoglobulina
(Ig)
Le immunoglobuline si dividono in diverse classi,
ciascuna dotata di proprieta’ strutturali e
funzionali caratteristiche
La specificita’ e la sensibilita’ dei metodi
immunochimici sono fortemente influenzate
dalla tipologia delle Ig impiegate, ovvero:
• Anticorpi policlonali: derivati da piu’ di
un clone di linfociti B
• Anticorpi monoclonali* : derivati da un
singolo clone di cellule B
*(Impiegati in tecniche che richiedono un
elevato grado di specificita’)
Produzione di anticorpi monoclonali mediante
impiego di ibridomi
FENOMENO
DELL’IMMUNOPRECIPITAZIONE
• Una proprieta’ importante di
molti anticorpi (Ac) e’ la loro
capacita’ di precipitare gli
antigeni (Ag) in soluzione, a
seguito della formazione di un
reticolo molecolare insolubile;
tale fenomeno e’ strettamente
influenzato dalle concentrazioni
di Ac ed Ag, infatti si manifesta
all’interno di un ristretto
intervallo di concentrazioni, noto
come ZONA DI EQUIVALENZA
La formazione del reticolato puo’ essere
impedita dalla presenza di molecole (apteni),
che interferiscono con il legame della
molecola anticorpale all’Ag
TECNICHE DI IMMUNODIFFUSIONE
Tali metodiche si basano sulla diffusione
degli anticorpi e/o degli antigeni nel gel di
agarosio, fino alla formazione di una banda
di precipitazione a livello del punto di
equivalenza
IMMUNODIFFUSIONE SEMPLICE
• Prova allestita con un
singolo antigene ed il
corrispondente
antisiero
IMMUNODIFFUSIONE DOPPIA
• Prova allestita con
una miscela di
antigeni ed il
corrispondente
antisiero
SRDI:Single Radial ImmunoDiffusion
• L’Ag viene caricato nei
pozzetti incisi in un gel
contenente una
concentrazione fissa di
Ac; al punto di
equivalenza si forma un
anello di precipitazione
intorno al pozzetto, il
cui diametro e’ in
relazione alla
concentrazione di Ag
Quadri fondamentali di
immunoprecipitazione, ottenuti per
immunodiffusione doppia
•
a) reazione di
identita’: le bande si
fondono;
• b) reazione di non
identita’: le bande si
incrociano;
• c) reazione di identita’
parziale: le bande
collidono
IMMUNOELETTROFORESI
• Dapprima si separa una
miscela di proteine
contenente l’Ag
mediante elettroforesi
su gel di agar; si lascia
poi diffondere l’Ac nel
gel da un solco
parallelo alla direzione
di elettroforesi. Dove
gli Ac incontrano gli Ag
(all’equivalenza) si
formano archi di
precipitazione
ROCKET IMMUNOELETTROFORESI
• Tecnica di adattamento
dell’immunoelettroforesi
radiale semplice; prevede
la migrazione dell’Ag dai
pozzetti incisi nel gel
contenente gli Ac;
all’equivalenza si formano
bande di precipitazione a
forma di razzo (rocket),
la cui area e’ proporzionale alla concentrazione
degli Ag
IMMUNOELETTROFORESI
BIDIMENSIONALE
• Le proteine vengono
prima separate mediante
elettroforesi su gel di
agar, poi sottoposte ad
elettroforesi in un gel
contenente l’Ac in
direzione perpendicolare
a quella della prima
elettroforesi
MARCATURA DEGLI ANTICORPI
Sebbene le tecniche di
immunoprecipitazione in agar diano
un precipitato visibile del complesso
Ag-Ac, nella maggior parte dei
dosaggi immunochimici tale reazione
puo’ essere visualizzata solo
marcando l’Ac (a volte l’Ag) con
l’impiego di marcatori specifici
MARCATORI COMUNEMENTE USATI
• Isotopi radioattivi: impiegati in dosaggi
radioimmunologici (RIA);
• Enzimi: impiegati in tecniche di immunochimica
(ELISA);
• Fluorocromi: impiegati in tecniche di
immunochimica (FIA) e di citofluorimetria
• (convenzionale od a flusso).
PROCEDURE IMMUNOCHIMICHE
• DIRETTE: viene marcato l’Ac contro l’Ag
di interesse (Ac primario)
• INDIRETTE: viene marcato un Ac anti-Ig
che a sua volta si lega al complesso Ag-Ac
RIA (RadioImmunoAssay)
• Il radioisotopo maggiormente impiegato in tali
metodiche per la marcatura di Ac e/o Ag e’ lo
125I, un isotopo che emette radiazioni
di
facile rilevazione mediante scintillatori
CURVA DI TARATURA DI UN
DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO
MARCATURA CON ENZIMI
Tale metodica trova impiego in diverse
tecniche immunochimiche, quali ELISA
(EnzymeImmunoSorbentAssay),
Immunoblotting e Immunoistochimica; il
legame tra l’Ac marcato e l’Ag viene
visualizzato, eseguendo una reazione
enzimatica che converte un substrato
incolore in un prodotto colorato (solubile
o insolubile)
IMMUNODOSAGGIO COMPETITIVO
• L’Ag contenuto nei campioni
da testare compete con una
quantita’ fissa di Ag
marcato, in presenza di una
dose limitante di Ac;
all’equilibrio, l’Ag libero
viene separato da quello
complessato e la quantita’ di
Ag marcato presente nel
complesso risulta
inversamente proporzionale
alla concentrazione di Ag
nei campioni
IMMUNODOSAGGIO A DUE SITI:
ELISA CATCHING
• In tali dosaggi l’Ag si
lascia reagire con l’Ac
immobilizzato su
microsfere di agarosio o
piastre di
microtitolazione; l’Ag
legato viene poi rilevato
con l’eccesso di un altro
Ac specifico per lAg
marcato con l’enzima
IMMUNODOSAGGIO INDIRETTO:
ELISA CLASSICA
• In tale metodica il
campione da testare
reagisce con l’Ag
immobilizzato
precedentemente in un
tubo di plastica o nei
pozzetti di una piastra
da microtitolazioni;
l’Ac, se presente, si
lega all’Ag e viene
rivelato con Ac anti-Ig
marcati con enzimi
MARCATURA CON COMPOSTI
FLUORESCENTI (FIA)
I fluorocromi sono sostanze che emettono luce se
illuminati con UV; in soluzione la fluorescenza
degli Ac marcati con fluorocromi e’ quantificabile,
utilizzando un fluorimetro. Esistono molti
composti fluorescenti con diversi spettri di
eccitazione e di emissione; tra i piu’ diffusi
troviamo la fluoresceina (verde) e la
tetrametilrodammina (rossa)
METODI DI
IMMUNOFLUORESCENZA
• a: immunofluorescenza
diretta
• b: immunofluorescenza
indiretta
• c: metodo a sandwich
semplice
• d: metodo a sandwich
multiplo
CONFRONTO TRA DOSAGGIO
IMMUNOENZIMATICO, RADIOIMMNOLOGICO
ED IMMUNOLOGICO IN FLUORESCENZA
Immunoblotting
(impiega substrati enzimatici insolubili in acqua)
Western blot
Dot blot