Metodica

COLINESTERASI LIOFILO (BTC+DTNB) e NUMERO
di DIBUCAINA
DETERMINAZIONE COLORIMETRICA CINETICA IN SIERO E PLASMA
METODO BUTIRRILTIOCOLINA (BTC) E AC. DITIOBISNITROBENZOICO (DTNB)
For in vitro diagnostic use only
Kit:
18 x 3 ml
Cod. 90009970
SIGNIFICATO DIAGNOSTICO
I livelli di Colinesterasi nel siero sono utili per valutare la funzionalità
del fegato, come indicatore di avvelenamento (insetticidi), per il
controllo dei pazienti con forme atipiche dell’enzima. Si osserva una
diminuzione dell’enzima in caso di epatiti acute, cirrosi e carcinoma,
nelle infezioni acute e nella distrofia muscolare.
Una grave inibizione della funzionalità si osserva in presenza di
composti di fosforo organico che danno un forte avvelenamento.
Alcuni farmaci usati in chirurgia come rilassanti muscolari sono
metabolizzati così come i substrati della Colinesterasi, in condizioni
di basso livello di Colinesterasi o di varianti atipiche dell’enzima, i
pazienti possono andare incontro a periodi prolungati di apnea. Lo
screening preoperatorio è utile per identificare pazienti che possono
presentare complicazioni.
PRINCIPIO
La colinesterasi presente nel siero catalizza l’idrolisi della
butirriltiocolina (BTC), formando butirrato e tiocolina. La tiocolina
reagisce con l’ac. ditiobisnitrobenzoico (DTNB) originando un
composto colorato.
L’ incremento di assorbanza nell’unità di tempo a 405 nm è
proporzionale alla attività della colinesterasi nel campione.
PRINCIPIO DIBUCAINA
La determinazione della attività Colinesterasica Totale ed Inibita
permette di separare le differenti varianti genetiche dell'enzima.
Viene generato un indice chiamato NUMERO di DIBUCAINA (N.D.),
in grado di selezionare la popolazione in:
Omozigote Normale (genotipo normale)
Eterozigote (genotipi normale ed atipico)
Omozigote (genotipo atipico)
SOLO i genotipi normali appaiono fortemente inibiti dalla Dibucaina.
REAGENTI
Componenti del kit:
Cod. 90009970
*REAGENTE 1 (liquido)
1 x 60 ml
Buffer pirofosfato >20 mmol/L pH 7.7
*REAGENTE 2 (liofilo)
18 x 3 ml
DTNB 0.25 mmol/L
*REAGENTE 3 (liofilo)
3 x 1 ml
BTC
7 mmol/L
*REAGENTE 4 (liquido)
1 x 3 ml
Dibucaina 0,11 mmol/L
STABILITA’: se conservati a 2-8°C, i reagenti sono stabili fino alla
data di scadenza mostrata sulla confezione, se non contaminati
durante l’impiego.
REAGENTI AUSILIARI PER LA CALIBRAZIONE E PER IL
CONTROLLO QUALITA’ DELLA COLINESTERASI
(Non forniti con il kit)
Si suggerisce caldamente di verificare l’esattezza del fattore
utilizzato mediante Calibrazione preventiva. Va assolutamente
utilizzato il fattore che viene originato da queste prove in
sostituzione del fattore teorico inserito in metodica.
Per garantire l’ adeguata Calibrazione, si suggerisce di usare il
seguente kit:
- Calibratore
Cod. 90010000
Per garantire l’adeguata prestazione del test, si suggeriscono i
seguenti kit:
- Serum N
Cod. 90009980
- Serum P
Cod. 90009990
COLINESTERASI - PREP. DEL REAGENTE DI LAVORO
PREPARAZIONE DEL SUBSTRATO:
-Aggiungere ad un vial di *Reagente 2 3 ml di *Reagente 1.
Mescolare gentilmente sino a dissoluzione.
-Aggiungere ad un vial di *Reagente 3 1 ml di *Reagente 1.
Mescolare gentilmente sino a dissoluzione.
STABILITA’: i Substrati ricostituiti sono stabili 4 settimane a
2-8°C, se non contaminati durante l’uso.
PREPARAZIONE DEL MONOREAGENTE:
Aggiungere ad un vial di *Reagente 2 ricostituito 0.1 ml
di *Reagente 3. Mescolare gentilmente sino a miscelazione.
STABILITA’: i Monoreagenti sono stabili 1 ora a 2-8°C od a temp.
ambiente, se non contaminati durante l’uso.
N. DI DIBUCAINA - PREP. DEL REAGENTE DI LAVORO
PREPARAZIONE DEL SUBSTRATO:
Aggiungere ad un vial di Cod. 90009970 *REAGENTE 2
(liofilo)(DTNB) 2.8 mL di *REAGENTE 1 (liquido)(Buffer); aggiungere
quindi 0.200 mL di *REAGENTE 4 (liquido)(Dibucaina).
Miscelare gentilmente sino a dissoluzione.
Siglare il vial con la dicitura "DIBUCAINA".
STABILITA’: i Substrati ricostituiti sono stabili 4 settimane a
2-8°C, se non contaminati durante l’uso.
PREPARAZIONE DEL MONOREAGENTE:
Aggiungere ad un vial di *Reagente 2 ricostituito 0.1 ml
di *Reagente 3. Mescolare gentilmente sino a miscelazione.
