Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
www.microbiologia.unige.it
MALATTIE INFETTIVE E MICROBIOLOGIA CLINICA
Prof. Oliviero E. Varnier
2013
Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
Batteri Gram negativi opportunisti
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus Providencia, Citrobacter
Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter
www.microbiologia.unige.it
Graziana Manno
Sezione di Microbiologia –Dipartimento di Scienze Chirurgiche R e
Diagnostiche Integrate (Disc)
www.microbiologia.unige.it
2013
Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, (gruppo KES) , Proteus, Providencia, Citrobacter
Enterobacteriaceae
agenti etiologici di
INFEZIONI A LOCALIZZAZIONE EXTRAINTESTINALE
di tipo opportunistico e prevalentemente nosocomiali
3
di
00
Enterobatteri patogeni opportunisti
fanno parte della flora normale
non sono in grado di dare patologia
in alcune condizioni predisponenti legate dell’ospite:
•Immunocompromissione: AIDS, malnutrizione, terapie
immunosoppressive, etc
•salti di barriera: ferite, interventi chiurgici, manovre invasive, etc
si comportano da patogeni
Possono anche essere definiti microrganismi
occasionalmente patogeni
4
di
00
Klebsiella spp.
Microrganismo ubiquitario
habitat
• Ambientale acqua, suolo, piante,
•
materiale in decomposizione
• mammiferi uomo, cavalli, suini
nell’uomo rappresenta un saprofita
del nasofaringe e dell’intestino
5
di
00
Klebsiella spp.
colonizzazione
individui sani
pazienti ospedalizzati
5 – 38% feci
77% feci
1 – 6 % orofaringe
19 % orofaringe
42% mani
La colonizzazione e la comparsa di ceppi MDR (Multi Drug Resistant) è favorita dalla
pressione selettiva degli antibiotici piuttosto e a fattori relativi alla ospedalizzazione
Il personale ospedaliero può presentare elevate percentuali di colonizzazione
6
di
00
Klebsiella spp.
Il principale reservoir per la trasmissione di Klebsiella spp.
in ambiente ospedaliero è rappresentato da
Il tratto gastrointestinale dei pazienti
le mani del personale sanitario
importanza del lavaggio delle mani e delle misure di
prevenzione e controllo delle infezioni
7
di
00
Tassonomia del Genere Klebsiella spp.
1. Klebsiella pneumoniae
subsp. pneumoniae
subsp. ozaenae
subsp. rhinoscleromatis
2. Klebsiella oxytoca
3. Klebsiella terrigena
4. Klebsiella planticola
5. Klebsiella ornithinolytica
8
di
00
Fattori di patogenicità di Klebsiella spp.
•
•
•
•
•
Capsula
(77 sierotipi)
LPS
(8 sierotipi)
Adesine
(pili tipo 1 e tipo3; fimbrie; adesine aggregative)
Resistenza al siero
Siderofori
9
di
00
Klebsiella spp. antigeni capsulari
Spessa capsula polisaccaridica essenziale per la virulenza
di Klebsiella spp.
Protegge il batterio dalla fagocitosi da parte dei PMN
Previene il kiling da parte dei fattori battericidi del siero
Non è stato possibile stabilire una chiara correlazione tra tipo
capsulare e patologia
Alcuni studi evidenziano che il sierotipo K2 sia il tra i più comuni
sierotipi coinvolti in UTI (Urinary –Tract –Infections)
10
di
00
Klebsiella spp. fenotipo mucoso
Klebsiella spp.
E.coli
11
di
00
Klebsiella spp.
Pili (fimbrie)
adesine Tipo 1 : permettono l’adesione dei batteri al muco o
all’epitelio respiratorio/urogenitale/intestinale
adesine Tipo 2: permettono l’adesione all’epitelio
respiratorio e del tratto urogenitale
Resistenza al siero e LPS
Resistenza agli effetti battericidi del siero mediati dal
complemento
12
di
00
Klebsiella spp. patologie
sono patogeni opportunisti
causano gravi patologie tipicamernte nosocomiali
Setticemie
Polmoniti
UTI
Infezioni dei tessuti molli
target di questi batteri sono principalmente pazienti
immunocompromessi , ospedalizzati, con malattie
predisponenti
13
di
00
Klebsiella granulomatosis
agente etiologico del granuloma inguinale malattia
granulomatosa che interessa i genitali e l’area inguinale
Malattia endemica nell’America Meridionale, Caraibi, Papua
Nuova Guinea, India,Vietnam, Africa meridionale e
Australia
Klebsiella rhinoscleromatis
Malattia granulomatosa del naso
Klebsiella ozaenae
Rinite cronica atrofica
14
di
00
Enterobacter spp.
