Marcatori epatici virali - Ospedali riuniti di Trieste

RUOLO DEL LABORATORIO NELLA VALUTAZIONE DELLA FUNZIONE EPATICA
G. Pozzato
S.C. Ematologia Clinica, DAI Oncologia; AOUTS Ospedali Riunti di Trieste
Il laboratorio ha da sempre svolto un ruolo importante nella diagnostica delle malattie epatiche. Da
quando sono nati i laboratori di chimica clinica sono stati proposti molti test per la valutazione dello stato di
salute del fegato denominati in modo improprio come “test di funzione epatica”; improprio in quanto i veri
e propri test per la reale quantizzazione della “funzione” ovvero della massa epatica funzionante, quali la
velocità di eliminazione del galattosio, o la clearance dei sali biliari o infine l’aminopyrine breath test, sono
lunghi, costosi in termini di personale e di materiali, e infine scomodi da praticare e pertanto utilizzati
esclusivamente a scopi di ricerca clinica.
La maggior parte dei Laboratori pertanto, per valutare la funzione epatica esegue una piccola batteria di
esami che sono:
Bilirubina totale e bilirubina diretta
Aspartato-aminotransferasi (AST)
Alanina-aminotransferasi (ALT)
Fosfatasi alcalina (ALP)
Gamma-glutamil-transferasi (GGT)
Altri esami, peraltro utilissimi per la valutazione della severità della malattia epatica, quali il tempo
di protrombina o l’albumina sierica non vengono di solito considerati come “test di funzione epatica”. I test
sopra indicati, a parte l’ALT, non sono specifici per le malattie del fegato e possono essere alterati per
processi che avvengono in altre sedi dell’organismo. Per questo motivo è necessario interpretare i dati
forniti dal laboratorio conoscendone sia l’utilità che i limiti.
•
Bilirubina totale bilirubina e diretta
E’ noto che la bilirubina deriva dalla distruzione della molecola di Eme che costituisce la parte non
proteica dell’emoglobina. Dunque la cinetica di distruzione dei globuli rossi (GR) e il metabolismo epatico
sono strettamente correlati. I GR vengono distrutti prevalentemente nella milza e nel midollo emopoietico
da pare di macrofagi e monociti. La bilirubina prodotta nella milza o nel midollo emopoietico viene
immessa nel plasma coniugata con l’albumina e come tale viene captata dal fegato in modo altamente
efficiente. Una volta all’interno del fegato la bilirubina va incontro a un processo di glucuronazione ad
opera di potenti UDP-glucuronosil-transferasi e come tale viene eliminata nella bile. I termini “diretta” e
“indiretta” sono antichissimi e derivano dal fatto che un tempo (studi pubblicati nel 1916) una parte della
bilirubina reagiva “direttamente” con il reagente di Ehrlich (la parte coniugata) mentre una parte doveva
essere prima trattata con alcool per colorarsi col medesimo reagente (dunque indiretta ovvero quella non
coniugata). La maggior parte dei laboratori dosa la bilirubina totale e quella diretta, mentre la parte
indiretta viene calcolata per semplice differenza matematica. Vi sono metodiche in HPLC in grado di
misurare la bilirubina indiretta in modo quantitativo, ma per motivi di costo e di praticità tali metodiche
sono prerogativa dei laboratori di ricerca.
Il range normale della bilirubina totale è tra 0,1 e 0,9 mg/dl (1,7 – 15 mol/L). Dal momento che la
produzione di bilirubina dipende dalla velocità di distruzione dei GR, è evidente che un innalzamento della
bilirubina indiretta in assenza di ulteriori alterazioni degli indici di funzione epatica farà pensare a un
accelerato turnover dei GR piuttosto che malattie specifiche del fegato. Quando la bilirubina totale si
innalza oltre 4,0 mg/dl (70 micromol/L) in presenza di alterazione degli altri indici di funzione epatica, una
malattia di fegato è del tutto verosimile.
Le principali cause di iperbilirubinemia sono indicate nella tabella 1.
