Diapositiva 1 - Adriano Martinelli
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Fondamenti di Chimica Farmaceutica Inibizione enzimatica Cinetica enzimatica ππ π¬+πΊ ππ ππ π¬+π· π−π La reazione catalizzata dall’enzima avviene in due passaggi: • • la formazione del complesso enzima-substrato: una reazione per la quale si stabilisce un equilibrio; la formazione del prodotto: una reazione invece irreversibile, perché il prodotto viene continuamente rimosso. Cinetica enzimatica ππ π¬+πΊ ππ ππ π¬+π· π−π ES è un intermedio di reazione con bassa energia di attivazione per l’effetto catalitico dell’enzima. ES raggiunge uno stato di equilibrio dinamico e la sua concentrazione si mantiene costante nel tempo; si raggiunge così uno stato stazionario (steady state). Cinetica enzimatica L’equazione di Michaelis−Menten ππππ [πΊ] π= ππ΄ + [πΊ] La velocità dipende dalla concentrazione del substrato e, attraverso ππππ dalla quantità di enzima. ππππ è la velocità massima della reazione che viene raggiunta quando tutto l’enzima disponibile è complessato dal substrato. ππ΄ è una caratteristica dell’enzima ed è uguale alla concentrazione del substrato quando π = π/πππππ ππ΄ misura l’efficienza dell’enzima, quanto più è piccolo, tanto più l’enzima è potente. Cinetica enzimatica L’equazione di Michaelis−Menten Inibizione enzimatica I farmaci che hanno come bersagli gli enzimi in genere agiscono come inibitori. Sono molecole che inibiscono, cioè bloccano, l’enzima. Il meccanismo più comune è quello di andare ad occupare il sito catalitico, impedendo così al substrato di entrare, senza alcuna formazione di prodotti. Inibizione enzimatica I farmaci che hanno come bersagli gli enzimi in genere agiscono come inibitori. Sono molecole che inibiscono, cioè bloccano, l’enzima. Il meccanismo più comune è quello di andare ad occupare il sito catalitico, impedendo così al substrato di entrare, senza alcuna formazione di prodotti. Inibizione enzimatica Un inibitore enzimatico può essere: reversibile, quando l’inibitore si lega all’enzima attraverso forze intermolecolari non covalenti ed in questo modo il legame è reversibile; si stabilisce un equilibrio tra farmaco legato e non legato E+I EI E+I EI irreversibile, quando l’inibitore si lega all’enzima attraverso un legame covalente e blocca l’enzima permanentemente Inibizione enzimatica Gli inibitori irreversibili si legano in genere a gruppi OH (es. serine) o SH (cisteine) di residui aminoacidici dell’enzima attraverso un meccanismo di sostituzione nucleofila. In genere si cerca di evitare l’uso di inibitori irreversibili, spesso fonte di effetti collaterali non facilmente controllabili. Inibizione enzimatica IC50 Concentrazione di inibitore richiesta per ridurre del 50% l’attività dell’enzima Ki Costante dell’equilibrio: EI ο E + I EC50 Concentrazione di inibitore richiesta per ridurre del 50% l’effetto dell’enzima Inibitori competitivi Gli inibitori reversibili possono avere vari profili farmacologici: competitivi: interagiscono allo stesso sito del substrato e competono con esso, finché l’inibitore rimane ancorato al sito il substrato non può essere trasformato; non competitivi: interagiscono ad un sito allosterico, non competono con il substrato ma attraverso adattamento indotto modificano il sito catalitico ed impediscono al substrato di legarsi; incompetitivi: si legano al complesso substrato enzima una volta che esso si è formato. Inibitori competitivi In presenza di un inibitore competitivo si stabiliscono due equilibri in competizione: E+S ES E+P E+I EI E+P Il processo globale: EI + S E +S+I ES +I E + P+ I Inibitori competitivi L’inibitore competitivo può essere spiazzato aumentando il livello del substrato naturale. Inibitori competitivi L’equazione di Michaelis Menten in presenza di un inibitore competitivo diventa: ππππ [πΊ] π= π° ππ΄ (π + ) + [πΊ] ππ° kI è il rapporto tra le costanti cinetiche inversa e diretta della reazione di formazione del complesso EI Inibitori competitivi L’effetto dell’inibitore competitivo è quello di far aumentare Km come se l’enzima fosse diventato meno efficace. Grafico di Lineweaver-Burk Invertendo i due termini dell’equazione di MichaelisMenten si ottiene una relazione lineare tra 1/V e 1/[S]. Equazione di Michaelis-Menten V = Vmax [S]/([S] + KM) Grafico di Lineweaver-Burk 1/V = 1/ Vmax + KM /(Vmax [S]) Riportando in grafico 1/V vs 1/[S] si ottiene una retta di pendenza Km/Vmax, che incrocia l’asse delle ordinate al valore 1/Vmax e quello delle ascisse al valore -1/Km. Grafico di Lineweaver-Burk Inibitori non competitivi Gli inibitori non competitivi sono quelli che pur legandosi reversibilmente non competono con il substrato. L’aumento della concentrazione di substrato quindi non spiazza questo tipo di inibitori dall’enzima. Gli inibitori reversibili non competitivi sono in genere degli inibitori allosterici. Tuttavia in alcuni casi anche l’inibizione allosterica può essere competitiva. Possono essere considerati non competitivi anche tutti gli inibitori irreversibili. L’effetto dell’inibitore non competitivo è quello di impedire ad una parte di enzima di interagire con il substrato: è come se ci fosse minor quantità di enzima. Inibitori non competitivi L’equazione di Michaelis-Menten inibitore non competitivo diventa: ππππ in presenza di [πΊ] π° (π + ) ππ° π= ππ΄ + [πΊ] La presenza dell’inibitore non competitivo in pratica abbassa il valore di Vmax, lasciando invariato kM. E’ come se ci fosse meno enzima con la stessa efficacia. Inibitori non competitivi Inibitori non competitivi Inibitori incompetitivi Grafico di Lineweaver-Burk Grafico di Lineweaver-Burk Inibitori irreversibili Esempi di inibitori irreversibili sono i gas nervini, le penicilline (solo nei batteri). L’Orlistat è un inibitore irreversibile della lipasi pancreatica usato nella cura dell’obesità.
