radiofarmaci nella diagnostica e terapia tumorale

RADIOFARMACI NELLA DIAGNOSTICA E TERAPIA TUMORALE
UNITÀ DI RICERCA DI PADOVA
Composizione e Settore di Indagine
L’Unità di Padova, sezione radiofarmaci, è strutturata per portare un contributo alla ricerca in
vari aspetti inerenti la progettazione, la sintesi, la caratterizzazione chimico fisica e la
determinazione delle proprietà biologiche di radiofarmaci.
Il gruppo di ricerca opera nel Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e nel Dipartimento di
Farmacologia ed Anestesiologia dell’Università di Padova e collabora con diverse istituzioni sia
padovane che italiane ed europee. In particolare, all’interno del CIRCMSB porta avanti
collaborazioni con l’Unita di Ricerca di Ferrara e di Napoli.
Descrizione della ricerca
I radiofarmaci sono composti marcati con isotopi radioattivi impiegati in medicina nucleare a
scopo diagnostico (imaging) o terapeutico (radioterapia) in funzione delle proprietà nucleari del
radionuclide. Negli ultimi anni sono molto studiati e sperimentati i cosìdetti radiofarmaci targetspecifici. Essi derivano dalla marcatura di biomolecole che presentano alta affinità e selettività per
siti biologici implicati in forme patologiche e che svolgono la funzione di veicolare il radionuclide
(molecola direzionatrice).
Oggetto delle ricerche dell’Unità di Padova sono i radiofarmaci marcati con il tecnezio-99m
ed il renio-186/188, due metalli di transizione del blocco d (VII) che giocano un ruolo importante in
ambito, rispettivamente, diagnostico e terapeutico. A differenza di isotopi di atomi naturalmente
presenti nelle molecole biologiche (O, C, N), che possono essere incorporati nelle molecole
direzionatrici attraverso la formazione di un legame covalente, gli isotopi di natura metallica
devono essere stabilizzati da un sistema chelante.
Nell’ultimo decennio è stata sviluppata un’ampia gamma di tecniche per la marcatura di
biomolecole con radiometalli, ma la metodica più ampiamente studiata e impiegata consiste
nell’approccio con un chelante bifunzionale (Bifunctional Chelating Agent, BFCA). Il chelante
bifunzionale presenta da un lato un set coordinativo in grado di stabilizzare il metallo, dall’altro un
gruppo funzionale per l’ancoraggio covalente della biomolecola, che può essere diretto oppure
mediato da uno spaziatore (linker), a dare il derivato BFCA(-linker)-BM. La scelta accurata del
BFCA è uno degli aspetti fondamentali nella progettazione di radiofarmaci target-specifici.
Un BFCA ideale dovrebbe garantire la formazione di un complesso con alta resa e a
concentrazioni molto basse del coniugato BFCA-BM. Tale complesso non dovrebbe sottostare a
reazioni di ossidoriduzione, dovrebbe essere termodinamicamente stabile e cineticamente inerte e
presentare un basso numero di isomeri, in quanto tutte questi parametri possono influenzare
notevolmente le caratteristiche biologiche e farmacocinetiche del coniugato BFCA-BM. Infine,
l’attacco del BFCA alla biomolecola dovrebbe essere facilmente realizzabile.
La selezione del BFCA dipende dal tipo di radiometallo e dal suo stato di ossidazione. Il core
[M=O]3+ viene largamente impiegato per la marcatura di biomolecole con 99mTc e 186/188Re e negli
ultimi 15 anni sono stati sintetizzati e valutati molti chelanti bifunzionali, la maggior parte dei quali
possiede un set coordinativo di tipo NxS(4-x). Questi chelanti, sebbene abbiano trovato applicazione,
soffrono di alcune limitazioni quali l’elevata lipofilia, una bassa flessibilità strutturale, più forme
isomeriche spesso difficili da separare e limitata stabilità in vivo. Inoltre la loro marcatura richiede
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spesso condizioni drastiche. Lo sviluppo di BFCA più efficienti resta quindi uno degli interessi
principali nell’ambito della medicina nucleare.
Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha scoperto e studiato chelanti bifunzionali
tetradentati contenenti un gruppo fosfinico che hanno dimostrato di produrre complessi di Re-oxo e
99m
Tc-oxo di elevata stabilità. Tra di essi, il chelante di natura peptidica N-[N-(3difenilfosfinopropionil)glicil]-S-benzil-L-cisteina metilestere contenente un set PN2S ha dimostrato
alta affinità per il core [Me=O]3+ (Me = Re, Tc), ed il complesso esacoordinato ReOCl[PN2S(Bzl)]OMe è stato isolato e ampiamente caratterizzato. Studi di massa hanno indicato che in realtà il
complesso più stabile è l’analogo pentacoordinato ReO[PN2S]-OMe, nel quale lo zolfo è coordinato
non come tioetere ma come tiolo. Il gruppo benzile è stato quindi sostituito con il tritile, più
facilmente rimovibile, ottenendo l’analogo N-[N-(3-difenilfosfinopropionil)glicil]-S-tritil-L-cisteina
(PN2S(Trt)-OH). Gli studi di coordinazione con renio hanno però fatto supporre una competizione
tra il gruppo carbossilico libero e lo zolfo nella coordinazione al centro metallico, in quanto il
complesso con il COOH esterno alla sfera di coordinazione, constatato con studi di massa, non è
risultato isolabile.
Sulla base di queste premesse, negli ultimi anni è stato studiato e caratterizzato il legante
esterificato N-[N-(3-difenilfosfinopropionil)glicil]-S-tritil-L-cisteina metilestere (PN2S(Trt)-OMe),
sintetizzato al fine di dimostrare ed ovviare la competizione fra il gruppo tiolico e quello
carbossilico. La complessazione del legante PN2S(Trt)-OMe con 185/187renio non radioattivo, ha
portato alla determinazione della presenza di isomeri. Infatti, in seguito alla coordinazione, il
gruppo metilestere può assumere una configurazione syn o anti rispetto all’ossigeno del gruppo oxo.
Un altro problema riguardante lo sviluppo di radiofarmaci target-specifici riguarda la reazione
di marcatura. Il BFCA deve garantire una marcatura rapida ed efficiente, con alta resa in una
singola specie. Sebbene gli studi di complessazione con renio possano essere predittivi del
comportamento dello stesso chelante con il 99mTc ed il 186/188Re, è anche vero che la chimica di
coordinazione per lo stesso chelante può essere diversa a livello macroscopico o in condizioni di
marcatura: condizioni n.c.a. (non carrier added). Potrebbe essere, ad esempio, che la competizione
osservata per il chelante PN2S-OH tra il COOH e lo zolfo sia sfavorita a livello n.c.a., come pure
che la marcatura favorisca una sola forma isomerica del complesso finale, cosa spesso osservata per
complessi del [99mTcO]3+. La formazione di un solo isomero è molto importante, in quanto
l’isomeria può variamente influenzare la farmacocinetica di un radiofarmaco.
Sono in corso di studio le procedure e le condizioni di marcatura dei chelanti detritilati PN2SOH e PN2S-OMe con 99mTc. Gli studi sono condotti al fine di definire le condizioni migliori per una
marcatura efficiente, in grado di garantire la formazione di una sola forma isomerica con alta
purezza radiochimica, e infine per identificare e caratterizzare le specie marcate e la determinazione
dell’attività specifica (MBq/µmol) dei chelanti.
Come precedentemente detto, un BFCA deve stabilizzare il radiometallo cosicché il complesso
finale possegga alta stabilità alle reazioni redox e/o alla transchelazione con altri chelanti presenti
nei sistemi biologici. Inoltre, un altro aspetto cruciale nello sviluppo di un radiofarmaco targetspecifico riguarda la farmacocinetica del BFCA marcato che può seriamente influenzare quella
della molecola direzionatrice, soprattutto nel caso in cui questa abbia dimensioni ridotte (piccoli
peptidi).
Gli studi di biodistribuzione di un nuovo BFCA marcato sono fondamentali al fine di valutare
il livello di tale influenza e l’eventuale necessità di apportare delle modifiche chimiche al BFCA.
