Corso di laurea BIOTECNOLOGIE
UNIVERSITA’
DEGLI STUDI
DI TERAMO
Fisiologia cellulare e
Laboratorio di Colture
cellulari
Prof.ssa Luisa Gioia
Corso di laurea BIOTECNOLOGIE
Fisiologia cellulare e
Laboratorio di Colture cellulari
UNIVERSITA’
DEGLI STUDI
DI TERAMO
IL MATERIALE CONTENUTO IN QUESTE
DIAPOSITIVE E’ AD ESCLUSIVO USO DIDATTICO PER
L’UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TERAMO.
ALCUNE IMMAGINI CONTENUTE SONO STATE TRATTE DAI
SEGUENTI LIBRI:
“Biologia molecolare della cellula” – Bruce Alberts et al. (Ed. Zanichelli)
“FISIOLOGIA Molecole, cellule e sistemi” – Egidio D’Angelo e Antonio
Peres (Edi-ermes)
“Introduzione alle colture cellulari” - G.L. Mariottini et al. (Ed. Tecniche
nuove)
“Cell Biology: a short course” – S.R. Bolsover et al.
(Ed. Wiley-Blackwell)
COMUNICAZIONE INTERCELLULARE e
SEGNALAZIONE INTRACELLULARE
La maggior parte delle cellule di un organismo
pluricellulare devono ricevere costantemente SEGNALI di
varia natura per mantenersi vive e funzionare.
Tutti gli organismi hanno anche sistemi di segnalazione
che li avvertono della presenza di patogeni e che
determinano una risposta di difesa.
Anche i sistemi biologici presentano step comuni delle vie
di segnalazione, lo stesso sistema di segnalazione può
portare a risposte molto diverse in differenti cellule o
organismi.
tatto
suoni
luce
cellula
risposta
odori
calore
Altre cellule
Semplice via di segnalazione intracellulare attivata da una molecola segnale
extracellulare
messaggeri intracellulari
Segnalazione intercellulare
Secrezione SEGNALI
RECETTORI per la ricezione dei segnali
COMUNICAZIONE DIRETTA tramite GJ
Segnali immediati
Segnali a lungo
termine
Metabolismo cellulare
Funzioni cellulari
Espressione genica
Tipi di segnalazione intercellulare
Segnali per contatto cellulare avvengono fra cellule che devono avere
membrane plasmatiche adiacenti.
Segnali autocrini si legano ai recettori sulla cellula che li secerne.
Segnali paracrini si legano ai recettori e stimolano le cellule adiacenti.
Segnali sinaptici sono simili ai paracrini ma vi è una speciale struttura
chiamata sinapsi fra la cellula che origina il segnale e la cellula che lo
riceve.
I segnali sinaptici avvengono solo fra cellule che formano sinapsi
(es. sinapsi neuromuscolare)
Segnali endocrini avvengono quando le cellule secernono molecole
segnale nel sangue (es. le ovaie nelle femmine e i testicoli nei maschi sono
stimolati dagli ormoni prodotti dal cervello).
Segnalazione diretta tramite GJ
Segnalazione autocrina
UNA CELLULA PRODUCE MOLECOLE SEGNALE
CHE POSSONO LEGARSI AI PROPRI RECETTORI
SEGNALAZIONE TRAMITE GIUNZIONI GAP (GJ)
LE CELLULE CONNESSE DA GAP JUNCTIONS CONDIVIDONO PICCOLE
MOLECOLE SEGNALE (PM <1000 Da), ad es. Ca++ e cAMP,
E POSSONO PERCIO’ RISPONDERE A SEGNALI EXTRACELLULARI IN
MODO COORDINATO
Le connessioni cellulari dirette, come le giunzioni
comunicanti (gap) nelle cellule animali, permettono:
A.
alle cellule adiacenti di aderire strettamente le une alle altre.
B.
ai messaggeri secondari prodotti in una cellula di diffondere
rapidamente e stimolare eventi nelle cellule confinanti.
C.
alle cellule adiacenti di formare una stretta barriera di acqua fra le
loro membrane.
D.
alle proteine chinasi di fluire fra le cellule, coordinando la risposta
cellulare in un tessuto.
