enzimi molecola -esiste -applicazioni -riescono

Metodiche analitiche
per la
l rilevazione
il
i
di mutazioni
i i
Anna Maria Eleuteri
Analisi del DNA dopo PCR
Analisi dei prodotti di amplificazione
- Elettroforesi su gel di agarosio
Metodi per lo studio di mutazioni note
- Digestione con enzimi di restrizione (RFLP)
- Amplificazione
A lifi
i
allele-specifica
ll l
ifi (ARMS)
- Ibridazione con oligonucleotidi allele specifici
Metodi per lo screening di mutazioni ignote
- Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
- Analisi dell’eteroduplex
- DHPLC
Elettroforesi su gel d’agarosio
Principio
Le molecole di DNA sono cariche negativamente
g
e migrano
g
in un
campo elettrico verso il polo positivo con velocità inversamente
proporzionali alle loro dimensioni (in paia di basi= pb).
Concentrazione
oncentraz one d
di agaros
agarosio
o (0.5
(0.5-2.0
.0 %))
Viene scelta in funzione della grandezza delle molecole da
separare: alte concentrazioni sono utilizzate per piccoli frammenti
di DNA e viceversa.
viceversa
Visualizzazione bande
Mediante etidio bromuro (intercalante degli a. nucleici, emette
fluorescenza arancio-rossa
arancio rossa quando illuminato con luce
ultravioletta).
Valutazione risultati
L grandezza
La
d
d
deii f
frammenti
ti di DNA viene
i
valutata
l t t per confronto
f
t
con marker di dimensione nota (frammenti di DNA con pb note)
che vengono fatti correre sullo stesso gel.
Elettroforesi su gel d’agarosio
Amplificati
A
lifi ti
1-3: 143 pb
4-5: 375 pb
7-9: 2000 pb
Condizioni
C
di i i sperimentali
i
t li
Gel: 2% agarosio
Tampone: tris, EDTA, borato, pH 8.4
100 V,
V 30 min
Colorazione: etidio bromuro
Digestione con enzimi di restrizione
RFLP
- Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi di origine
b tt i in
batterica
i grado
d di riconoscere
i
specifiche
ifi h sequenze di
4-8 nucleotidi e di tagliare in quelle posizioni il DNA.
• Mutazioni che aboliscono un sito di taglio
• Mutazioni che creano un nuovo sito di taglio
- Mutazioni che modificano un sito di restrizione
possono essere riconosciute direttamente mediante
elettroforesi
l tt f
id
dopo di
digestione
ti
con l’l’enzima
i
di restrizione
t i i
appropriato.
Digestione con enzimi di restrizione
RFLP
Amplificazione DNA (PCR)
Digestione
g
dell’amplificato
p
con enzima di restrizione
creazione /abolizione sito di taglio
frammentazione anomala
Elettroforesi su gel di agarosio
colorazione con etidio bromuro
Pattern di frammenti caratteristici
creazione sito di taglio: + 1 banda
abolizione sito di taglio: - 1 banda
Digestione con enzimi di restrizione
RFLP
Digestione con enzimi di restrizione
RFLP
Amplificazione alleleallele-specifica
PCRPCR
-ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
- Prevede una reazione polimerasica a catena in cui uno dei due
primer è costruito in modo che il nucleotide in posizione 3’ sia
complementare alla sequenza mutata del gene o a quella
normale.
l Ill DNA
DN non viene amplificato
lf
quando
d si usa ill primer
non perfettamente complementare alla sequenza in esame,
poiché la Taq
p
q polimerasi
p
non riesce ad esplicare
p
l’estensione
del primer.
A: primer normale
B: primer mutato
Normale:
l amplificato
lf
solo
l con A
Mutato omo: amplificato solo con B
Mutato etero: amplificato con A e B
- La presenza degli amplificati viene evidenziata mediante
elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con bromuro di
etidio.