Verranno quindi sviluppati studi in vitro, effettuati in plasma umano per determinare la stabilità
metabolica delle specie marcate derivate dai chelanti PN2S, e gli studi in animale, per valutare sia la
stabilità vivo che la farmacocinetica delle stesse specie. La biodistribuzione verrà determinata in
topo tramite analisi scintigrafica e conteggio della radioattività negli organi ex-vivo. L’analisi
scintigrafica verrà condotta, come ormai si fa usualmente nei nostri laboratori, con una YAPcamera, γ-camera di recente sviluppo avente una risoluzione di 1.0-1.2 mm e un campo di vista
40x40 mm2, utile per studi di biodistribuzione in topo.
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Un altro aspetto rilevante nella progettazione di radiofarmaci target-specifici è la scelta della
biomolecola direzionatrice. Piccoli peptidi sono ampiamente considerati in quanto offrono alcuni
vantaggi, quali elevata affinità per uno specifico recettore, bassa immunogenicità, elevata clearance
plasmatica, resistenza a condizioni di marcatura abbastanza drastiche. Una premessa indispensabile
per il loro impiego in medicina nucleare è la sovraespressione dei loro recettori nei siti patologici.
Tra i vari target biologici, i recettori della colecistochinina (CCK) CCKA-R e CCKB-R sono molto
promettenti in quanto sovraespressi in diverse forme tumorali. Il tetrapeptide C-terminale CCK4 è il
frammento più piccolo della CCK in grado di legarsi ad entrambi i recettori, mentre l’ottapeptide Cterminale ammide CCK8 è quello che dimostra più alta affinità. Recentemente, studi di NMR ad
alta risoluzione e studi di molecular modeling hanno indicato che modifiche chimiche indotte sulla
porzione N-terminale della CCK8 per introduzione di un chelante bifunzionale e del suo complesso
non dovrebbero alterare l’interazione con il recettore CCKA-R. In collaborazione con l’Unità di
Napoli del CIRCMSB diretta dal prof. Carlo Pedone, si sta portando avanti uno studio che riguarda
la sintesi e la caratterizzazione del coniugato PN2S-CCK8 e gli studi di coordinazione con renio-oxo
volti a valutare la possibilità di impiegare il set PN2S nella marcatura di peptidi dopo la
coniugazione. NelSono stati inoltre eseguiti gli studi di molecular modeling riguardanti il
frammento CCK8 e il complesso ReO[PN2S]-CCK8 al fine di determinare le modalità di
interazione del coniugato con il recettore CCKA-R e la stabilità del complesso con renio. Infine, il
Sono stati infine effettuati tentativi per coniugare il complesso preformato ReO[PN2S]-OH al
frammento CCK4, al fine di valutare il possibile impiego del set PN2S nella marcatura prima della
coniugazione.
In un radiofarmaco target-specifico basato sull’approccio bifunzionale la biomolecola può
essere coniugata al BFCA attraverso uno spaziatore, che generalmente agisce come modulatore
della farmacocinetica del composto finale. Tentativi effettuati per superare problemi legati alla
biodistribuzione dei radiofarmaci in vivo includono l’uso di linker polimerici, dato che spesso la
farmacocinetica del coniugato BFCA-linker-BM coincide con quella del polimero. Tra i polimeri
disponibili, il poli(etilenglicole) (PEG) è ampiamente considerato in quanto in grado di trasferire le
sue caratteristiche chimico-fisiche, quali solubilità, non immunogenicità e biodistribuzione, alle
biomolecole a cui è legato, senza però alterare le loro funzioni biologiche, quali il riconoscimento
recettoriale. Essendo disponibili i dati relativi alla biodistribuzione di PEG a diverso peso
molecolare, è possibile scegliere il PEG-linker più idoneo per modulare il tempo di residenza in
circolo del radiofarmaco. In base a queste considerazioni, sarà oggetto dei nostri futuri studi la
modifica del set PN2S per coniugazione a metossi-PEG-ammina monofunzionali (MW = 5000 e
20000), gli studi di coordinazione dei derivati PN2S-PEG con renio e la loro marcatura con
99m
tecnezio. Inoltre, verrà sviluppato e ottimizzato un nuovo metodo di marcatura con 99mTc basato
sulle proprietà anfifiliche dei coniugati PN2S-PEG, già osservato in studi preliminari, che si è
rivelato molto interessante interessante in quanto consente di evitare l’uso di un agente riducente
esterno. Saranno infine eseguiti gli studi in vitro e in vivo per valutare le variazioni di stabilità e di
biodistribuzione indotte dal PEG sul set PN2S marcato impiegando il nuovo metodo.
