cosa sono le biotecnologie?

Biotecnologie ed OGM
Prima parte: DNA ricombinante e
microorganismi geneticamente
modificati.
COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE?
• Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che
permettono lo sfruttamento di sistemi viventi
al fine di produrre beni e servizi.
COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE?
• Si dicono Biotecnologie l’utilizzazione
integrata di biochimica, biologia cellulare e
ingegneria genetica per realizzare applicazioni
tecnologiche a partire dalle proprietà di
microorganismi, di colture cellulari ed altri
agenti biologici (Federazione Europea
Biotecnologie).
COSA SONO GLI OGM
• “organismo il cui materiale genetico è stato modificato in
modo diverso da quanto avviene in natura con
l'accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale"
(Art. 2, Direttiva 2001/18/CE del 12/03/01)
• Quando si parla di Ogm oggi si intende di microorganismi,
animali e piante che hanno un patrimonio genetico modificato
in laboratorio, inserendo geni provenienti da organismi
diversi, tramite le moderne tecniche del DNA ricombinante.
COSA SONO GLI OGM
• Gli OGM vengono quindi oggi ottenuti attraverso l’uso di
tecniche di ingegneria genetica che permettono di inserire,
all’interno del genoma di un organismo, frammenti di DNA
provenienti anche da altri esseri viventi. Il DNA così ottenuto è
definito DNA ricombinante.
• L’organismo Ogm che risulta da questa manipolazione non è
necessariamente totalmente diverso, anzi generalmente è
apparentemente identico, ma possiede una qualche
caratteristica di utilità.
ingegneria genetica
La tecnologia del DNA ricombinante
• Nasce negli Stati Uniti nei primi anni ’70, grazie
agli studi sui microorganismi, in particolare
Escherichia coli.
• La maggior parte dei metodi utilizzati per
studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri,
grazie alla scoperta dei Plasmidi e degli Enzimi
di Restrizione, strumenti chiave della
clonazione genica.
Escherichia coli
Escherichia coli
plasmidi
plasmide
enzimi di restrizione
Sono enzimi presenti nei procarioti che
difendono il batterio dal DNA estraneo,
tagliandolo in punti specifici (sequenze
palindrome).
plasmide
Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano:
– enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che
riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le
tagliano in punti precisi;
– l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei
filamenti di DNA (tagliati con lo stesso enzima di
restrizione) permettendo la formazione di un unico
filamento continuo.
Produzione di DNA
ricombinante tramite l’uso di
enzimi di restrizione e
dell’enzima DNA-ligasi:
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza
1
GAATTC
CTTAAG
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un frammento di DNA
di provenienza estranea
3
Due frammenti si attaccano tra
loro appaiando le basi azotate
4
G A AT T C
C T TA A G
G A AT T C
C T TA A G
L’enzima DNA-ligasi
incolla i frammenti
5
DNA ricombinante
• Ottenuto un plasmidio ricombinante si possono
ottenere copie tramite clonazione:
– I plasmidi entrano nei batteri per trasformazione.
– I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in
condizione di riprodursi, dando origine a un clone di
cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni che
trasportano.
1 Si isola il DNA da due fonti diverse
2 Si tagliano
entrambi i DNA
con un enzima di
restrizione
E.coli
Clonazione genica di
un gene in un
plasmide batterico:
Cellula umana
Plasmide
DNA
Gene V
Estremità coesive
3 Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono
mediante
appaiamento di basi azotate
4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
Plasmide con
DNA ricombinante
Gene V
5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
Batterio
ricombinante
6 Si clona il batterio
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
Clonazione genica:
– I ricercatori possono inserire in un plasmide un
pezzo di DNA contenente un gene dando origine a
DNA ricombinante.
– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula
batterica.
– Il batterio geneticamente modificato è messo in
coltura e si riproduce per formare un clone di cellule
(un gruppo di cellule identiche alla cellula madre da
cui derivano).
– Ogni cellula possiede una copia del gene.
• I geni clonati possono essere conservati in
«librerie» genomiche
• L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,
derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una
cellula, è chiamata libreria genomica.
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
Plasmide
ricombinante
DNA fagico
ricombinante
oppure
Clone
batterico
Libreria plasmidica
Clone
fagico
Libreria fagica
• Si può produrre DNA da clonare anche mediante
l’enzima trascrittasi inversa
L’enzima trascrittasi
inversa può essere usato
per ottenere librerie di DNA
complementare (cDNA)
contenenti solo i geni
espressi da un particolare
tipo di cellula.
pcr (polymerase chein reation)
• Per ottenere molte copie di una specifica
sequenza di DNA si utilizza comunemente la
tecnica PCR
Quando il campione di DNA è
scarso o impuro, la reazione a
catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, o
PCR) è un metodo più appropriato
per ottenere un grande
quantitativo
di un particolare gene.
