Biological Sciences presented by born - ETH E

Diss. ETHNr. 11804
SALICYLATE AND PYOCHELIN BIOSYNTHESIS
IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
PAOl
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
Doctor of
degree
of
Biological
Sciences
presented by
LAURA SERINO
Dipl.
Biol.
University
born
of Rome "La
Sapienza"
September 14th, 1966
citizen of Rome, ITALY
Accepted
on
the recommendation of
Prof. Dr. N. Amrhein, examiner
Prof. Dr. D. Haas, co-examiner
Zurich 1996
-1-
SUMMARY
opportunistic
The
human
and versatile bacterium Pseudomonas
pathogen
strain PAOl possesses several
uptake systems
to counter
the iron limitation found both in
the human host and in the environment. These systems involve the
siderophores (pyoverdin, pyochelin
The
P.
siderophores pyoverdin
aeruginosa. Salicylic
pyochelin
genetics
aeruginosa.
of such
These two aspects
carrying
strain of P.
synthesis
a
were
28-kb
salicylate
and
pyochelin.
found to be necessary for
were
reduced to 2.3 kb and
homology
the
to
proteins. Overexpression
pchB
gene
to
salicylate
an
of both
and
study
salicylate
intermediate in this reaction.
product
coli entC mutant
was
lacking
proteins
precursor of
formation in P.
complemented
was
restoration of
Two genes,
a mutant
defective in the
salicylate
designated pchB
The deduced PchA
enzyme isochorismate
show any
from P.
of
plants.
salicylate formation.
proteins
pathogenicity
in order to understand the role
region causing
sequenced.
not
proteins.
significant
aeruginosa
and
protein
synthase
of
similarities with known
allowed the conversion of
and pyruvate in vitro. We also demonstrated that isochorismate is
expressed
conversion of isochorismate to
and PchB
in the
biosynthetic
from strain PAOl
chorismate-utilizing
Escherichia coli, whereas PchB did
be
in this
The
of distinct
aeruginosa. However, little is known
pyochelin
genomic fragment
pchA,
to
in P.
bacteria and in their interaction with
was
likely
implicated
aeruginosa, obtained by chemical mutagenesis, that
of both
chorismate
have been
analysed
production
showed
of
biochemistry
production
and of their cognate receptor
acid has been demonstrated to be the
and
compounds in
A cosmid
pyochelin
display siderophore activity
and to
about the
and
salicylate)
and
aeruginosa
were
in
an
Salicylate
formation
E. coli entB mutant,
was
normally
2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate.
isochorismate
synthase
coordinately expressed.
excreted
salicylate
blocked in the
In contrast,
an
by salicylate
PchA and PchB,
and pyruvate in P.
E.
when both the PchA
Our results suggest the existence of
iron-repressible two-step pathway, catalyzed by
chorismate to isochorismate followed
observed when the
leading
aeruginosa.
an
from
-2-
In
an
effort to find the enzymes
molecules of
cysteine
form
to
required
for the condensation of
pyochelin,
we
salicylate
form
an
operon of 4.4 kb, transcribed from
site
identified in the promoter
were
with the observed
drive the
repression
expression
of
region
of the genes
the
to
found
iron. The
same
Fur-binding
consensus
pchDCBA operon.
oriented gene,
divergently
a
homology
of the
by
were
promoter located upstream of the PchD
a
translational start codon. Two sequences with
two
have identified two additional genes
upstream of pchBA, designated pchD and pchC. The four genes pchDCBA
to
with
This is consistent
promoter region
pchR,
serves to
which is known to be
a
positive regulator of pyochelin synthesis.
The deduced
forming
protein product
enzymes,
from
a
ATP and
Mg
thiotemplate
of adenylate-
during peptide
and
to
2,3-dihydroxybenzoate
in the enterobactin
biosynthetic
as
cofactors. The PchC
prokaryotic
and
protein
exhibited
eucaryotic origin.
mechanism may be involved in the
the EntE
significant
These
synthesis
of
findings
pyochelin
salicylate.