E.
il rapido scambio di informazioni genetiche fra le cellule adiacenti.
Non tutte le connessine sono compatibili
√ indica una GJ funzionante
From: Cell Biology A short course
SR Bolsover et al.
Wiley-Blackwell
Un fattore di crescita secreto dalla cellula che ha un tasso di
diffusione basso, ed interagisce solo con le cellule in una ristretta
area è un esempio di segnalazione:
• endocrina
• sinaptica
• paracrina
i segnali paracrini sono prodotti da cellule
e si legano ai recettori delle altre cellule
nelle immediate vicinanze.
• contatto cellulare
Semplice via di segnalazione intracellulare attivata da una molecola segnale
extracellulare
messaggeri intracellulari
La specializzazione funzionale delle m. plasmatiche (es. presenza di RAFT lipidici
e CAVEOLE) consente una efficiente organizzazione del sistema segnale-recettore
e la rapida attivazione delle vie di segnalazione intracellulare
La specializzazione funzionale delle m. plasmatiche (es. presenza di RAFT lipidici)
consente una efficiente organizzazione del sistema segnale-recettore e la rapida
attivazione delle vie di segnalazione intracellulare
Le 3 classi più grandi di recettori di superficie
Attivazione di una proteina G
Un segnale extracellulare agendo
su recettore ne cambia la
conformazione;
questo a sua volta altera la
conformazione della proteina G
L’alterazione della subunità alfa
permette di scambiare GDP con
GTP
La proteina G si divide in due
componenti: subunità alfa e
complesso beta-gamma entrambi i
quali possono regolare l’attività di
proteine bersaglio sulla M
plasmatica
Attivazione di una
proteina G
Il recettore resta attivo finchè
la molecola segnale resta
attaccata ad esso e perciò
può catalizzare l’attivazione di
molte molecole di proteina G
Disattivazione di una
proteina G
Disattivazione della proteina G
per idrolisi del GTP legato alla
subunità alfa
Dopo che la subunità alfa attivata
dal GTP ha attivato la sua proteina
bersaglio si spegne da sola
idrolizzando il GTP a GDP.
Ciò inattiva la subunità alfa che si
dissocia dalla proteina bersaglio
e si riassocia la complesso betagamma riformando la proteina G
inattiva
L' attività endogena GTPasica della proteina G
serve a:
•idrolizzare il GTP riportando la proteina G a livello di
attività pre-stimolazione
le risposte ai segnali extracellulari
devono essere reversibili.
In alcune forme di cancro, le mutazioni di una proteina G (detta Ras)
diminuiscono la attività della GTPasi
Il Ras permanentemente attivato porta ad una divisione cellulare irregolare
nel cancro.
I recettori di membrana responsabili della
segnalazione cellulare devono attraversare
la membrana; sono tutti proteine integrali
che trasmettono segnali attraverso il
doppio strato lipidico
RECETTORI
TIROSIN KINASI
¾
¾
¾
¾
¾
Legame Growth factors (es. EGF, PDGF,…)
Dimerizzazione
Fosforilazione (trans-fosfosforilazione) su tirosina
Reclutamento di proteine citoplasmatiche con dominio SH2
Attivazione vie di trasduzione Ras e MAPK
Sintesi DNA
Divisione cellulare
RECETTORI TIROSIN KINASI
MAPK: mitogen
associated protein
kinase
Il recettore per il fattore di crecita PDGF è un recettore TK e come altri recettori TK
attiva la GTPase Ras e conseguentemente la cascata delle MAP kinasi (MAPK)
Attivazione di una proteina chinasi
•Le proteine chinasi trasferiscono il gruppo fosfato su proteine target
causando una risposta cellulare
•L' attivazione porta frequentemente a una cascata di proteine chinasi:
il SISTEMA A CASCATA porta ad una rapida amplificazione del segnale
Le risposte ai segnali da parte dei sistemi di trasferimento devono
essere reversibili→ FOSFATASI: rimuovono il gruppo fosfato
I recettori TK per i fattori di crescita attivano una cascata di
proteine chinasi a cui partecipano enzimi multipli che
effettuano un cambio dell' espressione di un gene.