Amplificazione alleleallele-specifica
ARMS
Esempio
p di diagnosi
g
mediante ARMS
DNA amplificato con primers mutati per la mutazione β-talassemica
IVS 1 che generano un frammento di amplificazione di 407 pb
407pb
• La comparsa della banda di amplificazione a 407 pb indica la positività
per la mutazione.
• C = frammento di controllo che indica il buon funzionamento della
reazione.
Ibridazione con oligonucleotidi allele
allele-specifici
ASO probe
b
- La presenza di una mutazione viene riconosciuta facendo reagire
il DNA amplificato con sonde oligonucleotidiche complementari
alla sequenza
q
mutata o normale ((separatamente).
p
)
- Solo in presenza del 100% di complementarietà tra le sequenze
si avrà l’ibridazione della sonda con il DNA.
- Le sonde sono, in genere, 15-17omeri, con un contenuto in GC del
30-50% ed il nucleotide discriminante localizzato nel mezzo.
L ttecnica
La
i viene
i
realizzata
li
t mediante:
di t
1. Dot blot
2 Reverse
2.
R
dot
d t bl
blott
1. Dot blot
Amplificazione DNA
D n tu
Denaturazione
i n
Immobilizzazione DNA su filtro
nylon/cellulosa
+
Oligonucleotidi di sintesi marcati (32P,
b
biotina)
) complementari
l
sequenza normale
l
e mutata
Ibridazione con la sequenza
complementare di DNA
Esposizione filtro a lastra radiografica
Autoradiografia
Se la reazione di ibridazione è avvenuta si avrà la comparsa di una macchia
1 macchia
m
hi con
n oligo
li mutato:
mut t : omozigote
m i t p
per la
l mutazione
mut i n
1 macchia con oligo normale: normale
2 macchie con oligo normale e mutato: eterozigote per la mutazione
1. Dot blot
Amplificazione
Dot blot
Ibridazione con sonda
Rilevazione
1. Isolamento
2. Marcatura
2. Reverse dot blot (RDB)
Esempio
p di test per
p la rilevazione di
mutazioni del gene CFTR
Single strand conformation polymorphism (SSCP)
E’ basato sulla differenza di mobilità elettroforetica tra DNA mutato a
singolo filamento rispetto a quello non mutato
Single strand conformation polymorphism (SSCP)
- Le mobilità elettroforetiche delle specie di DNA a singolo filamento sono
funzione della loro conformazione tridimensionale.
- La conformazione è determinata dall’appaiamento intra-filamento
termodinamicamente più favorito
- Questa è direttamente correlata alla sequenza primaria
- Se due frammenti di DNA differiscono in sequenza assumeranno
conformazioni differenti
- differente mobilità elettroforetica
Single strand conformation polymorphism (SSCP)
Per prevenire il reannealing dei due filamenti singoli, la concentrazione di
DNA nel tampone di caricamento viene mantenuta molto bassa.
Per visualizzare le bande si ricorre alla marcatura radioattiva del DNA.
In alternativa il silver staining assicura adeguata sensibilità ed è sempre
più utilizzato.
La sensibilità è influenzata da molti fattori:
- il tipo di sostituzione
- il contenuto in G+C
- la
a pos
posizione
z on della
a mutaz
mutazione
on in
n rrelazione
az on a
alle estremità
str m tà del frammento
framm nto
- la lunghezza del frammento esaminato
E’ stato dimostrato un effetto p
pronunciato della lunghezza
g
del
frammento sulla sensibilità:
- con frammenti di lunghezza intorno a 100-150 bp, la sensibilità è di
circa il 100%.
- considerando lunghezze intorno a 500 bp, la sensibilità si abbassa a
circa il 50%.
Single strand conformation polymorphism (SSCP)
Analisi SSCP dell’esone 8 del gene p53 da quattro linee cellulari di
carcinoma mammario.