Several
pchD-negative
Both
replacement.
production
of
a
weakly
an
pchD
that
a
a
aeruginosa
strongly polar
the mutants
P.fluorescens
dihydroaeruginoic
intermediate in the
acid is
a
operon of P.
were
impaired
condensation
in the
reported
product
by
codes for the enzymes
production
gene
in P.
aeruginosa.
aeruginosa.
that the
of
an
been isolated from
of salicylate and
of pyochelin in P.
mapped upstream
and, probably, the adenylation of salicylate.
constructed
previously
salicylate synthesis, indicating
aeruginosa
were
mutation affected the strains in the
strain but not yet
transcribed from the promoter
pchDCBA
PAOl
which had
biosynthetic pathway
mutation abolished
normally
and
pyochelin. Moreover,
culture supematants of
possible
mutants of P.
compound, dihydroaeruginoic acid,
antibiotic
and
family
highest similarity
similarities to thioesterases of both
suggest that
to a
PchD showed the
particular,
In
enzyme of E. coli, which activates
pathway, using
similarity
of which activate and bind amino acids
some
siderophore synthesis.
PchD showed extensive
pchBA
It is
cysteine,
The
polar
genes
are
of pchD. In conclusion, the
catalyzing
the
biosynthesis
-3-
RIASSUNTO
Pseudomonas aeruginosa e'
molteplici condizioni
del ferro per
un
batterio
ambientali. II ceppo PAOl
fronteggiare
le condizioni di
che nell'ambiente esterno.
umano
pioverdina
e
piochelina
indagine
della
approfondimento e
ruolo di
P.
mutagenesi
screening
identificare
un
genomico
ridotta ad
nei batten
e
nella
rispettivi
patogenicita'
di
banca
una
di P.
tre
diversi
proteici.
aeruginosa.
Nel
I
E
e
produzione
studiare la loro interazione
e
della
del salicilato
genomica
le
ripristino
della
chiarire il
a
piante.
aeruginosa,
Tale ceppo mutante 6 stato utilizzato
del ceppo
inserto di DNA
e
in fase di
ancora
ceppo mutante di P.
un
piochelina.
con
di questa
corso
tipo PAOl, riuscendo
grado di complementare la mutazione Sal".
conteneva un
nell'ospite
recettori
aeruginosa.
la biochimica della
chimica abbiamo ottenuto
necessaria per il
un
dei loro
sia
produzione di
aeruginosa. Lo studio di questi aspetti 6
cosmide in
complementante
e
implicati
genetica
difettivo nella sintesi del salicilato
per lo
consistono nella
presenti
acquisizione
lo scopo della nostra ricerca 6 di ricavare informazioni utili
questi composti
Mediante
sono
di tale metallo
anche un'attivita' sideroforica in P.
abbiamo analizzato la
piochelina in
salicilato
sistemi di
a
salicilico rappresenta il precursore biosintetico della
stato dimostrato che l'acido
piochelina e possiede
e
per l'uomo, che si adatta
possiede diversi
carenza
Questi sistemi
siderofori, pioverdina, piochelina
siderofori
opportunista, patogeno
genomico
produzione
di 28 kb. La
cosi' ad
II cosmide
regione
di DNA
di salicilato 6 stata successivamente
frammento di 2,3 kb.
La determinazione della sequenza nucleotidica del frammento di 2,3 kb ha
permesso
1'identificazione di due
prodotto proteico
geni, pchB cpchA,
PchA mostra
necessari per la formazione di salicilato. II
omologia con l'enzima
isocorismato sintasi di Escherichia
coli, che catalizza la conversione del corismato in isocorismato ncl
del sideroforo enterobactina. II
prodotto proteico PchB, invece,
significative
L'espressione
con
proteine
note.
di entrambc le
non
corso
ha rivelato
proteine
permesso di dimostrare in vitro la conversione del corismato
a
della biosintesi
in P.
omologie
aeruginosa
salicilato
e
ha
piruvato.