•Segnali esterni possono portare a cambiamenti della
espressione genica.
•I passaggi multipli determinano una amplificazione del segnale.
•I passaggi multipli che portano all'attivazione delle chinasi
possono dare diverse risposte cellulari, secondo la presenza o
assenza di proteine bersaglio.
Le mutazioni nel modello di segnalazione sono una delle
significative caratteristiche della crescita delle cellule
cancerose
RECETTORI TIROSIN KINASI
Un‘altra proteina citoplasmatica con
dominio SH2 reclutata in seguito alla
attivazione del recettore TK è PLCγ
La PLCγ attivata esplica la sua attività enzimatica
idrolizzando PIP2 in IP3 e DAG
RECETTORI TIROSIN KINASI
Il recettore TK per l’insulina
fosforila e attiva PI3-kinase
PI3-kinasi agisce su PIP2 aggiungendo
un altro gruppo P e formando PIP3
PIP3 lega PKB attivandola portando alla traslocazione alla m. plasmatica del
trasportatore per il glucosio (così cellule muscolari e adipociti posso captare grandi
quantità di glucosio dall’ambiente extracellulare)
La segnalazione fra le cellule normalmente
risulta nella attivazione di proteine
Molti recettori di
membrana legano
molecole segnale che
attivano una proteina
chinasi
Semplice via di segnalazione intracellulare attivata da una molecola segnale
extracellulare
messaggeri intracellulari
MESSAGGERI INTRACELLULARI
Es. Un segnale provoca l’attivazione di una proteina G
(il segnale originario normalmente non entra nella cellula)
Conseguentemente si ha la produzione di messaggeri secondari dentro la
cellula
L’invio di un segnale attraverso la membrana cellulare può
portare alla formazione di MESSAGGERI SECONDARI dentro la
cellula.
•
Ca++
•
cAMP
•
DAG
•
IP3
•
NO (ossido di azoto)
Svariate molecole possono agire
come "messaggeri secondari".
I messaggeri secondari vengono
prodotti quando un segnale (ligando) si
lega ad un recettore di membrana.
Le cellule sono programmate per le
risposte, lo stesso segnale e
messaggero secondario possono
avere differenti effetti secondo il
programma che opera nella cellula.
La risposta prodotta dalla cellula dipende da quale
bersaglio è disponibile per la proteina bersaglio
attivata
Alcune proteine G, attivando la fosfolipasi C, attivano la via di
segnalazione dell’inositolo fosfolipide che produce due
messaggeri intracellulari: IP3 e DAG
Il Ca++ ha la funzione di
messaggero intracellulare
ubiquitario
La fecondazione da parte di
uno spz scatena un
aumento di Ca++ citosolico
che porta all’attivazione
della cellula uovo
Il Ca++ ha la funzione di
messaggero intracellulare
ubiquitario
Intracellular [Ca++] is kept low, 10-7M
Extracellular or of ER lumen [Ca++] is kept
high, 10-3M
Steep gradient
to enable rapid
increase in [Ca++]i
REGULATION OF INTRACELLULAR [Ca++] CONCENTRATION
La piccola molecola di "cAMP" è stato il
primo messaggero secondario identificato
Intracellular concentration 10-7 M
(1950)
An extracellular signal can ↑ x20 fold in
seconds
¾cAMP is synthesised from ATP by
membrane bound adenylyl cyclase
¾cAMP is destroyed by cAMP
phosphodiesterases
to adenosine 5' monophosphate
(5'AMP)
In most animal cells, cAMP works via PKA
Legame di una molecola
segnale a un recettore
accoppiato a proteina G
Attivazione
dell’AC
Produzione di
cAMP
Molte delle azioni del cAMP sono poi
mediate dalla PKA, una serinatreonina kinasi cAMP-dipendente
cAMP-dependent protein kinase (PKA)
PKA catalyses the transfer of terminal phosphate
group from ATP to specific serines or threonines of
selected target proteins
¾Some cAMP mediated responses are rapid
(seconds)
-Skeletal muscle cells
Activated PKA phosphorylates enzymes involved in glycogen
metabolism
¾Some are slow (hours)
Transcription of the genes (regulation)
La PKA cAMP-dipendente è una proteina chinasi che media la
maggior parte degli effetti prodotti dal cAMP
In una reazione di aggressione o di fuga, l' epinefrina viene rilasciata dalle ghiandole
che producono adrenalina e si lega ai recettori di membrana delle cellule muscolari.
