VIRUS DELL`INFLUENZA - Sezione di Microbiologia

Facoltà di Medicina e Chirurgia
ORTHOMYXOVIRUS
Virus dell’influenza
www.microbiologia.unige.it
Prof. Oliviero E. Varnier – Dr.ssa J. McDermott
Sezione di Microbiologia – Dipartimento Interdisciplinare di Scienze Chirurgiche, di Microbiologia e dei Trapianti d’Organo (DISCMIT)
VIRUS DELL’INFLUENZA
3 tipi:

Influenzavirus A
 animali e uomo
 epidemie e pandemia

Influenzavirus B
 solo uomo
 piccole epidemie

Influenzavirus C
 solo uomo
 forme cliniche molto. lievi
Virus dell'influenza A
Generalmente specie-specifico ma alcuni ceppi possono
infettare differenti specie animali.
I ceppi che infettano gli uccelli (in particolare i migratori), il
maiale e l’uomo sono ritenuti la più importante causa di
variabilità del virus
2
VIRUS DELL’INFLUENZA
Caratteri generali
Virioni:
Sferici, oppure filamentosi (pleomorfici)
Involucro: Lipidico, contiene 2 glicoproteine HA e NA con uno strato
costituito di 2 proteine matrice M1 e M2
Genoma: RNA a polarità negativa a unico filamento segmentato
(8 segmenti in A e B, 7 in C)
Core:
Nucleoproteina associata ad ogni filamento di RNA
formando i ribonucleoproteine (RNPs)
Simmetria:
Elicoidale
Replicazione: Nucleare
3
VIRUS DELL'INFLUENZA: Morfologia
RNA a singola filamento frammentato
RNA Proteina Funzione
1
2
3
4
5
6
7
8
PB2
PB1
PA
HA
NP
NA
M1 M2
NS1 NS2
Polimerasi
Polimerasi
Polimerasi
Emoagglutinina
Nucleoproteina
Neuroaminidasi
Matrice
Proteine non
strutturali
4
VIRUS DELL'INFLUENZA: RNA
Prodotti dei segmenti genici
RNA
segmento
Proteina
Funzione
Azione
1
PB1
polimerasi
RNA-trascrittasi
2
PB2
Polimerasi
RNA-trascrittasi
3
PA
Polimerasi
RNA-trascrittasi
4
HA
emagglutinina
Adsorbimento (proteina di fusione)
5
NP
nucleoproteina
Racchiude l’RNA (nucleocapside)
6
NA
neuraminidasi
Taglia l’acido sialico e promuove il
rilascio del virus
7
M (M1-M2)
matrice
M1 - supporto per l’involucro;
partecipa al assemblaggio
e al rilascio della progenie;
M2 - favorisce il denudamento e la
produzione di HA
8
NS (NS1-NS2)
non strutturale
trasporto degli RNA genomici nel
citoplasma
5
VIRUS DELL'INFLUENZA: Morfologia
Involucro lipidico o pericapside, derivato dalla cellula
ospite, con 2 glicoproteine
Emagglutinina (HA)
Neuraminidasi (NA)
Presentano instabilità genetica
che è responsabile di
EPIDEMIE
(mutazioni minori o DRIFT)
e
PANDEMIE
(mutazioni maggiori o SHIFT)
(rapporto HA/NA circa 4-5 a 1)
6
VIRUS DELL'INFLUENZA: Emagglutinina (HA)
 Rappresenta l’antirecettore che lega il
Forma trimerica
bastoncellare
virione al recettore (acido sialico) in
seguito al taglio delle due subunità
(HA1 e HA2) con specifiche proteasi
cellulari.
 Promuove la fusione del virus con la
membrana della vescicola endocitica
 Agglutina le emazie
 Induce Ab proteggenti
 Sono note 16 diverse varietà
antigeniche (H1 – H16).
7
VIRUS DELL'INFLUENZA: Neuraminidasi (NA)
 Proteina ad attività enzimatica
 Scinde l’acido sialico presente
nelle glicoproteine del muco
(mucose respiratorie).
Forma tetramero
 Facilita il rilascio del virus dalla
superficie delle cellule infettate.
 ̀ il bersaglio dei farmaci:
 Oseltamivir (Tamiflu) e
 Zanamivir (Relenza)
 Sono note 9 varietà di
neuraminidasi (N1-N9).
8
VIRUS DELL'INFLUENZA: Classificazione

Le proteine (M1, M2 e NP) sono tipo-specifici e vengono
utilizzate per stabilire il virus TIPO (A, B o C)

I tipi A e B vengono classificati in sottotipi sulla base della
struttura antigenica delle loro glicoproteine di superficie
 16
sottotipi di HA (da H1 a H16)
 9 sottotipi di NA (da N1 a N9)