Corsia 1: controllo wild-type
Corsia 2: cellule MDA-MB-231
Corsia 3: cellule MDA-MB-468
Corsia 4: cellule Bt-474
Corsia 5: cellule SkBr3.
Le linee cellulari nelle corsie 2-4
contengono mutazioni nell’esone 8
risultanti
i lt ti iin migrazioni
i
i i aberranti
b
ti
dei prodotti di PCR
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
E’ basata sul differente comportamento di denaturazione del DNA
mutato rispetto
p
a quello
q
normale.
Presenza di una mutazione
Alterazione delle caratteristiche di
denaturazione del dsDNA
Diversa mobilità
Di
bilità elettroforetica
l tt f
ti
su gel denaturante
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Principio del metodo: la DENATURAZIONE del DNA, sia con calore
che con denaturanti (ioni idrossido, urea o formamide) non avviene in un
unico step
il DNA denatura
d
t
in
i domini
d i i
Aumento di T o [denaturante]: la regione o dominio con il più alto
contenuto in A+T denaturerà
Ulteriore aumento di T o [denaturante]: il dominio con un contenuto in
A+T più alto del precedente denaturerà
Il processo va avanti fino a quando la regione con il più alto contenuto in
G+C denaturerà ed ill DNA sarà completamente a singolo
G
s ngolo filamento.
f lamento.
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
L’identità dei domini di denaturazione è in funzione della sequenza
Una mutazione cambierà il profilo di denaturazione
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
-A basse concentrazioni di denaturante il DNA migra come molecola a
doppia elica in funzione delle sue dimensioni.
- Raggiunta la zona del gel a concentrazione di denaturante uguale al suo
punto di denaturazione (Tm), il DNA assume una conformazione
ramificata (parziale apertura della doppia elica) e rallenta la sua
velocità di migrazione.
- La presenza di una mutazione può alterare il Tm del frammento
di DNA e di conseguenza la sua mobilità.
La variazione
ar az on n
nella
a Tm
m può essere
ss r valutata
a utata su g
gel con gradiente
gra nt di
denaturante.
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Amplificazione del DNA (PCR)
Elettroforesi
El
f
su gell di
d acrilammide
l
d denaturante
d
gradiente di urea/formamide
Il DNA mutato
t t h
ha caratteristiche
tt i ti h di d
denaturazione
t
i
diff
differenti
ti rispetto
i
tt all
normale e può essere distinto sulla base della sua diversa mobilità
Analisi di mutazioni a carico degli esoni 13 e 11 del gene CFTR.
Corsie 1, 2, 4, 5: DNA wild type
C
Corsia
3:
3 eterozigosi per la
l mutazione E822X
Corsia 6: eterozigosi per la mutazione G542X
Formazione di molecole eteroduplici
Viene effettuata per aumentare il potere di risoluzione della DGGE
quando la migrazione del DNA mutato è simile a quello del normale.
L’
L’amplificato
lifi
viene
i
d
denaturato e poii sottoposto ad
d un llento processo di
riappaiamento.
Q st condizioni
Queste
di i i f
favoriscono
is
lla formazione
f m i
di eteroduplici.
t
d li i
Molecole omoduplici
Dovute all’appaiamento
tra i due filamenti
normali e tra i due
filamenti mutati
Molecole eteroduplici
p
Dovute all’appaiamento
di un filamento
normale con uno
mutato
• Normale od omozigote: formazione di un’unica molecola omoduplex
• Eterozigote: formazione di 4 molecole
2 omoduplex
m d pl x ((riappaiamento
i pp i m nt d
deii 2 fil
filamenti
m nti n
normali
m li e m
mutati)
t ti)
2 eteroduplex (formati dalle due combinazioni possibili tra due filamenti normali
e due mutati)
Formazione di molecole eteroduplici
Nell analisi degli eteroduplex
Nell’analisi
eteroduplex,
le mutazioni vengono rilevate
grazie alle perturbazioni
strutturali indotte dalla
presenza di mismatch nel
duplex di DNA.