Tabella 1
CAUSE DI IPERBILIRUBINEMIA
NON CONIUGATA (INDIRETTA)
CONIUGATA (DIRETTA)
Cause congenite
Cause congenite
Gilbert’s syndrome
Dubin-Johnson syndrome
Crigler-Najjar syndrome
Rotor syndrome
Cause acquisite
Cause acquisite
Disordini ematologici di natura emolitica
Malattie epatiche (cirrosi, neoplasie, epatiti)
Emopoiesi inefficace
Ostruzione vie biliari intra-epatiche
(colangite sclerosante, cirrosi biliare, etc.)
Ostruzione vie biliari extra-epatiche
(calcolosi via biliare, neoplasie, atresie, etc.)
Ittero fisiologico del neonato
Come indicato vi sono anche cause congenite ed ereditarie di iperbilirubinemia; tali patologie
compariranno evidentemente durante l’infanzia se non dopo i primi giorni di vita, fatta eccezione per la
sindrome di Gilbert che in genere si manifesta dopo la pubertà. Valori estremi di bilirubina (>70 mg/dl) si
vedono esclusivamente per insufficienza epatica acuta (ad esempio da intossicazione da Ammanita
falloides). Data la fondamentale differenza tra iperbilirubinemie indirette (generalmente correlate a
patologie ematologiche) e quelle dirette (correlate a patologie epatiche o delle vie biliari), è della massima
importanza che il laboratorio, anche in urgenza, fornisca il dosaggio della bilirubina frazionata.
•
Aspartato amino-transferasi (AST)
Questo enzima catalizza una reazione tra aspartato e alfa-ossiglutarato per dare glutamato e
ossaloacetato. Questo enzima si trova in alta concentrazione all’interno delle cellule epatiche, ma anche nel
muscolo scheletrico, nel muscolo cardiaco, nel rene, nel pancreas e nei GR. Valori elevati indicano la
presenza di necrosi cellulare. Non vi è modo di individuare la provenienza dell’enzima neppure con
metodiche sofisticate, la determinazione dell’AST è pertanto del tutto aspecifica e il riscontro di elevati
valori nel siero deve essere confrontato con il quadro clinico e laboratoristico del paziente.
•
Alanino amino-transferasi (ALT)
Questo enzima catalizza la reazione tra alanina e ossiglutarato per dare piruvato e glutamato. Al
contrario delle AST, questo enzima si trova quasi esclusivamente nelle cellule epatiche dove è confinato nel
citoplasma. Elevati valori di ALT sono pertanto indicativi di necrosi di cellule epatiche, anche se modesti
aumenti sono stati verificati in corso di malattie del muscolo come la distrofia di Duchenne. Sebbene
specifiche per il fegato, i livelli di ALT non forniscono informazioni sulla natura del danno epatico in quanto
sono elevate sia nelle forme epatitiche di natura virale così come nell’ittero colestatico, nelle steatosi o nel
danno epatico da farmaci. Livelli di ALT superiori a 200 volte la norma sono quasi sempre indicativi di una
forma virale acuta. Alterati livelli di ALT si riscontrano anche nell’insufficienza ventricolare sinistra acuta o
nello shock ma in questi casi il quadro laboratoristico è facilmente giustificato dall’esplicita situazione
clinica. D’altra parte è ben noto che malattie di fegato avanzate come la cirrosi sia su base alcolica che di
natura virale possono presentare normali livelli di ALT e parimenti di AST per anni se non per decenni.