Un'altra biomolecola con proprietà di biodistribuzione interessanti per la loro
biospecificità verso le cellule tumorali è l’acido Ialuronico (HA).
HA è un polisaccaride ubiquitario nei tessuti umani ad alta affinità per i recettori di membrana
specifici, i CD44, che sono sovraespressi in molti tumori solidi. Per interazioni con tali recettori HA
viene internalizzato nella cellula e quindi metabolizzato. Per aumentare la specificità sulle cellule
neoplastiche, è stato progettato un bioconiugato (HA-But) costituito dall’acido ialuronico (HA)
esterificato con residui di acido butirrico (HBut). Il sodio butirrato, infatti, è un inibitore
dell’enzima istonedeacetilasi, presenta una rilevante attività farmacologica in un’ampia varietà di
linee cellulari di tumori umani. Sfortunatamente però, l’applicazione clinica del solo butirrato è
limitata dalla sua breve emivita plasmatica. HA-But è dunque un profarmaco costituito da un agente
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di targeting recettore specifico (HA) e un farmaco antitumorale (HBut) che viene liberato nel
citoplasma.
HA-But è stato marcato con 99mTc attraverso la procedura della marcatura diretta, ovvero
quella che non comporta l’utilizzo del BFCA. I risultati sono stati soddisfacenti e quindi,
la’approccio del legante bifunzionale sarà oggetto di studi futuri. Al momento è stata messa a punto
una metodologia di purificazione del 99mTc-HA-But che consente una resa del 99% in prodotto
marcato.
Il 99mTc-HA-But è stato somministrato per varie vie, quella orale, la sottocutanea,
l’intraperitoneale e quella rettale per verificare le capacità di assimilazione. Il passaggio in circolo
sanguigno è sempre stata molto lenta.
Il 99mTc-HA-But è stato infine somministrato in vivo per via endovenosa, per poterne seguire
la biodistribuzione all’interno dell’organismo, e verificarne la capacità di accumulo nei vari organi.
L’organo di accumulo praticamente istantaneo è stato il fegato.
Fig.1 Immagine topo iniettato nella
arteria caudale con 99mTc-HA-But non
pretrattato HA.
(Immagine raccolta nell’intervallo 30-35min
dall’iniezione)
E’ nostra intenzione proseguire gli studi per evidenziare le capacità di utilizzo del 99mTc-HABut quale diagnostico di tumori e metastasi epatiche.
Inoltre, vista la possibilità di approvvigionamento ed impiego del generatore 188W/188Re, è
nostra intenzione trasferire gli esperimenti di marcatura dell’HA e suoi derivati al 188Re ed eseguire
gli studi di biodistribuzione al fine di utilizzare i 188Re-HA derivati a scopo radioterapeutico.
Progetto Tantalio
E’ nostra intenzione proseguire nella ricerca chimica di complessi stabili di Tantalio allo scopo
di produrre radiofarmaci marcati con 178Ta, un nuovo radionuclide adatto alla rilevazione con le
camere MWGC (Multiwire Gamma Camera).
In questi ultimi anni, infatti, è in corso di progettazione e sviluppo questa nuova generazione di
gamma-camere. Tra i vantaggi che le MWGC presentano nei confronti delle tecniche tomografiche
attualmente in utilizzo, vi sono:
- velocità di conteggio più elevata;
- superiore risoluzione;
- minor peso e dimensioni ridotte che ne consentono una maggior facilità di trasporto.
Una sola limitazione ha precluso lo sviluppo e la diffusione di tali rivelatori dalle potenzialità
così elevate. I detector gassosi mostrano un’efficienza ridotta a 140KeV. Tale valore corrisponde
all’energia dell’emissione g del Tc-99m (149 KeV) che resta a tutt’oggi il più diffuso tra i nuclidi
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utilizzati in radiodiagnostica. L’efficienza tipica per una MWGC è del 25% a 140 KeV del 70% a
80 KeV e dell’ 80% a 60 KeV.
Si è quindi di fronte alla necessità di utilizzare isotopi radioattivi caratterizzati da emissioni
energia. a più bassa.