Formazione di molecole eteroduplici
AA: normale
Aa: eterozigote per la mutazione
aa: omozigote
Gli eteroduplex migrano
sempre più lentamente dei
corrispondenti omoduplex
in quanto il misappaiamento
in essi contenuto determina
un effetto destabilizzante
nella molecola che si aprirà
p
più facilmente qualora
sottoposta a denaturazione
Urea bassa conc.
Urea alta conc.
HPLC in fase inversa (RP(RP-HPLC)
E’ basato sul p
principio
p della ripartizione
p
in fase inversa e separa
p
i
frammenti di DNA sulla base delle loro dimensioni.
• Colonna C18: fase stazionaria a base polimerica (stirenedivenilbenzene)
derivatizzata con catene alchiliche a 18 atomi di carbonio.
Ha caratteristiche idrofobiche.
• Fase
F
mobile:
bil contiene
ti
solvente
l
t organico
i ((acetonitrile)
t it il ) e un accoppiante
i t
ionico (TEAA, trietilammonioacetato).
• Eluizione:
Eluizi ne: mediante
medi nte gradiente
r diente di acetonitrile.
cet nitrile L’
L acetonitrile
cet nitrile rompe
r mpe il
legame TEAA-DNA consentendone l’eluizione.
I frammenti più corti (minor numero di legami DNA-TEAA) vengono eluiti
prima rispetto ai frammenti più lunghi che richiedono
richiedono, per essere eluiti
eluiti,
una maggiore percentuale di acetonitrile nella fase mobile.
Interazione tra fase stazionaria e DNA
La fase stazionaria (C18)
è neutra ed idrofobica.
L’agente accoppiante (TEAA)
è una molecola bifunzionale
con un’estremità idrofobica
ed
d una polare
l
con carica
i
Positiva (gruppi ammonio).
Il TEAA, con i suoi gruppi
ammonio si lega al DNA (carico
negativamente) e con la catena
alchilica interagisce con la
superficie idrofobica della
C18 facendo da ponte
C18,
ponte.
Separazione di frammenti di DNA in RPRP-HPLC
HPLC denaturante (D(D-HPLC)
La sseparazione
L
p
i n viene
i n effettuata
ff tt t in condizioni
ndi i ni p
parzialmente
i lm nt d
denaturanti,
n t
nti
cioè termostatando la colonna ad una determinata temperatura (temp di
quasi denaturazione). In presenza di una mutazione la denaturazione e
ll’eluizione
eluizione del frammento sarà diversa rispetto al non mutato.
mutato
Alla temp di quasi denaturazione gli
eteroduplici mostrano una parziale
denaturazione in corrispondenza del
misappaiamento mentre gli omoduplici,
alla stessa temperatura, sono ancora
nella forma di doppia elica.
Gli eteroduplici hanno un comportamento cromatografico diverso rispetto
all’omoduplice non mutato e generalmente vengono eluiti più rapidamente.
La presenza di una mutazione si evidenzia con la comparsa nel
cromatogramma di picchi supplementari rispetto al normale.
HPLC denaturante (D(D-HPLC)
P
Procedura
d
:
-Amplificazione di DNA wild-type e mutato
- Miscela dei due amplificati
p
in rapporto
pp
1:1
- Denaturazione degli amplificati per 3 minuti a 95°C
- Riappaiamento per 30 minuti, raffreddando il campione da 95 a 65°C.
In presenza di mutazione si avrà la formazione di homo ed eteroduplex.
Il mismatch presente negli eteroduplex causa una minore ritenzione
Gli eteroduplex eluiscono prima degli homoduplex
HPLC denaturante (D(D-HPLC)
Cromatogrammi di un campione eterozigote per una mutazione ottenuti a
diverse temperature. Si nota la differente risoluzione degli eteroduplici
in base alla temperatura.
temperatura