Taglia e cuci DNA

Strumen9+per+la+manipolazione+in,vitro+del+DNA:+
!  tagliare+il+DNA+con+gli+enzimi+di+restrizione+
Gli$enzimi$di$restrizione$sono$endonucleasi+sequenza.specifiche,$
enzimi$ che$ rompono$ lo$ scheletro$ zucchero3fosfato$ del$ DNA$ in$
corrispondenza$di$specifiche$sequenze,$catalizzando$l’idrolisi+del+
legame+ fosfodiesterico$ tra$ l’ossidrile$ in$ posizione$ 3’$ di$ un$
nucleo=de$e$il$fosfato$in$posizione$5’$del$nucleo=de$adiacente.$
Generalmente$ le$ sequenze$ riconosciute$ dagli$ enzimi$ di$
restrizione$sono$delle$sequenze+(di$438$pb)+palindrome+inver9te+
sui+due+filamen9.$(Palindromo+=$di$frase,$parola$o$cifra$che$leHa$
in$senso$inverso$man=ene$immutato$il$significato;$es.$i$topi$non$
avevano$nipo=,$ingegni,$12421).$
idrolisi+
3+
5+
Gli$enzimi$di$restrizione$possono$generare:$$
• 
estremità+pia;e+(blunt)$$
$
$
$
$
• 
$
$
$
estremità+“appiccicose”+(s'cky)+
Gli$enzimi$di$restrizione$sono$sta=$scoper=$come$faHori$che$restringevano$(da$cui$il$nome)$le+possibilità+
dei+ fagi+ nell’infe;are+ i+ ba;eri;$ il$ DNA$ dei$ fagi$ viene$ infaN$ tagliato$ dagli$ enzimi$ di$ restrizione,$
impedendone$la$trascrizione$e$la$replicazione.$Il$cromosoma$baHerico,$invece,$non$viene$tagliato,$perché$
me=lato$ da$ specifici$ enzimi$ (me=lasi)$ nei$ si=$ di$ taglio$ degli$ enzimi;$ gli$ enzimi$ di$ restrizione$ non$ sono$
capaci$di$legare$(e$quindi$tagliare)$il$DNA$me=lato.$$
Ancora$oggi$gli$enzimi$di$restrizione$prendono$il$nome$dal$baHerio$da$cui$sono$sta=$isola=$(es.$HindIII$da$
Haemophilus+influenzae,$EcoRI$da$Escherichia+coli…)$
$
Gli$enzimi$di$restrizione$vengono$usa=$come$“forbici”$per$generare$frammen=$di$DNA,$deN$“frammen9+
di+ restrizione”,$ aven=$ lunghezza$ e$ sequenza$ variabili,$ ma$ estremità+ con+ + sequenza+ e+ stru;ura+
conosciuta,$dipendente$dagli$enzimi$di$restrizione$usa=.$$
$
Strumen9+per+la+manipolazione+in,vitro+del+DNA:+
!  ricucire+il+DNA+con+DNA+ligasi+
Frammen=$ di$ DNA$ anche$ di$ diversa$ origine$ ma$ aven=$
estremità$ compa=bili$ possono$ essere$ uni=$ tra$ loro$
tramite$reazioni$di$ligazione,$dando$origine$a$molecole$di$
DNA$ricombinante.$
$
$
DNA+ligasi+
L’enzima$ che$ catalizza$ questo$ =po$ di$ reazione$ è$ deHo$
DNA+ligasi.$$
$
$$
Esistono$
diverse$ DNA$ ligasi$ (che$ intervengono$ durante$ la$ duplicazione,$ la$
$
riparazione$o$la$ricombinazione$del$DNA)$aven=$però$la$stessa$funzione$fisiologica:$
$
catalizzare$la$formazione+di+legami+fosfodiesterici+tra$l’ossidrile$in$posizione$3’$di$
un$ nucleo=de$ e$ il$ fosfato$ in$ posizione$ 5’$ di$ un$ altro$ nucleo=de,$ u=lizzando$ come$
cofaHore$l’ATP.$
$