•
Fosfatasi alcalina (ALP)
La fosfatasi alcalina è un zinco-metallo-enzima che rilascia fosfato inorganico da una serie di
ortofosfati organici. La ALP si trova nel fegato, dove è localizzata nei microvilli dei canalicoli biliari e sulla
superficie sinusoidale degli epatociti, ma grandi quantità di questo enzima si trovano anche nell’osso, nel
rene, nella placenta e nell’intestino. L’organo di provenienza può essere individuato per la presenza di
differenti isoenzimi specifici per ogni tessuto. L’attività totale di ALP nel siero è costituita esclusivamente
dalla forma epatica e ossea. E’ possibile distinguere l’attività dei due enzimi sulla base della sensibilità al
calore (la forma epatica è più stabile rispetto a quella ossea) ma tale metodica è stata pressoché
abbandonata per lasciare il passo a una più fine differenziazione basata sugli anticorpi monoclonali. Da
oltre 50 anni è noto che elevati valori di ALP si riscontrano in corso di ostruzione delle vie biliari sia extraepatiche (calcolosi delle via biliare principale, stenosi coledoco etc.) che intra-epatiche (ad es. colangite
sclerosante). Moderati incrementi della ALP sono riscontrabili anche nelle forme epatitiche acute e
croniche o nelle patologie neoplastiche epatiche sia primitive che secondarie. Elevati livelli di ALP si
riscontrano anche in corso di malattie ematologiche con infiltrazione del fegato quali le sindromi
mieloproliferative croniche in particolare nelle mielofibrosi primitive o secondarie.
•
Gamma glutamil-transferasi (GGT)
La GGT è un enzima legato alle membrane che trasferisce gruppi gamma-glutaminici da peptidi
(specialmente glutatione) ad amino-acidi, acqua o altri peptidi. Anche questo enzima è rintracciabile in
molti organi oltre al fegato quali pancreas, rene, prostata e intestino. Sono stati descritti numerosi
isoenzimi che però non forniscono localizzazione d’organo. Dal momento che il dosaggio nel siero dipende
quasi esclusivamente dalla componente epatica è un indice sicuro di patologie primitive del fegato. Anche
la GGT viene considerata un indice di colestasi, ma non così specifico come la fosfatasi alcalina. In effetti, la
GGT risulta elevata in tutte la malattie epatiche indipendentemente dall’eziologia e pertanto è di poco
valore nella differenziazione eziologica, anche se i valori più elevati di GGT (oltre 20 volte il valore limite)
sono riscontrati nelle colestasi da ostruzione biliare o nelle neoplasie epatiche (sia primitive che
secondarie). Come elemento parzialmente confondente, da segnalare che elevati valori di GGT possono
essere secondari a induzione enzimatica, come si verifica dopo l’assunzione di farmaci quali barbiturici,
fentoina ed altri anti-convulsivanti. Isolati livelli di GGT senza ulteriori modificazioni degli altri indici di
funzione epatica, richiederanno dunque un’anamnesi farmacologica del paziente. Un meccanismo di
induzione enzimatica viene invocato anche per spiegare la correlazione tra elevati livelli di GGT e abuso
alcolico. Non esiste una correlazione lineare tra quantità di alcol e livelli di GGT anche in quanto alla
sospensione dell’introito alcolico, dopo una iniziale diminuzione, la GGT può rimanere elevata indicando
pertanto più il danno epatico sottostante che l’assunzione di alcol. Sfortunatamente un terzo degli etilisti
cronici non presenta alcuna alterazione della GGT o degli altri indici di funzione epatica e pertanto la GGT è
di poco utilità nel follow-up dei soggetti etilisti in assenza di malattia cronica di fegato. Da ultimo è
doveroso segnalare che i livelli di GGT sono sensibili alla quantità di ormoni steroidi circolanti, per tale
motivo le donne tendono ad avere livelli di GGT molti più bassi dei maschi. Per lo stesso motivo, durante la
gravidanza, la GGT tende ad essere normale o appena aumentata anche in corso di colestasi o di altre
patologie epatiche.