Otto sottotipi identificati nel virus dell’influenza A umano
 6 HA (H1-H3, H5, H7 e H9) e
 2 NA (N1 e N2)

Il virus di tipo C umano ha:
 1 sottotipo di HA e 1 sottotipo di NA
9
VIRUS DELL'INFLUENZA: Nomenclature
Ogni sottotipo viene definito e identificato dal:
1) Tipo
2) Luogo dell’isolamento
3) Numero di ceppo
4) Anno dell’isolamento
4) Tipo di HA e NA
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VIRUS DELL'INFLUENZA: Replicazione
Meccanismo di replicazione simile a quello di altri
virus a RNA a polarità negativa
11
VIRUS DELL'INFLUENZA: Caratteristiche
12
VIRUS DELL'INFLUENZA: Variabilità Antigenica
La variabilità genetica è comune per:
1) i virus influenzali perché

hanno un genoma di RNA segmentato.

l’RNA polimerasi non possiede attività “proof reading”
2) i virus influenzali tipo A perché

hanno un ampio spettro d’ospite
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VIRUS DELL'INFLUENZA: Variabilità Antigenica
Capacità dei virus influenzali nel mutare la specificità
antigenica delle proteine di superficie (HA - NA)
Varianti Epidemiche
Varianti Pandemiche
Drift Antigenico
Mutazioni minori
Shift Antigenico
Mutazioni maggiori
(riassortimento)
= difficoltà nel prevenire l’influenza
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VIRUS DELL'INFLUENZA: Drift Antigenico
Responsabile delle Epidemie Stagionali

Mutazioni puntiformi nei
geni che codificano le
proteine di superficie (HA e
NA)

Il nuovo ceppo è una nuova
variante virale
 correlato geneticamente alle varianti già
circolanti nella stessa
popolazione
 in grado di infettare
individui già infettati
dallo stesso sottotipo
Gli anticorpi non riconoscono HA o NA modificati
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VIRUS DELL'INFLUENZA Shift Antigenico
Responsabile delle Pandemie




Riassortimento genetico dei
geni che codificano le proteine
di superficie (HA e NA)
L’infezione contemporanea di
una cellula con due diversi
virus provocando l’inserimento
di filamenti di RNA di un virus
nel nucleocapside dell’altro.
256 possibili combinazioni degli
8 segmenti di RNA delle due
virus
Il nuovo ceppo è una nuova
virus
Antigenicamente distinto dagli altri
virus che infettano una data specie
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VIRUS DELL'INFLUENZA: Shift Antigenico
HA
NA
Tutti i sottotipi identificati nei virus degli
uccelli ma soltanto 9 nel tipo A umano
6 HA (H1-H3, H5, H7 e H9)
2 NA (N1 e N2)
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Virus Influenzale: Recettori dell’HA
L’ emoagglutinina si lega ai residui di acido sialico con un legame

α2,6-Ga nell’uomo

α2,3-Gal negli uccelli

sia α2,3-Gal che α2,6-Gal nei maiali
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Virus Influenzale: Shift Antigenico
Ospiti come il maiale possiedono i recettori per virus
di specie diverse e sono responsabili del
RIASSORTIMENTO GENICO
Virus
avario
Il maiale può essere
infettato con la stessa
efficienza sia da virus
influenzali umani sia
da ceppi aviari
Virus
umano
Riassortimento genetico
1957 H2N2 “Asian”
1968 H3N2 “Hong Kong”
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Virus Influenzale: Le Pandemie

La comparsa di un virus influenzale completamente diverso da quelli
precedenti non è di per sé sufficiente a determinare una pandemia.
Perché si generi una pandemia è necessario che:
 emerga un nuovo sottotipo virale nei confronti del quale la
popolazione non abbia un adeguato patrimonio anticorpale.
 il nuovo virus sia in grado di replicarsi nell’uomo.
 il nuovo virus sia in grado di trasmettersi efficacemente da uomo a
uomo, ovvero di creare una catena di trasmissione.
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Virus Influenzale: Le Pandemie
Riassortimento genetico: Nuova HA e/o nuova NA = NUOVA VIRUS
Nel corso dell’ultimo secolo siano avvenuti diversi shift antigenico.
Il risultato è che sono apparse tre “nuove” HA e due “nuove” NA
21
Virus Influenzale: Le Pandemie
22
Virus Influenzale: Diagnosi

Secrezioni respiratorie, nasali, tonsillari, tamponi

Test rapidi (bassa sensibilità)

