“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
Il cluster α−globinico:
organizzazione, alterazioni molecolari e classificazione delle α−talassemie
Cristina Passarello
U.O. Ematologia II – Laboratorio per lo Studio e la Diagnosi Molecolare Prenatale di Talassemia
A.O. “V. Cervello”, Palermo
Durante i diversi periodi di sviluppo (Embrionale, Fetale ed Adulto) sono presenti diversi tipi di
emoglobine, costituite da coppie diverse di catene; si può notare che alcune catene sono
specifiche per un tipo di emoglobina, mentre altre sono comuni a più tipi. Le catene comuni
sono: le catene ζ presenti all’inizio del periodo embrionale (nell’Hb Gower I e nell’Hb Portland)
e le catene α presenti a partire dalla 6a settimana di gestazione (dalla Hb Gower II all’Hb
Adulta).
I geni che codificano le catene ζ ed α si trovano all’estremità distale del braccio corto del
cromosoma 16; l’insieme di questi geni è definito cluster alpha.
Cluster alpha
5’
5’HVR
α−MRE
HS-40
Cromosoma
16pter-p13.3
ζ2
ψζ1 ψα2
ψα1
α2
α1
θ
3’
Inter-ζ HVR
3’HVR
sequenze Alu I
Regione di circa 30 Kb molto ricca in G + C (60%)
Dr.ssa C.Passarello
Il cluster alpha si trova in una regione del DNA di circa 30 Kb particolarmente ricca in GC
(60%) ed include, secondo il loro ordine di attivazione ed espressione durante i vari periodi di
sviluppo, in direzione 5’→ 3’ i geni: ζ2, tre pseudogeni (geni che presentano delle omologie di
sequenza con gli altri loci globinici ma presentano delle mutazioni che li rendono non funzionali
e quindi non essenziali) Ψζ1, Ψα2 ,Ψα1, i geni α2 ed α1 ed infine lo pseudogene θ.
A monte del cluster alpha da circa -30 a -60 Kb dal cap del gene ζ2, è presente una sequenza
regolatrice positiva α−MRE (il cui principale elemento regolatore positivo è il sito HS-40) simile
a quella identificata alla LCR a monte del cluster β.
Geni Alpha:
I due geni α2 ed α1 sono il risultato di una
α2
α1
duplicazione avvenuta circa 60 milioni di anni fa;
5’
sono inseriti in tre grandi sequenze omologhe
(X,Y ed Z) anch’esse duplicate in tandem.
X
Y
Z
X
Y
Z
Sono entrambi costituiti da 3 esoni perfettamente
identici fra loro e le uniche differenze si possono
Esone 1
Esone 2
Esone 3
riscontrare all’interno del II introne (sostituzione
5’UTR Cd 1−31
IVS I
IVS II Cd 100−142 3’UTR
Cd
32−99
di una base e delezione di sette basi nell’α2
CAP ATG
TAA AATAAA
rispetto all’α1) e dopo il 3° esone, nella regione
fiancheggiante 3’UTR (sostituzione di diciotto
Promoter
basi e delezione di una base nell’α2 rispetto
all’α1). Un’altra differenza si riscontra a livello di
espressione: il gene α2 ha un ruolo predominante
GT
CAAT
117 bp
AG
GT
α2142 basi
AG
α1149 basi
ATA
CCGCC
Dr.ssa C.Passarello
12
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
rispetto ad α1 come si evidenzia dal rapporto fra gli mRNA, che risulta ~2.6-2.8 a favore dell’α2.
•
•
Le Alpha Thalassemie sono causate da difetti genetici che determinano un decremento o una
completa soppressione delle catene α.
Fenotipicamente si distinguono in:
α+ thalassemie: si hanno 3 geni funzionanti su 4; il quadro ematologico è pressoché normale
(lieve microcitemia) ed un quadro emoglobinico normale (livelli di HbA2 nella
norma).
α0 thalassemie: si hanno 2 geni funzionanti su 4; il quadro ematologico è evidente (marcata
microcitemia) ed un quadro emoglobinico pressoché normale (livelli di HbA2 da
lievemente più bassi a normali). I geni non funzionanti possono trovarsi in cis
sullo stesso allele o in trans, su alleli diversi per associazione tra alleli α+.