Molecola
iniziale
di DNA
1
2
4
8
Numero di molecole di DNA
Thermus aquaticus
taq polimerasi
elettroforesi
• L’elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA
in base alle loro dimensioni
Miscela di molecole
di DNA di dimensioni
diverse
Molecole
più lunghe
Generatore
elettrico
Gel
+
Molecole
più corte
+
Disposizione finale
• Un’impronta genetica (DNA fingerprint) può aiutare a
risolvere in crimine:
Sangue
dell’imputato
Sangue rinvenuto
sui vestiti dell’imputato
Sangue
della vittima
Coltura batteri in Petri Dish
marcatore di resistenza antibiotico
Il processo di clonazione genica non è efficiente al 100%, la maggior
parte dei batteri in una coltura non viene “trasformata”.
Si inserisce allora nel plasmide ricombinante un gene di resistenza ad
un antibiotico. Solo i batteri che sono stati trasformati con il plasmide,
quindi solo i ricombinanti, possono crescere in una coltura che contiene
l’antibiotico.
Microorganismi GM: utilità
La tecnologia del DNA ricombinante ha un
enorme impatto sull’industria alimentare e
farmaceutica e sulla medicina umana.
I microorganimi GM sono ampiamente utilizzati
per:
– la ricerca biochimica o cellulare e lo studio e la
diagnosi (ed in futuro la cura) delle malattie
– per produrre farmaci, vaccini o enzimi
alimentari.
microorganismi GM
• I batteri geneticamente modificati si sono
spesso dimostrati gli organismi migliori
per sintetizzare un prodotto proteico
(ma si utilizzano all’occorrenza anche
cellule eucariote come lieviti o colture
cellulari vegetali o animali) .
insulina
ormone della crescita (GH)
– L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i
primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della
tecnologia del DNA ricombinante.
– Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i
tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.
• Vaccini
– Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in
grado i sintetizzare anche nuovi vaccini.
– Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un
agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è
utilizzato per prevenire una malattia infettiva.
• Ricerca Biologica, Diagnosi e cura delle malattie
– In campo medico la tecnologia del DNA
ricombinante è sempre più usata per comprendere i
processi biochimici e cellulari della vita.
Queste nuove conoscenze permettono di
diagnosticare e curare le malattie.
terapia genica
Una malattia genetica è una malattia che si trova nei
geni dell’individuo; può essere dovuta alla presenza
di uno o più alleli che producono proteine con
struttura e funzionalità anomala o alla mal
regolazione nell’espressione di geni “normali”.
Il numero delle malattie genetiche è molto alto: circa
7000, solo circa un migliaio diagnosticabili e ancora
meno sono quelle che hanno una cura.
Una malattia è considerata rara quando ha una
prevalenza nella popolazione generale inferiore ad 1
caso su 2000 abitanti.
terapia genica
• Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la cura per
molte malattie genetiche.
• La terapia genica può correggere le malattie imputabili a un
singolo gene difettoso, sostituendolo o integrandolo con un
allele normale.
Gene clonato
(allele normale)
1 Inserimento del gene normale nel virus
Acido nucleico virale
Retrovirus
2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus
3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi
Cellule di midollo osseo del paziente
Midollo osseo
4 Le cellule
vengono iniettate nel paziente
SCID
David Vetter (1971-1984)
scid
-SCID è la prima malattia al mondo ad essere curata con la terapia genica
del sangue è sicura ed efficace. Questi risultati aprono la strada alla terapia genica
con cellule staminali in altre forme di immunodeficienze ereditarie, ma anche nelle
talassemie e in alcune malattie metaboliche degenerative del sistema nervoso, su cui
la Fondazione Telethon sta già lavorando.
-TIGET hanno prelevato le cellule staminali del midollo dei
piccoli pazienti e hanno inserito in laboratorio una copia sana del gene ADA,
corrette, queste sono ritornate nel midollo osseo e hanno iniziato a produrre cellule
cellule staminali corrette continuano a essere presenti e attive nel produrre cellule
del sangue, tra cui i linfociti, a distanza di molti anni dalla terapia. Il sistema
immunitario dei bambini è ora in grado di funzionare normalmente, distruggendo i
virus e producendo gli anticorpi che li proteggono dalle infezioni. Il ripristino del
normale metabolismo ha consentito ai bambini di cominciare a crescere e
svilupparsi come i loro coetanei. Lo studio clinico ha fornito anche importanti
informazioni sulla sicurezza della terapia genica, perché non sono stati osservati
tossicità o eventi avversi legati alla terapia genica.
Oggi si può finalmente dire che il trattamento genico dell'ADA-SCID è efficace
dopo molti anni: i primi nove bambini che vivevano isolati dal resto del mondo sono
cresciuti, vanno a scuola, fanno una vita normale e hanno ormai dimenticato di
essere stati malati. Di recente altri tre bambini hanno ricevuto la terapia genica
-TIGET e anche per loro la cura si avvia ad essere un successo.
– La terapia genica potrebbe un giorno essere usata
per curare sia le malattie genetiche, sia le malattie
non genetiche.
– Anche se è uno strumento molto promettente,
esistono ancora poche prove scientifiche evidenti
della sua efficacia.
– La terapia genica sull’uomo solleva problemi sia
tecnici sia etici (bioetica).