Coltura in uova embrionate di pollo


Coltura in cellule di rene di cane
Madin-Darby (MDCK) = CPE dopo 2-3 gg
Coltura rapida in shell-vial e
immunofluorescenza diretta:
dopo 24-48h

Tecnica di emoadsorbimento

Ricerca anticorpi (solo a fini epidemiologici) = sieroconversione

Test immunoenzimatici: ELISA

Amplificazione genica (RT-PCR)
M 1 2 3 4 5
320 bp
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Virus dell’influenza: TERAPIA
AMANTADINA e RIMANTADINA
Inibitori dell’ingresso del virus nella cellula ospite mediante
interferenza con la proteina M2 virale (canali ionici).
Attività soltanto contro il tipo A (i ceppi H5N1 sono resistenti)
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Virus dell’influenza: TERAPIA
ZANAMIVIR (RELENZA) e OSELTAMIVIR (TAMIFLU)

Analoghi di acido sialico,
sostituzione al 4‘ OH con
un gruppo aminico o
guanidinico

Il bersaglio è il sito attivo
della proteina NA virale,
regione molto conservata,
inibendo il rilascio dei
virus dell’influenza A e B

Attività anche contro H5N1
se somministrati molto
presto
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Virus dell’influenza: VACCINI
Esistono diversi tipi di vaccini
 Il vaccino a subunità (il più utilizzato): estremamente purificato,
contiene solo le proteine necessarie a stimolare la risposta
anticorpale (HA e NA di diversi ceppi di tipo A e di tipo B) in
modo che la copertura antigenica sia più larga possibile.
Il vaccino a virus frammentati dalla disgregazione, mediante
solventi, di diversi ceppi di virus influenzali

Il vaccino virosomale costituito da particelle liposomali che nel
loro doppio strato fosfolipidico incorporano le proteine virali per
ottenere una più elevata immunogenicità.

IL FUTURO
La strategia di genetica inversa: virus ricombinanti con genoma
riassortito, derivato cioè da virus altamente patogeni e virus non
patogeni o attenuati.
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Virus dell’influenza AVIARIA
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Virus dell’influenza Aviaria H5N1
I virus dell’influenza avaria:

normalmente infettano gli uccelli e meno frequentemente i
maiali

sono tutti classificati come Virus Influenzali di Tipo A.

sono diffusi fra uccelli selvatici (l’ospite naturale)

sono altamente specie-specifici (virus H5N1) ma in rare
occasioni possono infettare un ospite diverso quale l’uomo.

H5N1 ha causato la morte di numerosi uccelli migratori.
Il virus H5N1 non deriva da riassortimento
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Virus dell’influenza Aviaria H5N1

Molto virulento



L’uomo non ha una immunità.
La prima infezione nell’uomo nel 1997

Acquisita dai polli

Nessuna trasmissione diretta uomo-uomo documentata.
Evolution di H5N1 dal 1997

I dati suggeriscono che H5N1 ha acquisito la capacità di
replicarsi nei mammiferi (probabilmente maiali).