L'interazione tra un determinante α+ ed uno α0 causa la malattia da Hb H (β4): la presenza di 3
geni α non funzionanti porta ad una deficienza quantitativa dell’mRNA dell’α globina rispetto
all’mRNA della β globina. Le catene β e γ in eccesso si associano in tetrametri, β4 e γ4,
inefficienti dal punto di vista funzionale, che si ossidano e precipitano rapidamente. Si ha una
eritropoiesi inefficace, ma anche una discreta quota di eritropoiesi efficace che produce emazie
mature ma con breve vita a causa dei precipitati. Le emazie vengono sequestrate e distrutte nella
milza che di conseguenza aumenta di volume (nei casi più gravi si ricorre a splenectomia).
Una quota di catene α, sia pur piccola, continua ad essere prodotta e dà luogo a piccole quote di
HbA, HbA2 ed HbF. Il paziente riesce a condurre una vita “normale” con un livello di Hb basso
ma che, in generale, non richiede terapia trasfusionale; può però, andare incontro a gravi crisi
emolitiche in caso di assunzione di farmaci ossidanti (sulfamidici, altimalarici).
Si può avere una forma grave di malattia da Hb H in pazienti con genotipo α0 da delezione ed α+
da mutazione puntiforme. La malattia si manifesta nella prima infanzia con grave anemia, crisi
emolitiche e splenomegalia per cui sono richieste trasfusioni e splenectomia.
L'interazione tra due determinanti α0 causa la Sindrome dell’Idrope Fetale con Hb Bart (γ4):
nessuno dei 4 geni alpha è funzionale e si ha una totale incapacità di sintetizzare catene α; circa
il 25% dei feti muore in utero tra la 28a e la 38a sett. il resto alla nascita o poco dopo.
Natura molecolare delle Alpha-Thalassemie:
Possono essere causate da delezioni di variabile lunghezza o da mutazioni puntiformi; data la
particolare struttura del cluster alpha (presenza di molte regioni omologhe ripetute) le delezioni
sono la causa predominante delle alpha-thalassemie.
Tipi di mutazioni da delezione:
•
Le delezioni corte che eliminano un solo gene α determinano un fenotipo da α+; alcuni esempi
sono la –α3.7, la –α4.2, la –α3.5 , la –α2.7, la –(α)5.3.
Tra queste le più comuni nell’area Mediterranea sono la –α3.7 e la –α4.2 che si formano,
rispettivamente, per ricombinazione errata fra le regioni omologhe Z ed X.
Nella –α3.7 si ha la formazione di un gene ibrido α2/α1 meno funzionale rispetto ai geni normali.
Esistono tre tipi di delezione –α3.7 a seconda del punto esatto di ricombinazione; tra questi il tipo
I è maggiormente presente in Sicilia anche se in misura minore si riscontra anche il tipo II. Le
due forme presentano un fenotipo differente: il tipo II risulta essere più grave, con un fenotipo a
metà fra un α+ ed un α0 e questo perché alla delezione è sempre associata una delezione di 2nt
(AC) a monte del codone d’inizio che diminuisce l’efficienza di traduzione del gene.
13
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
La controparte della delezione –α3.7 è la formazione di un allele con due geni alpha ed un gene
alpha ibrido chiamata αααanti 3.7; questa condizione è particolarmente importante in caso di
coeredità con un determinante β−talassemico, in quanto non fa altro che aumentare lo sbilancio
delle catene α/β.
Nella –α4.2 si ha l’eliminazione dell’intero gene α2 e rimane soltanto un gene α1 ; la controparte è
la condizione di αααanti 4.2.
Delezione - α 3.7
X
Y
Z
5’
X
Y
Delezione - α 4.2
Z
α2
X
3’
Y
X
Y
X
Y
α 1/α 2
Z
X
Y
X
Y
α 2/α 1
X
Y
X
3’
ααα anti 3.7
Y
Z
3’
α1
Z
Y
X
Y
Z
X
Y
Z
Y
3’
α1
X
Y
ααα anti 4.2
Z
α1
X
Z
Z
α2
5’
− α 3.7
3’
α1
α2
X
3’
Y
5’
Z
Dr.ssa C.Passarello
•
α2
5’
Z
α1
Z
5’
3’
α1
Z
α2
5’
X
X
α2
X
Z
α2
X
5’
Y
5’
α1
3’
− α 4.2
Z
Dr.ssa C.Passarello
Le delezioni lunghe che eliminano due geni α determinano un fenotipo da α0; si possono
formare per rotture cromosomiche o per ricombinazione errata fra regioni omologhe e non
omologhe.
