Diss. ETHNr. 11804 SALICYLATE AND PYOCHELIN BIOSYNTHESIS IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA PAOl A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the Doctor of degree of Biological Sciences presented by LAURA SERINO Dipl. Biol. University born of Rome "La Sapienza" September 14th, 1966 citizen of Rome, ITALY Accepted on the recommendation of Prof. Dr. N. Amrhein, examiner Prof. Dr. D. Haas, co-examiner Zurich 1996 -1- SUMMARY opportunistic The human and versatile bacterium Pseudomonas pathogen strain PAOl possesses several uptake systems to counter the iron limitation found both in the human host and in the environment. These systems involve the siderophores (pyoverdin, pyochelin The P. siderophores pyoverdin aeruginosa. Salicylic pyochelin genetics aeruginosa. of such These two aspects carrying strain of P. synthesis a were 28-kb salicylate and pyochelin. found to be necessary for were reduced to 2.3 kb and homology the to proteins. Overexpression pchB gene to salicylate an of both and study salicylate intermediate in this reaction. product coli entC mutant was lacking proteins precursor of formation in P. complemented was restoration of Two genes, a mutant defective in the salicylate designated pchB The deduced PchA enzyme isochorismate show any from P. of plants. salicylate formation. proteins pathogenicity in order to understand the role region causing sequenced. not proteins. significant aeruginosa and protein synthase of similarities with known allowed the conversion of and pyruvate in vitro. We also demonstrated that isochorismate is expressed conversion of isochorismate to and PchB in the biosynthetic from strain PAOl chorismate-utilizing Escherichia coli, whereas PchB did be in this The of distinct aeruginosa. However, little is known pyochelin genomic fragment pchA, to in P. bacteria and in their interaction with was likely implicated aeruginosa, obtained by chemical mutagenesis, that of both chorismate have been analysed production showed of biochemistry production and of their cognate receptor acid has been demonstrated to be the and compounds in A cosmid pyochelin display siderophore activity and to about the and salicylate) and aeruginosa were in an Salicylate formation E. coli entB mutant, was normally 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate. isochorismate synthase coordinately expressed. excreted salicylate blocked in the In contrast, an by salicylate PchA and PchB, and pyruvate in P. E. when both the PchA Our results suggest the existence of iron-repressible two-step pathway, catalyzed by chorismate to isochorismate followed observed when the leading aeruginosa. an from -2- In an effort to find the enzymes molecules of cysteine form to required for the condensation of pyochelin, we salicylate form an operon of 4.4 kb, transcribed from site identified in the promoter were with the observed drive the repression expression of region of the genes the to found iron. The same Fur-binding consensus pchDCBA operon. oriented gene, divergently a homology of the by were promoter located upstream of the PchD a translational start codon. Two sequences with two have identified two additional genes upstream of pchBA, designated pchD and pchC. The four genes pchDCBA to with This is consistent promoter region pchR, serves to which is known to be a positive regulator of pyochelin synthesis. The deduced forming protein product enzymes, from a ATP and Mg thiotemplate of adenylate- during peptide and to 2,3-dihydroxybenzoate in the enterobactin biosynthetic as cofactors. The PchC prokaryotic and protein exhibited eucaryotic origin. mechanism may be involved in the the EntE significant These synthesis of findings pyochelin salicylate. Several pchD-negative Both replacement. production of a weakly an pchD that a a aeruginosa strongly polar the mutants P.fluorescens dihydroaeruginoic intermediate in the acid is a operon of P. were impaired condensation in the reported product by codes for the enzymes production gene in P. aeruginosa. aeruginosa. that the of an been isolated from of salicylate and of pyochelin in P. mapped upstream and, probably, the adenylation of salicylate. constructed previously salicylate synthesis, indicating aeruginosa were mutation affected the strains in the strain but not yet transcribed from the promoter pchDCBA PAOl which had biosynthetic pathway mutation abolished normally and pyochelin. Moreover, culture supematants of possible mutants of P. compound, dihydroaeruginoic acid, antibiotic and family highest similarity similarities to thioesterases of both suggest that to a PchD showed the particular, In enzyme of E. coli, which activates pathway, using similarity of which activate and bind amino acids some siderophore synthesis. PchD showed extensive pchBA It is cysteine, The polar genes are of pchD. In conclusion, the catalyzing the biosynthesis -3- RIASSUNTO Pseudomonas aeruginosa e' molteplici condizioni del ferro per un batterio ambientali. II ceppo PAOl fronteggiare le condizioni di che nell'ambiente esterno. umano pioverdina e piochelina indagine della approfondimento e ruolo di P. mutagenesi screening identificare un