Il Ta-178 è un candidato con eccellenti proprietà. Tale radionuclide è caratterizzato da
emissioni X con energia comprese tra i 55 ed i 65 KeV, quindi ottimali per la rivelazione con
MWGC. Altri importanti vantaggi sono invece correlati alla suo breve tempo di emivita di soli 9.3
minuti. Altri radionuclidi utilizzati in Medicina Nucleare quali 99mTc o 201Tl hanno tempi di emivita
superiori alle 6 ore i quali impongono differenti limitazioni dal punto di vista clinico sia per l’alta
dose di radiazioni somministrata, sia per l’assenza di un decadimento fisico durante il tempo di una
rapida analisi clinica. La massima dose iniettabile risulta essere di 30mCi per il 99mTc e di 3mCi per
201
Tl, mentre il tempo di emivita relativamente lungo non rende possibili analisi multiple
Il Ta-178 viene prodotto dal generatore 178W/178 Ta per decadimento del 178W (t1/2=21.7
giorni). Il W-178 viene prodotto tramite reazione 181Ta(p,4n)178W per bombardamento con un fascio
di protoni a 24MeV di fogli di Ta-181 isotopo freddo del Tantalio. Il generatore è costituito da una
colonna a scambio ionico in cui viene legato il W-178 sottoforma di tungstenato. Si procede quindi
all’eluizione del Ta-178 tramite una soluzione acquosa contenente HCl 0.1N e l’1% di H2O2.
Fino ad oggi non è stato condotto alcun tentativo per determinare la forma chimica in cui il Ta178 viene eluito dal generatore. E’ possibile che in soluzione di acido cloridrico il metallo si
presenti sottoforma di ossidi ed idrossidi polinucleari i quali verrebbero eluiti con difficoltà dalla
resina a scambio ionico. Nelle condizioni in cui opera il generatore tuttavia, il Tantalio viene a
trovarsi in soluzione in concentrazione estremamente bassa. E’ possibile che le specie in soluzione
possano essere Ta(OH)4+ e/o Ta(OH)5 che mostrano scarsa affinità per la resina a scambio ionico.
Come proposto da Babko et al. queste sono le principali specie in cui si presenta il Tantalio in una
soluzione a pH inferiore a 2 in assenza di complessi polinucleari.
La chimica del Tantalio comprende differenti stati di ossidazione, sono noti composti in tutti
gli stati di ossidazione tra il +V ed il -III con la sola eccezione del –II. Sono tuttavia molto più
comuni stati di ossidazione elevati , in particolare il +V.
Il Tantalio presenta un’elevatissima affinità per l’ossigeno, la chimica in soluzione acquosa è
dominata dalla formazione di ossidi ed idrossidi del metallo sottoforma di polianioni[4]. La grande
affinità del Tantalio nei confronti dell’ossigeno viene evidenziata in reazioni di estrazione di
ossigeno da molecole quali acidi carbossilici, alcoli, chetoni, dimetilsolfossido ed altri composti
contenenti ossigeno.
Sono noti in letteratura numerosi complessi con leganti donatori all’ossigeno, fra questi gli
alcossidi di Tantalio rivestono una grande importanza. Questi vengono sintetizzati a partire dal
pentacloruro del metallo per reazione diretta con alcoli. La reazione porta alla formazione di
complessi di formula generale TaClx(OR)5-x (x=1-3), la sostituzione completa degli atomi di cloro
da parte dei gruppi alcossidici può essere ottenuta, per gli alcoli a più basso peso molecolare,
tramite l’utilizzo di un accettore di protoni quale l’ammoniaca
La letteratura, in particolare quella più recente, riguardante la chimica di coordinazione del
tantalio riporta studi di complessi utilizzabili come precursori per tecniche di deposizione di strati
sottili in particolare di ossido di tantalio. Non sono noti fino ad ora studi mirati alla sintesi di
complessi che possiedano una chimica in soluzione acquosa.
UNITÀ DI RICERCA DI FERRARA
Composizione e Settore di Indagine
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L’unità di Ferrara è composta essenzialmente da chimici inorganici esperti di sintesi e da
cristallografi. La ricerca si sviluppa sia nel settore di nuovi radiofarmaci inorganici in oncologia, sia
nel campo delle metodologie diagnostiche innovative.