I seguenti eventi avvengono a causa del legame fra ligando e recettore:
•La proteina G viene attivata dal legame con il GTP e determina la
produzione di cAMP da parte della adenil ciclasi.
•Il messaggero secondario, cAMP, attiva la proteina chinasi A che inibisce la
glicogeno sintetasi bloccando la sintesi di glicogeno.
•La proteina chinasi A attiva altre chinasi, portando alla fosforilazione di enzimi
coinvolti nel metabolismo del glucosio
•Il glucosio prodotto nel giro di poche sec è disponibile per la
produzione di energia per la contrazione muscolare.
la risposta all 'epinefrina, nel fegato e nei muscoli, è un esempio di cascata che
determina il cambiamento di enzimi per assicurare che il glucosio libero sia disponibile
per la glicolisi nei tessuti muscolari
cAMP: in tutte le specie di mammifero svolge un ruolo
fondamentale nei meccanismi molecolari che regolano la
MATURAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE (fase M=MEIOSI),
determinando il mantenimento dell’arresto meiotico
MII
La maturazione della cellula uovo
Alti livelli intracellulari di cAMP mantengono l’oocita bloccato
allo stadio di profase della meiosi
AMPc
AMPc
PKA
nucleo
Proteina bersaglio della
PKA
OOCITA
Il PROCESSO DI
MATURAZIONE MEIOTICA
della cellula uovo è
necessario per la
fecondazione e la
conseguente formazione
dell’embrione, da cui può
originare un nuovo
individuo
EMBRIONE
5 vie parallele di segnalazione intracellulare
Le chinasi alla fine
di ciascuna via
fosforilano proteine
bersaglio, alcune
delle quali sono
attivate da più di
una chinasi
Semplice via di segnalazione intracellulare attivata da una molecola segnale
extracellulare
messaggeri intracellulari
Varie risposte indotte dallo stesso neurotrasmettitore, l’acetilcolina
tipi cellulari diversi
sono specializzati
a rispondere
in modo diverso
allo stesso
neurotrasmettitore
lo stesso segnale (e messaggero secondario)
può avere differenti effetti su cellule diverse
ALCUNE MOLECOLE SEGNALE AGISCONO SU RECETTORI INTRACELLULARI
recettore nucleare o citoplasmatico
messaggeri intracellulari
Gli estrogeni e il testosterone sono ormoni steroidei e si legano
a RECETTORI CITOPLASMATICI
Gli ormoni steroidei, estrogeni e testosterone sono non
polari e possono passare attraverso il doppio strato
lipidico senza legarsi a un recettore di membrana.
Gli ormoni steroidei si legano a speciali recettori nel
citoplasma della cellula. Questi recettori si modificano e
migrano verso il nucleo dove attivano la trascrizione.
L’ ossido di azoto (NO) è una molecola segnale sia negli
animali che nei vegetali entra nella cellula e si lega direttamente
ad un enzima dentro la cellula bersaglio
Ruolo dell’NO nel rilassamento della muscolatura liscia nella
parete di un vaso sanguigno
Quale delle seguenti NON è una risposta tipica associata
ad una segnalazione cellulare?
•
Attivazione della proteina G tramite lo scambio fra GTP e GDP
•
Produzione di messaggeri secondari (cAMP e IP3,…)
•
Attivazione di una proteina chinasi (PKA, PKC,…)
•
Rilascio di ioni calcio nel citosol cellulare
•
Stimolazione dell 'apoptosi
Vi sono situazioni in cui ad
una cellula viene segnalato
di morire per APOPTOSI,
ma questa non è una
risposta tipica ad un
segnale esterno
Le cellule possono andare incontro anche ad un
processo di morte cellulare programmata:
APOPTOSI
rimozione di cellule apoptotiche da parte di un macrofago