DIAGNOSTICA DELLE EPATITI VIRALI
Molti virus sono in grado di infettare il fegato determinando epatiti acute e croniche. Al di là dei
sofisticati test sierologici e di biologia molecolare oggi a disposizione, non bisogna mai dimenticare le clinica
che può rapidamente indirizzare verso l’agente eziologico. Ad esempio sarà evidente che in presenza di
febbre, adenopatie multiple, splenomegalia e linfomonocitosi, la diagnosi di infezione da EBV sarà
verosimile e pertanto, pur in presenza di elevati livelli di ALT e AST, risulterà inutile far eseguire la ricerca
dell’infezione da altri virus epatitici. Dal momento che una parte dei virus epatitici si trasmette per via
parenterale e una parte per via oro-fecale, un’attenta anamnesi sull’eventuale esposizione del paziente
renderà spesso la diagnosi molto agevole. Bisogna inoltre separare subito gli esami da effettuare nel caso si
sospetti un’epatite acuta e nel caso si sospetti una cronica. Anche se le epatiti acute e croniche hanno
purtroppo aspetti laboratoristici in parziale sovrapposizione, possiamo, almeno grossolanamente,
distinguere le due entità nosologiche in questo modo:
EPATITE ACUTA:
Clinicamente il paziente risulta in genere sintomatico (astenia, nausea, malessere generale, cefalea, mialgie,
lombalgia etc.) con, dal punto di vista laboratoristico, livelli di ALT da 40 a 100 volte i livelli normali,
aumento consensuale delle AST mentre gli indici di colestasi (GGT e ALP) presentano un incremento molto
più modesto. La bilirubina è in genere elevata e mista. In assenza di elementi anamnestici chiari, la
diagnostica deve escludere l’epatite da HAV, HBV, HCV e HEV.
Per diagnosticare un’epatite A acuta è indispensabile il dosaggio degli anticorpi anti-HAV-IgM. La
loro presenza infatti conferma il sospetto diagnostico in quanto le IgM anti-HAV compaiono quasi
contemporaneamente ai sintomi sistemici e biologici e declinano piuttosto rapidamente (12 settimane
circa) lasciando il posto alle IgG anti-HAV che indicano un’esposizione pregressa. Le IgM anti-HAV devono
essere effettuate in tutti i soggetti con epatite acuta di natura non definibile anche se sono positivi per
infezione cronica da HBV o HCV.
Per diagnosticare un’epatite B acuta invece gli anticorpi non sono utili. Infatti, dopo la fase di
incubazione della durata variabile, compaiono nel siero, contemporaneamente ai sintomi clinici, sia HBsAg
che l’HBeAg che l’HBV-DNA. Nel volgere di 4-6 settimane HBsAg e HBeAg scompaiono, mentre l’HBV-DNA
declina anche più rapidamente, mentre compaiono gli anticorpi anti-HBc-IgM che rimangono dosabili per
circa 12 mesi, mentre le IgG anti-HBc perdurano praticamente tutta la vita. La diagnosi dell’epatite acuta da
HBV dunque si basa sulla dimostrazione del virus HBV circolante, la diagnosi viene poi confermata nel
tempo dalla successiva comparsa degli anticorpi IgM specifici.
La diagnosi di epatite C acuta invece risulta quasi sempre molto ardua. Prima di tutto perché nella
quasi totalità dei casi l’epatite acuta da HCV è completamente asintomatica, pur in presenza di ALT anche
30 volte il livello normale, ed è sempre anitterica. Il paziente dunque non presentando alcun sintomo non si
rivolge al medico e di solito la forma acuta è diagnosticata per caso nei centri trasfusionali o nei SERT
durante prelievi di sangue eseguiti per routine. Il virus HCV infatti si replica ad alto livello (106 copie/ml) per
6-8 settimane prima che compaiano gli anticorpi specifici insieme alle alterazioni delle ALT. Purtroppo le
alterazioni delle ALT possono essere modeste anche nella fase acuta dell’infezione e pertanto non sono un
parametro discriminante. L’HCV possiede un sistema per sfuggire al sistema immune e non determina una
risposta umorale significativa: le IgM anti-HCV non compaiono e le IgG indicano la presenza di infezione e
non di immunità. In corso di un’epatite di natura non definibile gli anticorpi anti-HCV devono essere sempre
eseguiti e nel caso siano positivi deve essere sempre fatta la ricerca dell’HCV-RNA. Anche in presenza di
positività dell’HCV-RNA la diagnosi di epatite C acuta è difficile in quanto fasi di riacutizzazione di una
malattia cronica hanno il medesimo aspetto laboratoristico e sierologico delle forme acute. Un’attenta
anamnesi volta a verificare gli eventuali fattori di rischio è il mezzo più appropriato per discriminare una
forma acuta da una cronica.