genomico ridotta ad nei batten e nella rispettivi patogenicita' di banca una di P. tre diversi proteici. aeruginosa. Nel I E e produzione studiare la loro interazione e della del salicilato genomica le ripristino della chiarire il a piante. aeruginosa, Tale ceppo mutante 6 stato utilizzato del ceppo inserto di DNA e in fase di ancora ceppo mutante di P. un piochelina. con di questa corso tipo PAOl, riuscendo grado di complementare la mutazione Sal". conteneva un nell'ospite recettori aeruginosa. la biochimica della chimica abbiamo ottenuto necessaria per il un dei loro sia produzione di aeruginosa. Lo studio di questi aspetti 6 cosmide in complementante e implicati genetica difettivo nella sintesi del salicilato per lo consistono nella presenti acquisizione lo scopo della nostra ricerca 6 di ricavare informazioni utili questi composti Mediante sono di tale metallo anche un'attivita' sideroforica in P. abbiamo analizzato la piochelina in salicilato sistemi di a salicilico rappresenta il precursore biosintetico della stato dimostrato che l'acido piochelina e possiede e per l'uomo, che si adatta possiede diversi carenza Questi sistemi siderofori, pioverdina, piochelina siderofori opportunista, patogeno genomico produzione di 28 kb. La cosi' ad II cosmide regione di DNA di salicilato 6 stata successivamente frammento di 2,3 kb. La determinazione della sequenza nucleotidica del frammento di 2,3 kb ha permesso 1'identificazione di due prodotto proteico geni, pchB cpchA, PchA mostra necessari per la formazione di salicilato. II omologia con l'enzima isocorismato sintasi di Escherichia coli, che catalizza la conversione del corismato in isocorismato ncl del sideroforo enterobactina. II prodotto proteico PchB, invece, significative L'espressione con proteine note. di entrambc le non corso ha rivelato proteine permesso di dimostrare in vitro la conversione del corismato a della biosintesi in P. omologie aeruginosa salicilato e ha piruvato. -4- Inoltre, abbiamo dimostrato che 1'isocorismato rappresenta un probabile intermedio in questa reazione enzimatica. Infatti, in seguito ad espressione del solo gene pchB in ceppo mutante entB di E. coli, bloccato nella conversione dell'isocorismato 2,3-diidrossibenzoato abbiamo formazione di salicilato. Inoltre, osservato a un 2,3-diidroceppo di E. un coli, difettivo nell'enzima isocorismato sintasi (mutante entC), in seguito all'espressione coordinata delle due proteine PchA I nostri risultati propongono, PchB, ha e dunque, l'esistenza ferro-regolata, che, partendo dal corismato porta alia formazione di salicilato rispettivamente, dalle due proteine Nel tentativo di individuare gli enzimi repressione di regola l'espressione per un al sito di omologhe conferma la passando e due tappe di un tali legame geni regolatore positivo biosintetica, isocorismato, sono catalizzate, della condensazione del salicilato abbiamo identificato, pchC. I quattro della pchR, a monte dei geni pchDCBA a monte Questa con geni formano un del codone iniziale di abbiamo identificato due proteina regolatrice da parte del ferro. altro gene, via PchB. promotore situato un una per l'intermedio regione promotrice dell'operone pchDCBA PchD. Inoltre nella sequenze e piochelina, unico operone di 4,4 kb, trascritto da in P. aeruginosa di responsabili geni supplementari, pchD due e formazione di salicilato. piruvato. Queste e PchA la cisteina nella formazione della pchBA, mostrato stessa Fur. Questo risultato regione del promotore trascritto in direzione opposta, che codifica della sintesi della piochelina e dello specifico recettore di famiglia di membrana. II prodotto proteico PchD ha dimostrato enzimi che formano adenilati, di peptidi e siderofori, Mg2+ come responsabili particolare, con significativa similitudine tioesterasi sia di 1'enzima di E. coli EntE, che, utilizzando ATP proteina PchC, invece, origine procariotica tiotemplato possa piochelina a parti re dal salicilato. mostrava una che eucariotica. essere con una dell'attivazione di aminoacidi durante la sintesi cofattori, attiva il 2,3-diidrossibenzoato nel dell'enterobactina. La meccanismo in una corso e della via biosintetica significativa similitudine con Questi risultati ipotizzano che un coinvolto anche nella sintesi del sideroforo -5- Mediante sostituzione del gene selvatico due tipi di mutanti nella sintesi diidroaeruginoico, precedentemente ma non di P. nella via biosintetica della con partire 1'operone pchDCBA e, isolato da la cisteina piochelina abolisce anche la sintesi di salicilato, a della e gene mutato, abbiamo ottenuto non). Entrambi i ceppi mutanti dell'antibiotico, piochelina e sopranatanti di colture di P. acido fluorescens, aeruginosa. L'acido diidroaeruginoico deriva probabilmente dalla condensazione del salicilato transcritti rispettivo pchD negativi (mutazione polare difettivi risultavano il con probabilmente, in P. e aeruginosa. dunque dal promotore situato di P. aeruginosa rappresenta dunque e a codifica per 1'adenilazione del salicilato. La mutazione conferma che i monte gli un possibile polare pchD, inoltre, geni pchBA del gene intermedio pchD. sono in effetti In conclusione, enzimi che catalizzano la biosintesi