Alcuni esempi di delezioni lunghe presenti nel Mediterraneo sono: -(α)20,5, la α--MED, la α--CAL.
Alcuni Esempi di fenotipi da alpha-thalassemia di tipo delezionale:
RBC
HB
HCT
MCV
MCH
MCHC
RDW
A2
genotipo:
•
4.94
13.7
40.8
82.6
27.7
33.5
13.1
2.9
5.14
13.7
41.8
81.5
26.7
32.7
13.9
2.7
α3.7 /αα
α4.2/αα
6.23
14.6
45.1
72.3
23.4
32.4
14.4
2.5
α3.7 I/α3.7 Ι
5.45
13.5
40.9
74.9
24.8
33.1
14.5
2.3%
-(AC)α3.7 II/αα
5.59
12.3
38.5
68.8
22.1
32.1
14.2
2.7
α-- MED/αα
6.39
13.3
40.4
63.0
20.7
32.9
13.8
2.4
α-20.5/αα
Mutazioni puntiformi:
Includono sostituzioni di un singolo nucleotide, piccole delezioni o inserzioni; possono
coinvolgere la sequenza codificante, regioni regolatrici o di segnale non tradotte o aree critiche la
cui integrità è importante per un corretto processamento dell’mRNA.
La maggior parte coinvolgono il gene α2 (286 contro 250 in α1), in accordo con l’espressione
dominante di quest’ultimo rispetto ad α1.
Alcuni esempi di mutazioni puntiformi presenti nel Mediterraneo sono: α2NcoI, α2HphI, α1NcoI,
α2SaudiArabia.
14
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
La mutazione α2HphI consiste in una piccola delezione di 5nt che inattiva il sito corretto di
splicing attivandone un secondo all’interno dell’esone I; viene inoltre obliterato un sito di
restrizione per l’enzima HphI
Altre mutazioni che causano difetti di maturazione sono quelle che colpiscono il sito di PolyA,
determinando un mRNA più lungo della norma; un esempio è α2SaudiArabia che presenta un
fenotipo α+/0 in quanto, non essendoci un successivo terminatore, la trascrizione potrebbe
raggiungere il successivo gene α1 interferendo anche con la normale espressione di quest’ultimo.
Ci sono poi mutazioni che determinano difetti di traduzione come quelle che colpiscono il
codone di termine 142 (α2ConstantSpring) ed altre che causano instabilità post-traduzionale.
Altre ancora possono generare delle varianti.
Alcuni Esempi di fenotipi da alpha-thalassemia di tipo puntiforme:
RBC
HB
HCT
MCV
MCH
MCHC
RDW
A2
5.65
14.4
43.7
77.3
25.5
33.0
14.1
2.6
5.55
13.5
41.3
74.0
24.2
32.6
14.2
2.7
4.93
13.0
39.7
80.4
26.4
32.8
13.7
2.4%
4.42
11.6
33.3
75.3
26.2
34.8
14.0
2.8%
genotipo:
αHphIα/αα
αNcoIα/αα
αCSα/αα
ααBernalda/αα
6.07
15.2
46.4
76.4
25.0
32.8
15.5
2.5%
αSaudiArabiaα/αα
E’ da notare che vi sono alcune forme di Alpha Talassemia, molto rare, che risultano essere
associate a Ritardo Mentale. Una di queste è l’ATR-16, trovata in pochissimi casi come
mutazione ex novo o come mutazione ereditata da un portatore che la presentava in maniera
bilanciata. La patologia è causata dalla rottura telomerica del braccio corto del cromosoma 16,
coinvolgendo così il cluster alpha globinico ed anche altri geni coinvolti nel corretto sviluppo
mentale.
Un’altra forma di alpha talassemia associata anche questa con Ritardo Mentale è l’ATR-X,
causata però da una alterazione nel cromosoma Xq13.3 che colpisce il gene ATRX; il prodotto
del gene è probabilmente una proteina coinvolta nella regolazione genica, ma la sua esatta
funzione è ancora oggetto di studio.
Forse la proteina ATRX fa parte di un complesso di rimodellamento della cromatina,
favorendone il passaggio alla forma attiva in maniera diretta o indiretta.