Habitat comune a Klebsiella spp. ad altri Enterobatteri
Patogeno umano, degli insetti e delle piante
Tassonomia del genere complessa e spesso i sistemi di
identificazione di laboratorio hanno limiti nel discriminare tra i
componenti
Enterobacter cloacae complex
E.hasburiae
E.hormaechei
E.kobei
E.ludwigii
E.nimipressuralis
Enterobacter aerogenes
Enterobacter sakazaki
Enterobacter agglomerans
Enterobacter gergoviae
15
di
00
Enterobacter spp.
Patogenicità
Membrana esterna lipide A (endotossina)
Fonti di contaminazione ospedaliera
Mani del personale
Endoscopi
Epidemie da prodotti contaminati nutrizione parenterale totale,
fisiologica , termometri etc.
16
di
00
Enterobacter spp. patologie
Infezioni respiratorie
UTIs
Batteriemie
Infezioni dei tessuti molli - Endocarditi - Infezioni intra-addominali
Osteomieliti -Infezioni SNC - Artrite settica - Infezioni oculari
Enterobacter sakazakii può causare gravi patologie nei neonati e nei
bambini associato ad outbreaks per polveri per infanzia contaminate
17
di
00
Serratia spp.
Specie:
Serratia marcescens (unica specie riconosciuta come
patogeno nosocomiale)
Serratia liquefaciens
Serratia rubidaea
Serratia odoriferae
Serratia plymuthica
Ampiamente distribuite in natura , acqua, piante, suolo,
piccoli mammiferi (roditori), insetti
Uomo : pazienti ospedalizzati (gli individui sani non si
colonizzano con Serratia spp.)
18
di
00
Serratia spp. fattori di patogenicità
Fimbrie
Siderofori (enterobactina)
Emolisine
Resistenza al siero
Proteasi extracellulari
I ceppi non pigmentati di S.marcescens sono più resistenti
agli antibiotici dei ceppi pigmentati
19
di
00
Serratia spp. patologie
Infezioni respiratorie
UTIs
Setticemie
Endocarditi
Infezioni cutanee
Otiti
Infezioni oculari
20
di
00
Gruppo : Proteus spp. , Providencia spp.
Genere Proteus 5 specie
P.mirabilis, P.vulgaris specie più frequenti e di rilievo clinico
Ubiquitari (acqua, suolo, piante) parte della flora normale
del tratto intestinale dell’uomo
Bacilli pleiomorfi molto mobili per flagelli peritrichi
P.mirabilis sciamatura nei terreni di coltura
21
di
00
Proteus spp.
Fattori di virulenza
Flagelli/ pili (6 tipi diversi)
attività ureasica che scinde l’urea in anitride carbonica e
ammoniaca (la proliferazione di Proteus spp. causa forte
alcalinizzazione delle urine, induce la precipitazione dei sali
di magnesio e potassio sotto forma di cristalli e formazione
di calcoli renali)
Infezioni
Dopo E.coli e Enterococcus spp. è la 3° causa più comune
di cistiti , pielonefriti e prostatiti, 30 % delle UTIs
Meno frequentemente causa :
Batteriemie
Meningoencefaliti neonatali
Empiemi
osteomieliti
22
di
00
Providencia spp.
Genere strettamente correlato al genere Proteus
Due specie principali
• P.rettgeri
• P.stuartii
Infezioni più frequenti sono UTIs nei portatori di protesi
vescicali
23
di
00
Citrobacter spp.
Genere strettamente correlato a Escherichia e Salmonella
Colonizza l’intestino dell’uomo de degli animali
Patogeno opportunista
UTIs – patogeno nosocomiale
Citrobacter koseri puo’ dar luogo a meningite e ascessi
cerebrali neonatali
24
di
00
La resistenza agli antibiotici nei Gram negativi
Dovuta alla selezione di ceppi resistenti, in seguito all'esposizione
ad un farmaco.
acquisita tramite mutazioni o mediante il trasferimento di
materiale genetico da parte di batteri resistenti.
La diffusione dell'antibiotico resistenza è favorita dall'utilizzo
esteso (e spesso improprio) degli antibiotici, in particolare quelli
ad ampio spettro, che aumenta la pressione selettiva in grado di
far emergere e diffondere i ceppi resistenti.
25
di
00
Time-line dall’introduzione degli antibiotici beta-lattamici e la comparsa di
resistenza.