-4-
Inoltre, abbiamo dimostrato che 1'isocorismato rappresenta
un
probabile
intermedio in
questa reazione enzimatica. Infatti, in seguito ad espressione del solo gene pchB in
ceppo mutante entB di E. coli, bloccato nella conversione dell'isocorismato
2,3-diidrossibenzoato abbiamo
formazione di salicilato. Inoltre,
osservato
a
un
2,3-diidroceppo di E.
un
coli, difettivo nell'enzima isocorismato sintasi (mutante entC), in seguito all'espressione
coordinata delle due
proteine
PchA
I nostri risultati propongono,
PchB, ha
e
dunque, l'esistenza
ferro-regolata, che, partendo
dal corismato
porta alia formazione di salicilato
rispettivamente,
dalle due
proteine
Nel tentativo di individuare
gli
enzimi
repressione di
regola l'espressione
per
un
al sito di
omologhe
conferma la
passando
e
due tappe
di
un
tali
legame
geni
regolatore positivo
biosintetica,
isocorismato,
sono
catalizzate,
della condensazione del salicilato
abbiamo identificato,
pchC.
I quattro
della
pchR,
a
monte dei
geni pchDCBA
a monte
Questa
con
geni
formano
un
del codone iniziale di
abbiamo identificato due
proteina regolatrice
da parte del ferro.
altro gene,
via
PchB.
promotore situato
un
una
per l'intermedio
regione promotrice dell'operone pchDCBA
PchD. Inoltre nella
sequenze
e
piochelina,
unico operone di 4,4 kb, trascritto da
in P. aeruginosa di
responsabili
geni supplementari, pchD
due
e
formazione di salicilato.
piruvato. Queste
e
PchA
la cisteina nella formazione della
pchBA,
mostrato
stessa
Fur.
Questo risultato
regione
del promotore
trascritto in direzione opposta, che codifica
della sintesi della
piochelina
e
dello
specifico
recettore
di
famiglia
di
membrana.
II
prodotto proteico
PchD ha dimostrato
enzimi che formano adenilati,
di
peptidi e siderofori,
Mg2+
come
responsabili
particolare,
con
significativa
similitudine
tioesterasi sia di
1'enzima di E. coli EntE, che, utilizzando ATP
proteina PchC, invece,
origine procariotica
tiotemplato possa
piochelina a parti re
dal salicilato.
mostrava una
che eucariotica.
essere
con una
dell'attivazione di aminoacidi durante la sintesi
cofattori, attiva il 2,3-diidrossibenzoato nel
dell'enterobactina. La
meccanismo
in
una
corso
e
della via biosintetica
significativa
similitudine
con
Questi risultati ipotizzano che
un
coinvolto anche nella sintesi del sideroforo
-5-
Mediante sostituzione del gene selvatico
due
tipi
di mutanti
nella
sintesi
diidroaeruginoico, precedentemente
ma non
di P.
nella via biosintetica della
con
partire
1'operone pchDCBA
e,
isolato da
la cisteina
piochelina
abolisce anche la sintesi di salicilato,
a
della
e
gene mutato, abbiamo ottenuto
non). Entrambi i ceppi mutanti
dell'antibiotico,
piochelina
e
sopranatanti
di colture di P.
acido
fluorescens,
aeruginosa. L'acido diidroaeruginoico deriva probabilmente dalla
condensazione del salicilato
transcritti
rispettivo
pchD negativi (mutazione polare
difettivi
risultavano
il
con
probabilmente,
in P.
e
aeruginosa.
dunque
dal promotore situato
di P.
aeruginosa
rappresenta dunque
e
a
codifica per
1'adenilazione del salicilato.
La mutazione
conferma che i
monte
gli
un
possibile
polare pchD, inoltre,
geni pchBA
del gene
intermedio
pchD.
sono
in effetti
In conclusione,
enzimi che catalizzano la biosintesi