15
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
Vengono riportate anche forme di alpha talassemia con HbH acquisite in associazione con
disordini mieloproliferativi (ATDMS); sono presenti in un registro internazionale 68 casi
accertati in cui la presenza della alpha talassemia è non ereditata, presente soltanto dal momento
della comparsa della neoplasia ematologica, e con una presenza di corpi di Heinz all’interno
degli eritrociti.
Frequenze dell’ Alpha Talassemia
Nel mondo questa forma di talassemia è particolarmente presente in Asia e soprattutto in Cina,
Giappone ed in tutto il bacino della Melanesia. Nel Mediterraneo così come la β−tal, è molto
presente in Sardegna con dati riportati del 35%, ed anche in Sicilia la sua percentuale affianca in
valore quella della β−tal. Dall’analisi dei dati ottenuti dagli studi dell’ Hb effettuati nel
laboratorio di Diagnosi Prenatale Talassemia Az.Osp ”V.Cervello”, la percentuale risulta circa
del 7% e la mutazione più frequente in assoluto è la forma di α+ talassemia data dalla delezione –
α3.7 (73.2%).
Cipro*
10,0 %
Grecia*
8,0 %
20%
25%
Sud Est Asiatico
35,0 %
Melanesia
Portogallo*
Sardegna Meridionale*
15,0 %
Africa
26,5%
Paesi Mediterranei
47%
Lazio*
7,0 %
13,3 %
Sicilia
Bianco Silvestroni: Le Talassemie (1998)
3,4%
alpha-3,7
2,3% 2,3% 1,5%
1,2%
alpha2 HphI
4,0%
alpha-- MED
alpha X
5,2%
alpha2 NcoI
alpha2 S.A
6,9%
alpha-- 20,5
alpha-- CAL
alpha-4,2
73,2%
16
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
“Le Emoglobinopatie: dal Fenotipo al Genotipo” -Palermo 21-25 Novembre 2005
C.Passarello
Analisi Molecolare per Alpha Talassemia
Il portatore di alpha-tal presenta un fenotipo simile a quello di una carenza marziale per cui, la
prima cosa da fare è escludere una anemia da ferro.
In seguito si valuta il fenotipo e l’eventuale presenza di una picco variante in HPLC; in
quest’ultimo caso, è necessaria l’analisi di sequenza dei geni globinici (se si conosce già
orientativamente a quale mutazione potrebbe essere associato il picco ci si indirizza prima sul
gene sospetto).
Dato che le delezioni sono le mutazioni più frequenti, sono queste le prime ad essere ricercate
per mezzo della GAP-PCR.
Naturalmente, il fenotipo può far orientare verso la delezione da ricercare; in caso di un fenotipo
da α+ la prima mutazione da ricercare deve essere la –α3.7 e, a seguire, la –α4.2.
La sequenza genica è sempre consigliata, ma in caso non fosse possibile farla, è consigliabile
ricercare le mutazioni puntiformi più frequenti come α2NcoI ed α2HphI.
Per un fenotipo da α0, l’analisi va orientata verso sia le delezioni corte, che potrebbero essere in
omozigosi, che verso le lunghe come le –α20.5 ed la α--MED; non vanno escluse le mutazioni
puntiformi che potrebbero essere presenti in omozigosi.
Attenzione un fenotipo da α0 potrebbe, tuttavia, nascondere una β−talassemia associata ad una
δ−talassemia, che riduce il valore dell’ HbA2.
In ogni caso, in presenza di una diagnosi dubbia l’analisi familiare potrebbe essere di aiuto.
Letture Consigliate:
•
•
•
•
•
D.R.Higgs et al. A Review of the molecular geneticsof the Human α−globin gene cluster.
Blood 1989;73: 1081-1104.
L.F. Bernini and C.L. Harteveld; Baillière’s Clinical Haematology 1998; 53-90.
Foglietta et al. Detection of a-globin gene disorderes by a simple PCR methodology.
Haematologica 1996; 81:387D.H.K. Chui et al. Hemoglobin H : not necessarily a benign disorder. Blood 2003; 101:
791-800.
D.P. Steensnma, R.J. Gibbons and D.R. Higgs. Acquired α−thalassemia in association
with myelodysplastic syndrome and other hematologic malignancies. Blood
2005;105:443-452.
17
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