Una diagnosi di epatite D acuta è per certi versi un ossimoro in quanto il virus delta non può
replicarsi se non in presenza dell’HBV e pertanto una forma acuta che coinvolga l’HDV può verificarsi solo in
due situazioni: 1) se l’HDV viene trasmesso contemporaneamente all’HBV oppure 2) se un soggetto
portatore di HBsAg viene infettato dall’HDV. Nel primo caso l’HDV inibisce la replicazione dell’HBV e questo
può determinare una malattia acuta benigna a rapida risoluzione spontanea, nel secondo caso l’HDV si
replica vigorosamente e determina la comparsa o il peggioramento dell’epatite cronica da HBV. Nel caso vi
sia il sospetto di una superinfezione da HDV in un soggetto HBsAg positivo si possono cercare gli anticorpi
anti-HDV sia IgM che IgG. La ricerca dell’HDV-RNA è utile solo per il monitoraggio della terapia antivirale.
L’epatite E acuta è una realtà che si credeva confinata nei paesi in via di sviluppo ma che purtroppo
sta diffondendosi anche nei paesi industrializzati. Il virus dell’epatite E infatti presenta diversi genotipi tra i
quali il 2 e il 4 sono quelli “classici” delle epidemie che periodicamente compaiono nei paesi con sistemi
fognari scadenti (o inesistenti) in cui gli scarichi provenienti dalle deiezioni umane si mescolano con l’acqua
dei pozzi e in questi casi il contagio è uomo-uomo. In tali casi la malattia è benigna e può presentare
complicazioni solo per le donne in gravidanza. Invece il genotipo 3 dell’HEV, che si sta diffondendo nei paesi
industrializzati, determina una zoonosi, ovvero il virus si trasmette da animali portatori (in genere maiali,
cinghiali, cervi e caprioli) all’uomo. La malattia è benigna nel 70% dei casi, con ALT raramente oltre 20 volte
la norma, ma può essere grave o anche mortale nei soggetti immuno-compromessi. Purtroppo i test
sierologici non sono completamente affidabili in particolare le IgM per la diagnosi di una forma acuta,
mentre il dosaggio delle IgG è abbastanza affidabile per verificare un pregresso contagio. Nel caso di
sospetto di epatite acuta con anamnesi positiva l’unico modo per arrivare a una diagnosi è la
determinazione dell’HEV-RNA.
In conclusione, in una forma epatitica acuta le indagini da fare sono:
•
Nel caso di sospetta infezione per via oro-fecale (HAV e HEV) determinare: IgM anti-HAV e l’HEVRNA.
•
Nel caso di sospetta esposizione alla via parenterale (HBV, HDV o HCV) richiedere: HBsAg,
HBeAg, HBV-DNA, anti-HDV e anti-HCV. Se positività anti-HCV determinare HCV-RNA.
EPATITI CRONICHE:
In questo caso le alterazioni delle ALT e degli altri indici di funzione epatica saranno modesti (da 4 a 10-15
volte i livelli normali), il paziente è in genere asintomatico e si rivolge al medico proprio per tali alterazioni
scoperte durante controlli di screening o casuali. Anche in questo caso la presenza di obesità o dislipidemie
e l’anamnesi, ad esempio positiva per uso di droghe per via parenterale o per abuso alcolico, dovrà sempre
indirizzare il percorso diagnostico.
I virus che possono determinare epatiti croniche sono HBV, HDV e HCV. Sono stati segnalati anche
casi di forme croniche da HEV, ma tale patologia è confinata nei casi con severa immuno-soppressione per
malattie ematologiche, reumatologiche o per trapianti d’organo. Uno screening per l’HEV è pertanto inutile
al di fuori di tali categorie a rischio.
