Attività della β-galattosidasi

G1 - Immobilizzazione enzimatica e attività della β-Galattosidasi
Destinatari
Classi III, IV e V
Immobilizzazione enzimatica
Obiettivi didattici
Utilizzare β‐galattosidasi (lattasi) immobilizzata per produrre latte privo di lattosio.
Prerequisiti
Proteine, enzimi e attività enzimatica.
Descrizione
La β‐galattosidasi (lattasi) è un enzima della classe delle idrolasi che catalizza la reazione di idrolisi
del lattosio a glucosio e galattosio. Entrambi questi zuccheri sono più dolci del lattosio e risultano
anche più digeribili. E’ stato stimato che il 75% degli adulti nel mondo mostrano una diminuzione
dell’attività della lattasi nell’età adulta. Per tale motivo sul mercato sono sempre più presenti latte e
derivati privi di lattosio. In questa attività gli studenti dovranno immobilizzare l’enzima lattasi in
biglie di alginato di calcio che saranno poste in una colonna attraverso la quale verrà fatto passare il
latte. In seguito alla scissione del lattosio catalizzata dall’enzima si formerà una maggiore
concentrazione di glucosio misurabile con metodo colorimetrico. L’immobilizzazione enzimatica è
una tecnica ampiamente utilizzata sia come strumento per la ricerca di base, che per applicazioni
analitiche ed industriali. Questo protocollo permette di applicare tale tecnica all’enzima β‐
galattosidasi per ottenere un prodotto presente anche in commercio e avere una stima della
concentrazione di glucosio prodotto in seguito alla reazione di idrolisi del lattosio ad opera
dell’enzima.
Attività della β-Galattosidasi
Obiettivi didattici
Studiare la regolazione dell’attività enzimatica della β‐galattosidasi.
Prerequisiti
Struttura delle proteine, sito attivo negli enzimi, inibitori competitivi e non competitivi,
spettrofotometria e legge di Lambert Beer.
Descrizione
La β‐galattosidasi o lattasi è un enzima localizzato principalmente nella parete intestinale e
responsabile della scissione del lattosio a glucosio e galattosio. Il protocollo analizza l’attività
enzimatica della β‐galattosidasi mediante uno spettrofotometro. Come substrato dell’enzima viene
utilizzato l’ONPG (2‐Nitrophenil‐ β‐D‐Galactopyranoside), un analogo del lattosio. Tale composto è
incolore, ma in presenza dell’enzima viene idrolizzato a ortonitrofenile (ONP) (un composto dal
colore giallo) e galattosio. La velocità della reazione di idrolisi può essere calcolata allo
spettrofotometro misurando l’intensità della colorazione gialla. La velocità di reazione verrà misurata
in assenza e in presenza di sostanze che riducono l’attività dell’enzima, gli inibitori. Gli inibitori
possono impedire al substrato di entrare nel sito attivo o intralciare la reazione di catalisi dell'enzima.
Il protocollo utilizza un inibitore competitivo e uno non competitivo. Il primo tipo di inibitore si lega
in maniera reversibile al sito attivo diminuendo la quantità di enzima libero con una riduzione della
velocità alla quale avviene la reazione. Un aumento della concentrazione di substrato, aumenta la
velocità di reazione. L’inibitore non competitivo, invece, si lega ad un sito distinto da quello preposto
a legare il substrato senza interferire quindi con il legame enzima‐substrato; questo legame, tuttavia,
inattiva l’enzima perché ne cambia il sito attivo. L’inibitore non competitivo riduce la quantità di
enzima attivo abbassando di fatto la velocità di reazione. Aumenti di substrato in presenza di inibitori
non competitivi non variano la velocità di reazione.