26
di
00
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi
Resistente a praticamente tutti gli antibiotici (pan-resistenza), tra i quali i
carbapenemi, considerati oggi una delle ultime risorse per la terapia delle
infezioni da batteri Gram negativi multi-resistenti.
Causa gravi infezioni quali cistiti, pielonefriti, polmoniti e batteriemie in grado di
evolvere rapidamente in shock settico, mettendo a serio rischio la vita del
paziente, con una mortalità che supera il 50%.
27
di
00
I batteri non-fermentanti (il glucosio)
(Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas,
Acinetobacter, e altri )
Bacilli Gram negativi non-fermentanti per assenza delle vie
metaboliche fermentative (sono quindi quasi tutti aerobi
obbligati)
Tutti mobili per flagelli polari
Diffusissimi nell’ambiente per la loro capacità di utilizare
come fonti di carbonio una grande varietà di composti
organici
Tassonomia complessa in continua evoluzione con vari
rimaneggiamenti classificativi nel tempo
28
di
00
Diversi
habitats
• Suolo
• Acqua (sorgiva/marina)
• Piante,animali
Industria
Deterioramento alimenti
Patogeno delle piante
P. aeruginosa
Alginato
Enzimi
Acidi grassi
Biotecnologie ambientali
• Biotrasformazione
• Bioremediation
• Biocontrollo
• Biofertilizzazione
Patogeno umano opportunista
29
di
00
P. aeruginosa
un “successo biologico”
(adattabilità e tipo di crescita)
dovuto ad un’ampia versatilità genetica
PA01
Genoma 6.3 milioni pb
30
di
00
P.aeruginosa morfologia
Bacilli diritti o debolmente ricurvi
Dimensioni 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm
Mobili, con flagelli polari
Gram-negativi
Aerobi obbligati
Alcuni ceppi possiedono abbondante capsula
mucosa costituita da alginato
31
di
00
P.aeruginosa habitat
Microrganismi ubiquitari, si trovano:
• suolo
• materiale organico in decomposizione
• vegetazione
• acqua
• fiori recisi
• lavandini
• toilette
• strofinacci da pavimento
• attrezzature per dialisi
• respiratori di terapia intensiva
• soluzioni disinfettanti a base di ammonio quaternario
32
di
00
P.aeruginosa patogenicità
• Patogeni per piante, animali e uomo
• Possono causare infezioni opportunistiche, in soggetti con difese
organiche compromesse e nell’ospite immunocompetente
• Causa frequente di infezioni nosocomiali
Causa patologia in caso di:
• lesioni traumatiche
• ustioni
• impianti protesici
• interventi esplorativi o chirurgici
• utilizzazione di droghe per via endovenosa
• immunocompromissione dell’ospite
33
di
00
P.aeruginosa
fattori di patogenicità
La virulenza di P.aeruginosa è multifattoriale
Adesine
Capsula polisaccaridica
Tossine
Endotossina
Esotossina A
Esoenzima S
Enzimi
Elastasi
Fosfolipasi C
Piocianina
34
di
00
COMPONENTI STRUTTURALI
ADESINE
L’adesione è mediata da pili e da adesine non piliari
CAPSULA POLISACCARIDICA
Costituita prevalentemente da alginato permette l’adesione
alle cellule (fibrosi cistica ed altre malattie respiratorie) ed
impedisce la fagocitosi
Favorisce l’adesività alla superficie di protesi vascolari
35
di
00
Alginato
Alginato è un polimero lineare di beta-D-mannuronato e
alpha-L-guluronato
Sostanza che serve nell’industria come addensante per cibi
(es gelati), nell’industria tessile e della carta.