Il nostro gruppo opera in collaborazione con il Dipartimento di Farmacia di Ferrara per lo
sviluppo di opportune biomolecole e di test di binding dei corrispondenti complessi sintetizzati.
Recentemente si è avviata una collaborazione con il Laboratorio di Medicina Nucleare,
Dipartimento di Medicina Clinica & Sperimentale dell’Università di Ferrara per quanto riguarda la
sintesi e caratterizzazione di complessi contenenti radionuclidi.
Collaborazioni: Unità di Ricerca di Padova
Obiettivi e metodi
Il programma di ricerca si articola secondo i seguenti punti:
• sintesi di leganti ottenuti dalla condensazione di semplici amminoacidi con opportuni agenti
chelanti;
• sintesi e caratterizzazione dei corrispondenti complessi di renio e tecnezio a livello
macromolecolare;
• trasferimento della sintesi a complessi di tecnezio-99m a livello nanomolare e confronti con
quelli ottenuti al punto precedente;
• dopo avere verificato la validità della procedura, si intende estendere la sintesi a leganti
ottenuti da peptidi biologicamente attivi funzionalizzati con l’agente chelante;
• sintesi e caratterizzazione dei corrispondenti complessi su scala macromolare (renio freddo e
tecnezio-99);
• la marcatura di questi leganti con Tc-99m e gli opportuni confronti con quelli ottenuti con
Tc-99.
L’utilizzo esteso nella medicina nucleare dell’isomero metastabile 99mTc, (nuclear imaging), ed
il recente sviluppo di radionuclidi β-emettitori quali 186,188Re come candidati futuri per applicazioni
radioterapeutiche di malattie degenerative, hanno aumentato l’interesse verso lo studio della loro
chimica di coordinazione. Il fine di queste ricerche è descrivere la struttura molecolare degli agenti
basati sul 99mTc e 186/188Re che essendo ottenuti su scala micro o nanomolare non può essere
determinata direttamente. Ciò può essere facilmente compiuto attraverso il confronto delle loro
proprietà chimiche e fisiche con quelle dei composti preparatati su scala macromolare dall’isotopo a
lunga vita 99Tc e dal renio freddo.
Negli ultimi anni, la chimica dei radiofarmaci di 99mTc è stata allargata grazie all’introduzione
di un efficiente metodo di produzione di specie di 99mTc contenenti il core [99mTc(N)]+2.
La stabilità dei nitruro-composti, osservata in un ampio intervallo di pH, fa di questi complessi
candidati interessanti nelle applicazioni di medicina nucleare.
Attualmente, la procedura di maggior successo è quella conosciuta come “approccio
bifunzionale”, consiste nel legare ad una biomolecola un raggruppamento in grado di coordinare il
metallo. Condizione essenziale è che il gruppo chelante si leghi alla biomolecola in un punto
irrilevante così da preservarne le sue proprietà biologiche. Questo metodo è stato applicato con
successo nella produzione di nuovi radiofarmaci di 99mTc coordinato a molecole aventi diverse
funzioni biologiche.
Sarà la scelta dell’agente chelante a determinare lo stato di ossidazione del metallo, la
geometria di coordinazione, la carica del complesso finale e quindi il suo maggiore o minore
carattere lipofilico e conseguentemente la sua biodistribuzione.
Sulla base di queste considerazioni il programma di ricerca prevede la sintesi, di peptidi
funzionalizzati con frammenti di natura diversa. in grado di coordinare il metallo in diversi stati di
ossidazione e contenenti “cori” diversi come ad esempio [M=O]3+, [M≡N]2+ (M=Tc, Re), o
complessi carbonilici con il metallo nello stato di ossidazione +1.
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I leganti saranno sintetizzati in collaborazione con il Prof. G. Vertuani del Dipartimento di
Scienze Farmaceutiche dell’Università di Ferrara, mentre tutte le reazioni a livello di Tc-99m ed
eventuali biodistribuzioni saranno eseguite in collaborazione con il Prof: A. Duatti del Laboratorio
di Medicina Nucleare, Dipartimento di Medicina Clinica & Sperimentale dell’Università di Ferrara
e con il Prof. U. Mazzi del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Padova.
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