STABILITA’: i Monoreagenti sono stabili 1 ora a 2-8°C od a temp.
ambiente, se non contaminati durante l’uso.
Portare i reagenti alla temperatura di lavoro prima dell’uso.
Chiudere immediatamente dopo l’impiego.
I prodotti vanno manipolati in modo adeguato, tale da evitare
ogni contaminazione. L’uso non competente ci solleverà da
ogni responsabilità.
CAMPIONI per COLINESTERASI TOTALE e INIBITA da
DIBUCAINA
• Siero, plasma con eparina o EDTA non emolizzati.
PROCEDURA ANALITICA per ATTIVITA’ TOTALE e
INIBITA da DIBUCAINA
• Wavelenght:
• Cammino ottico:
• Lettura:
• Temperatura:
• Metodo:
• Reazione:
• Linearità:
• Campione/Reagente:
405 nm
1 cm
contro aria o acqua distillata
25-30-37°C
cinetico
90 secondi
fino a 9000 U/L
1/150
Portare i reagenti alla temperatura di lavoro prima dell’uso.
Pipettare in una provetta o in una cuvetta etichettata:
Monoreagente
1500 μl
Campione
10 μl
Leggere subito l’assorbanza iniziale contro aria o acqua dist. e
ripetere le letture per almeno 3 volte ad intervalli di 30 secondi.
Calcolare la media di (ΔA/30 sec.).
CALCOLO
Mettere il ΔA/30 sec. trovato nella seguente formula:
Colinesterasi (U/L) = ΔA/ 30sec. x 22710
CALCOLO DEL NUMERO DI DIBUCAINA (N.D.)
Determinare per ogni CAMPIONE l'attività COLINESTERASI Totale
ed Inibita da DIBUCAINA.
Applicare i valori trovati nella seguente formula:
N.D. = 100 - [(Attività Inibita/Attività Totale) x 100]
Essendo un numero, N.D. non ha unità di misura.
VALORI DI RIFERIMENTO per COLINESTERASI TOTALE
37°C
4700 -14000
U/L
30°C
3600 - 11200
25°C
3000 - 9000
Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca I propri valori normali
di riferimento per l’area geografica in cui si trova.
VALORI DI RIFERIMENTO per NUMERO DI DIBUCAINA
Omozigote Normale (genotipo normale)
N.D. >60
Eterozigote (genotipi normale ed atipico)
N.D. 25 - 60
Omozigote (genotipo atipico)
N.D. <25
determinazione manuale, ma anche tra loro,per i diversi
Analizzatori.
6. Il Reagente deve essere impiegato SOLO per l’uso indicato, da
personale esperto e addestrato nelle dovute condizioni di
laboratorio.
7. La diagnosi clinica non può essere fatta correttamente usando il
risultato di un solo test, ma deve essere fatta integrando
criticamente i diversi tests di Laboratorio con differenti dati clinici.
Ver. 2003/12
Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca i propri valori normali
di riferimento per l’area geografica in cui si trova.
CARATTERISTICHE METROLOGICHE
Queste caratteristiche metrologiche sono state sperimentate con un
fotometro per chimica clinica SLIM. I dati pur rappresentando le
caratteristiche del prodotto, potrebbero risultare differenti da questi
nei singoli laboratori e/o per differenti analizzatori.
Linearità:
la Colinesterasi può essere determinata tra
100 – 9000 U/L.
Per concentrazioni ≥ 9000 U/L, diluire il
campione
1:5 con sol. saline, ritestare e moltiplicare il
risultato x 5.
Sensibilità:
La minima quantità determinabile è 100 U/L.
Precisione nella serie (Within-run):
CV %
Media (U/L) ± 2s
Serum 1
6873,4 ± 168,9
1,23
Serum 2
6841,1 ± 124,8
0,91
Precisione tra le serie Run-to-run (Day-to-day):
Media (U/L) ± 2s
CV %
Serum 1
6557,6 ± 652,0
4,97
Serum 2
6543,8 ± 617,7
4,72
Accuratezza:
Control 1
con materiali di controllo commerciali
Attesa (U/L)
Trovata (U/L)
4650 (3813 - 5487)
4383-4501-4629
interferenze:
Vedi bibliografia punto 2.
correlazione:
Un gruppo di 20 sieri è stato verificato su SLIM
da questa procedura e usare un Cholinesterase
Reagent commercialmente disponibile.
Il confronto dei test ha dato i seguenti risultati:
Equazione di regressione lineare
Coefficiente di correlazione
y = 1,0227x - 299
r = 0,9977
NOTE
1. Una variazione proporzionale dei volumi di reazione non modifica
il risultato.
2.Si suggerisce di NON miscelare tra loro Reagenti provenienti da
diversi Lotti di Produzione.
3. Per attività più elevate di 9000 U/L (ΔA/ 30sec. > 0.400), diluire
il campione 1:4 con soluzione fisiologica, ripetendo la
determinazione e moltiplicando il risultato x 4.
4. Elevata attenzione deve essere data alle sostanze interferenti: alcuni
farmaci e altre sostanze potrebbero influenzare i livelli di Colinesterasi
(vedi Bibliografia 2)
5. ATTENZIONE!
Le applicazioni sugli Analizzatori/strumenti di routine possono
essere totalmente differenti da quanto sviluppato come
SEAC SRL
Via di Prato, 74
50041 Calenzano-FI
Tel. 055 8877469
Fax 055 8877771