Nel caso venga dunque sospettata un’epatite cronica virale, i primi esami da effettuare sono
l’HBsAg e gli anticorpi anti-HCV. Nel caso l’HBsAg risulti positivo si dovrà richiedere tutto il pannello di Ag e
Ab del virus ovvero HBeAg e anti-HBe, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBc-IgM (laddove tale test è disponibile)
anti-HDV e infine l’HBV-DNA con carica virale. Se gli anticorpi anti-HCV risultano positivi si dovrà richiedere
l’HCV-RNA e il genotipo virale, mentre la carica virale risulta inutile se non in vista di un programma di
terapia antivirale specifica. I pazienti HBsAg positivi e HCV-RNA positivi dovranno essere avviati a un
ambulatorio epatologico per le procedure di stadiazione delle malattia epatica, follow-up, screening
familiare ed eventuale terapia specifica.
VALUTAZIONE CRITICA DI UN PANNELLO VIRALE RELATIVO ALL’EPATITE B:
Molto spesso ematologi, internisti e reumatologi a vario titolo sono incerti sulla valutazione di un pannello
virale relativo all’epatite B. In effetti il quadro è complesso e negli ultimi anni, gli sviluppi tecnologici hanno
ulteriormente complicato la situazione. Non bisogna comunque mai dimenticare il significato dei vari Ag e
anticorpi:
•
Presenza di Anti-HBs significa immunità anti-HBV
•
Presenza di Anti-HBc significa esposizione all’HBV in tempi pregressi
•
HBsAg positivo significa infezione da HBV
•
HBeAg positivo significa replicazione attiva dell’HBV
•
Anti-HBc-IgM (al di fuori della fase acuta ovviamente) significa malattia epatica da HBV.
La possibilità di spingere la ricerca dell’HBV-DNA mediante PCR a livelli impensabili fino a pochi anni
fa, ha dimostrato che tutti i soggetti HBsAg positivi replicano il virus e pertanto la vecchia terminologia di
“portatore sano” di HBV è stata eliminata e attualmente si parla di “Portatore attivo” quando, in presenza
di normali indici di funzione epatica, si trovano più di 2.000 IU/ml di virus circolanti e di “Portatore
inattivo” quando le IU sono inferiori a 2000/ml. Ulteriore complicazione è la problematica della presenza
del HBeAg e anti-HBe. Fino agli anni ’80 dello scorso secolo, si credeva che la cosiddetta “sieroconversione”
da HBeAg a anti-HBe fosse un segno di potenziale guarigione dall’epatite B. Purtroppo negli anni successivi
si è dimostrato che tale “sieroconversione” era legata non alla guarigione ma alla comparsa di una variante
virale priva dell’antigene “e” in grado di replicarsi a livelli ancora più elevati del virus HBV “selvaggio”.
Questo ha creato molta confusione e pertanto è bene ricordare che almeno in Italia questa mutazione la
cosiddetta “variante pre-core” è la più diffusa tra le epatiti croniche da HBV. Vediamo dunque una serie
paradigmatica di pannelli virali per illustrare meglio le varie combinazioni possibili.
HBsAg neg
anti-HBs pos
anti-HBc neg
HBeAg neg
anti-HBe neg
anti-HDV
neg
HBsAg neg
anti-HBs pos
anti-HBc pos
HBeAg neg
anti-HBe neg
anti-HDV
neg
HBsAg neg
anti-HBs neg
anti-HBc pos
HBeAg neg
anti-HBe neg
anti-HDV
neg
HBsAg pos
anti-HBs neg
anti-HBc pos
HBeAg pos
anti-HBe neg
anti-HDV
neg
HBsAg pos
anti-HBs neg
anti-HBc pos
HBeAg neg
anti-HBe pos
anti-HDV
neg
HBsAg pos
anti-HBs neg
anti-HBc pos
HBeAg pos
anti-HBe neg
anti-HDV
pos
Vaccinato
Pregressa
infezione
guarita
Pregresso
contatto con
il virus
Epatite
cronica virus
selvaggio
Epatite
cronica virus
mutante
pre-core
Epatite
cronica
HBV +HDV
Anche da questo pannello di evince che nei soggetti HBsAg negativi è inutile eseguire il pannello completo,
mentre è di grande utilità far eseguire gli anticorpi anti-HBc e anti-HBs. Al contrario i soggetti HBsAg positivi
dovranno eseguire tutto il pannello, l’HBV-DNA e la ricerca della sovra-infezione delta mediante anticorpi
specifici.