36
di
00
TOSSINE
ENDOTOSSINA
L’endotossina lipopolisaccaridica è il principale antigene
della parete cellulare
Il lipide A, componente dell’endotossina, media i diversi
effetti biologici della sindrome setticemica
ESOTOSSINA A
E’ tra i principali fattori di virulenza rilasciati in ambiente
extracellulare da ceppi patogeni di P.aeruginosa
Responsabile:
• della necrosi tissutale nelle ustioni
• dell’insufficienza respiratoria nelle infezioni polmonari
37
di
00
ENZIMI
ELASTASI
E’un’endopeptidasi che può digerire numerose proteine umane tra cui:
•
elastina
•
collagene
•
fibrina
•
IgG
•
IgA
•
componenti del complemento
•
transferrina
FOSFOLIPASI C
Enzima termolabile che degrada lipidi e lecitina facilitando il danno
tissutale
38
di
00
ENZIMI
PIOCIANINA
Pigmento verde/blu prodotto da P.aeruginosa
Catalizza la produzione di superossido e perossido d’idrogeno
(forme tossiche dell’ossigeno)
Possiede attività antibatterica nei confronti di Staphylococcus
aureus ed E.coli
39
di
00
P. aeruginosa pigmenti diffusibili
piocianina (verde/blu) si osserva
dopo esposizione delle colture
alla luce solare
pioverdina (verde) esposizione agli UV
fluoresceina (gialla)
piorubina
(rosso-marrone)
piomelanina (nero)
40
di
00
EPIDEMIOLOGIA
Presenti nell’ambiente, hanno richieste nutrizionali minime
Tollerano temperature comprese tra 4°C e 42°C
Resistenti ad antibiotici e disinfettanti
Commensale nelle prime vie respiratorie e nel materiale fecale
41
di
00
SINDROMI CLINICHE
Infezioni polmonari
Infezioni della cute (ferite, ustioni)
Infezioni delle via urinarie
Infezioni dell’orecchio
Infezioni dell’occhio
Batteriemia ed endocardite
Meningite
42
di
00
P.eruginosa capacità di persistenza e di causare infezioni croniche
Il BIOFILM
è un aggregato di cellule microbiche (anche di diverse specie)
associate e tenacemente adese ad una superficie e incluse in una
matrice polimerica extracellulare da esse prodotta.
i biofilm sono dotati di particolari funzioni adatte alla
colonizzazione di superfici sia biotiche sia abiotiche e
sono stati osservati in tutti gli ecosistemi naturali
I biofilm si compongono:
per il 15% di cellule batteriche
per l’85% di materiale della matrice.
43
di
00
Formazione del Biofim
Le caratteristiche strutturali dei biofilm incidono sull’istaurarsi di infezioni
batteriche croniche, (quale l'endocardite valvolare, Fibrosi Cistica , etc.),
e la tendenza delle microcolonie a distaccarsi dal biofilm può produrre emboli
infettivi che, attraversando i capillari, possono portare a gravi conseguenze.
IMP I batteri all’interno del biofim sono protetti e quindi resistenti alle difese
dell’ospite e agli agenti antibatterici
44
di
00
I BIOFILM COINVOLTI NELLE PATOLOGIE DELL’UOMO
I biofilm sono agenti eziologici di svariate malattie che di frequente
interessano la patologia umana
Infezioni o malattia Biofilm
(specie batterica principale)
Carie dentali Cocchi
Streptococchi
Otite media
Ceppi di Haemophilus influenzae
Infezioni muscoloscheletriche
stafilococchi)
Cocchi Gram-positivi (es.
Infezioni del tratto gastro-intestinale
Batteri enterici (es. Escherichia coli)
Endocardite
Streptococchi gruppo viridans
Polmonite associata a fibrosi cistica
P. aeruginosa, Burkholderia cepacia
45
di
00
Biofilm come contaminanti di strumenti e presidii medici
Dispositivi contaminanti
Biofilm (specie batterica principale)
Lenti a contatto
Cocchi gram-positivi e P. aeruginosa
Dispositivi per dialisi
Flora batterica e fungina mista
Cateteri urinari
E. coli e altri bacilli gram-negativi
Dispositivi endotracheali
Flora batterica e fungina mista
Cateteri venosi
S. epidermis
Valvole cardiache meccaniche S. aureus e S. epidermidis
Inneschi vascolari
Cocchi Gram-positivi
Dispositivi ortopedici
S. aureus e S. epidermidis
Protesi di vari organi
S. aureus e S. epidermidis
46
di
00
P.aeruginosa Infezione Cronica in Fibrosi Cistica
Pseudomonas aeruginosa
ambientale
Aumentati trattamenti antibiotici
Adattamento batterico
Malattia
polmonare
• modificazioni
• Fenotipi batterici
superficiali
(biofilm, virulenza,
• produttori di alginato
resistenza agli antibiotici)
• Auxotrofi
Pressione delle difese dell’ospite
PA colonizzazione asintomatica
• Ipermutabili
• Small Colony Variant
Aumento carica batterica –Infezione sintomatica
47
di
00