Dal 1997 ceppi di virus dell’influenza aviaria (H5N1, H7N7
e H9N2) sono stati trasmessi all’uomo
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INFLUENZA AVARIA: H5N1 Patogenicità
La Patogenicità è basata sulle caratteristiche dell’emoagglutinina
e/o sul grado di diffusione e severità della malattia nei volatili
Esistono virus aviari:
a bassa patogenicità (LPAI) infettano le cellule epiteliali degli
appararati respiratorio ed intestinale (sottotipi da H1 a H16)
ad alta patogenicità (HPAI) infettano le cellule epiteliali di
numerosi apparati (alcuni sottotipi H5 o H7)
Sottotipi a bassa patogenicità H5 o H7
possono mutare in sottotipi ad alta patogenicità
30
Virus dell’influenza A Suino
31
Virus dell’influenza A Suino
2009 S-OIV H1N1 è un quadruplo riassortante di
due ceppi suini, un ceppo umano e un ceppo aviario
 I segmenti genici HA, NP e NS
sono di un virus suino classico,
 NA e M sono da un riassortante
suino “avian-like” Eurasian
 PB1 è da un virus H3N2 umano,
 PA e PB2 da un ceppo aviario
del Nord America
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Facoltà di Medicina e Chirurgia
PARAMYXOVIRUS
Virus Parainfluenzale
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Prof. Oliviero E. Varnier – Dr.ssa J. McDermott
Sezione di Microbiologia – Dipartimento Interdisciplinare di Scienze Chirurgiche, di Microbiologia e dei Trapianti d’Organo (DISCMIT)
Paramyoxvirus
 Alcuni di questi virus erano stati classificati nei Myxovirus
per alcuni caratteri che li accomunano ai virus influenzali
come
 l’affinità per i mucopolisaccaridi,
 la proprietà emoagglutinante e neuraminidasica e
 l’essere prevalentemente agenti infettivi dell’apparato
respiratorio.
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Paramyoxvirus
Caratteri generali
Virioni:
Sferici
Involucro: Doppio strato lipidico, con 2 glicoproteine:
 una con proprietà emagglutinante/neuraminidasica (HN);
 l’altra con attività emolitica e di fusione (proteina F).
Matrice
Uno strato proteico (M)
Genoma: RNA a polarità negativa a unico filamento non segmentato
xovirus
Core:
Nucleoproteina (NP) associata al filamento di RNA insieme
al RNA-polimerasi
Ribonucleoproteina elicoidale
La ribonucleoproteina elicoidale
dei paramyxovirus.
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Paramyoxvirus
36
Paramyxovirus
Paramyoxvirus
Alcuni di questi virus erano stati classificati nei Myxovirus per alcuni caratteri
che li accomunano ai virus influenzali come l’affinità per i mucopolisaccaridi, la
proprietà emoagglutinante e neuraminidasica e l’essere prevalentemente agenti
infettivi dell’apparato respiratorio.
-Il genoma è formato da un unico filamento di RNA a singola elica
negativa
codifica per 6-7 proteine.
Questa famiglia di virus aèpolarità
divisa
in 3chegeneri:
1)
Paramyxovirus:
-Hanno un diametro medio di 125-250 nm.
 Virus parainfluenzali
1 capside
- 4 a simmetria elicoidale.
-Hanno un
 Virus della malattia di Newcastle (aviaria)
 Virus della parotite epidemica
2) Morbillivirus: Virus del morbillo
Alcuni virus animali
3) Pneumovirus: Virus respiratorio sinciziale umano
Alcuni virus animali(bovino e topo)
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Paramyoxvirus
Struttura del genoma
 L’RN
L’RNA
virionico didi tutti
tutti i i
A
virionico
paramyxovirusconsiste
consiste
inserie
una
paramyxovirus
in una
serie lineare
di geni collegati
lineare
di geni collegati
 II geni
geni
legati
da una
sonosono
legati da
una sequenza
sequenza intergenica
altamente
intergenica
altamente conservata,
GAA.
conservata, GAA.
 I geni contenuti nei genomi virali
I geni contenuti nei genomi virali
presentanoqualche
qualche
differenza
presentano
differenza
tra tra
i
idiversi
diversigeneri,
generi,mamalelestrutture
strutturedidi
basesono
sono
identiche
base
identiche
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Paramyoxvirus
1. Adsorbimento mediante legame tra l’HN e il recettore acido sialico.
2. L’ Involucro del virus fonde con la membrana citoplasmatica, mediato dalla
glicoproteina F
3. Il virione libera nel citoplasma il nucleocapside (RNA+NP)
4. L’avvio delle sintesi macromolecolari virus specifiche avviene nel citoplasma
5. Gemmazione dei virioni neoformati
Ciclo replicativo
La glicoproteina F causa anche:
l’emolisi degli eritrociti quando il
virus si adsorbe sui globuli rossi
la
formazione dei sincizi, la
conseguenza della fusione di
cellule infette che esprimono la
proteina
F
sulla
superficie
cellulare
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VIRUS PARAINFLUENZALE (1-4)
 Danno malattie a carico delle prime vie respiratorie,
con un breve periodo di incubazione.
 Spesso presentano sintomi simili a quelli del comune
raffreddore e dell’influenza.
 Sono soprattutto malattie dell’infanzia.
 Nei bambini i virus di tipo 1 e 2 provocano nella gran
parte dei casi una laringo-tracheo-bronchite (croup) e
il tipo 3 bronchiolite e polmonite.
 Negli adulti i virus tipo 1, 3, 4 infettano la mucosa
nasofaringea causando raffreddore
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VIRUS PARAINFLUENZALE (1-4)
 Possono essere isolati dal gargarizzato o dal tampone
faringeo, mediante colture in cavità amniotica di embrioni di
pollo; possono essere coltivati in membrana allantoidea di
embrione di pollo.
 Crescono bene su linee cellulari umane e le aree citopatiche
possono essere messe in evidenza con l’adsorbimento delle
emazie o con immunofluorescenza.
 L’identificazione
si
può
fare
mediante
inibizione
dell’emoadsorbimento con sieri standard, oppure con
l’immunofluorescenza.
 Distribuiti in tutto il mondo, frequentemente danno epidemie
 Esistono vaccini preparati con virus inattivati con formalina,
che però non hanno ancora completato la sperimentazione
clinica.
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