Fenotipi di P.aeruginosa in Fibrosi Cistica
AeB
Ceppi mucoidi
Ceppi SCV
C Pigmentati e D nonpigmentati
48
di
00
Burkholderia cepacia complex
Gruppo di batteri non fermentanti descritti come patogeni delle piante
Presenti nell’ambiente in prevalenza nella rizosfera delle piante
Utilizzati come biopesticidi e biofertilizzanti
Importanti patogeni opportunisti per i pazienti immunocompromessi e
particolarmente per i pazienti con Fibrosi Cistica
Dotati di grande versatilità metabolica e elevata resistenza ai disinfettanti a agli
antimicrobici
Capaci di formare biofilm batterico
49
di
00
50
di
00
Burkholderia pseudomallei
specie endemica nel sud-est asiatico, in India, Africa e Australia
Si riscontra nel suolo, nell’acqua e nella vegetazione
Infezione per via percutanea , causa colonizzazione asintomatica
infezioni chiamate MELIOIDOSI con forme cutanee (ascessi) e
infezioni polmonari se contratta per via inalatoria
51
di
00
Stenotrophomonas maltophilia
• Patogeno opportunista
• Ospiti preferenziali i soggetti con meccanismi di difesa
immunitaria deficitari
• Infezioni nosocomiali: batteriemie, polmoniti con elevati gradi
di complicanze e morte
• Contaminazione ospedaliera di cateteri, soluzioni disinfettanti,
apparecchiature per la ventilazione meccanica
• Intrinsecamente resistente ai carbapenemi e aminoglicosidi e
resistente agli antibiotici beta-lattamici
• Emergenza di ceppi resistenti al Trimetoprim/Sulfametossazolo
52
di
00
Acinetobacter
Sono grossi coccobacilli gram – negativi, strettamente aerobi e
ossidasi negativi
Saprofiti ubiquitari sopravvivono sia in superfici umide (es
apparecchiature per la ventilazione meccanica) sia asciutte (cute
umana)
Diffusi nel suolo, acqua, alimenti
Possono far parte della flora normale di una piccola percentuale di
persone sane e possono proliferare e divenire numerosi durante
l’ospedalizzazione
53
di
00
Acinetobacter
Genere diviso in due gruppi
Glucosio ossidanti A.baumannii (causa la maggior parte delle infezioni)
Glucosio non-ossidanti A.lwoffii
Patogeni opportunisti
In ambito nosocomiale si trasmettono per contatto diretto o indiretto
Resiste per lungo tempo nell’ambiente anche 30 giorni
Causano
Infezioni respiratorie, UTI,Infezioni di ferite
I pazienti più a rischio sono quelli che ricevono antibiotici a largo spettro, con
recente intervento chirurgico o in ventilazione respiratoria
Trattamento antibiotico difficile per A.baumannii a causa della multiresistenza agli
antibiotici inclusi i carbapenemi.
54
di
00
Diagnosi microbiologica di laboratorio dei Gram negativi
Materiale patologico
feci, sangue, urine,
tamponi rettali, altri
liquidi biologici, etc
Semina diretta in terreni
liquidi (emocolture) o
solidi (agarizzati) ricchi
(agar sangue) e
selettivi/differenziatori
(MacConkey)
Incubazione 12-24 h
a 35/37°C
Crescita batterica Scelta delle colonie su
agar
trapianto per ottenere
una coltura pura (da
materiale polimicrobico
es feci)
Identificazione a livello di specie con
metodiche convenzionali fenotipiche
(biochimiche/sierologiche)
Identificazione molecolare (PCR) o
proteomica (Malditoff)
Saggio di sensibilità agli
agenti antibatterici
55
di
00
Identificazione - scelta delle colonie
La capacità di fermentare il lattosio è considerata una delle caratteristiche
chiave nell’identificazione microbiologica degli Enterobatteri.
Agar MacConkey
Lattosio pos
Lattosio neg
56
di
00
Identificazione di specie
metodiche biochimiche convenzionali I
57
di
00
Identificazione di specie
metodiche biochimiche convenzionali automatizzate
58
di
00
Identificazione di specie
metodiche non-convenzionali
Identificazione molecolare :
PCR mediante primers specie
specifici per determinati geni
batterici
Real time PCR
Sequenziamento della subunità 16S
59
di
00
Spettrometria di massa
E’ una tecnica analitica che consente di misurare in maniera estremamente
accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di
determinare la loro identità in base al rapporto massa/carica.
Metodo rapido, accurato ed economico per l’identificazione di batteri,
micobatteri, lieviti e funghi.
Questa tecnologia costituisce un’alternativa
valida e interessante ai metodi di microbiologia classica e di biologia
molecolare ed è applicabile in differenti aree della diagnostica clinica e
della ricerca.
60
di
00
