ISTITUTO DI RICERCHE FARMACOLOGICHE
MARIO NEGRI
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LA VALUTAZIONE INTEGRATA DEL RISCHIO ASSOCIATA ALLE ACQUE
Laboratorio di Chimica e Tossicologia dell’Ambiente
Dott. Emilio Benfenati
p.i. Marco Lodi
Schema a blocchi metodologico
Monitoraggio relativo alla Qualità dell’Acqua
della
Sorgente emissiva e dell’ Ambiente recettore
Valutazioni Tossicologiche
Sperimentali Biologiche in
Vivo/Vitro
Valutazioni Tossicologiche
Computazionali Chimiche in
SILICO
Dimensionamento del peso tossicologico della
sorgente
I.T.F.M. (Indice Tox del Flusso di Massa)
Valutazione del danno ecotossicologico della
sorgente e utilizzando organismi modello
Valutazione del rischio tossicologico per l’uomo
e per l’ecosistema
I.T.R.A. (Indice Tox di Rischio Ambientale)
Valutazioni degli effetti subcronici e cancerogeni
della sorgente e del recettore acquoso sull’uomo,
utilizzando modelli cellulari umani (apparato Ematico,Epatico)
( C.elegans- Alghe-Fitotest-Daphnia-Topo)
Valutazioni di Tossicologia Medica
Valutazione degli Indici Biologici di Esposizione sull’uomo
Studi di Proteomica, Metabolomica, e di Espressione Genica in organismi modello (cellule e/ o Celegans) o in campioni derivanti dal monitoraggio personale
Progetto FIRB RBIP/06993E_006
del Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR).
L’approccio ERICA comprende l’applicazione di due indici
tossicologici composti e indipendenti:
• ITFM = Indice tossicologico del flusso di massa, che
traduce in termini tossicologici il flusso di massa emesso
da una sorgente emissiva/immissiva
• ITRA = indice tossicologico di rischio ambientale, che
valuta lo stato generale di salubrità ambientale di una area
dovuto all’impatto di inquinanti chimici generalmente
emessi da sorgenti antropiche
•
L’ITFM è uno strumento che permette di tradurre il flusso di massa complessivo di un processo produttivo in un flusso tossicologico basandosi sul concetto di equivalente di tossicità.
Indice Tossicologico del Composto Indicatore ITCI = Quantità del composto chimico (massa/die) Equivalente di Tossicità (massa/die)
•
•
La quantità del composto di interesse viene calcolata dai flussi di massa del processo, moltiplicando la concentrazione del composto nella matrice per il volume o peso di matrice emessa giornalmente. L’equivalente di Tossicità (ET) è calcolato sulla base dei dati tossicologici pubblicati da enti riconosciuti a livello nazionale ed internazionale (ISS‐ISPSEL‐EPA) ; sono le dosi di riferimento per la protezione della salute umana.
∑ ITCI → ITFM
Le formule utili per derivare ET dipendono dal tipo di composto analizzato. In particolare, si hanno 2 differenti equazioni:
Equazione per gli agenti tossici DOSE senza effetti avversi (mg/kg per die) X PESO uomo (kg)
Equazione per gli agenti cancerogeni
( 1E‐6 / Probabilità Incremento di Tumori) (mg/kg per die) x Peso uomo (kg)
L’indice Tossicologico di Rischio Ambientale (ITRA) è uno strumento a più livelli basato principalmente su un approccio a 3 componenti: analisi del rischio per i recettori ecologici analisi del rischio per la salute umana destino ambientale del composto.
L’analisi degli inquinanti si basa generalmente sul rapporto
PEC/PNEC ovvero sul confronto tra la concentrazione
ambientale (Predicted
Environmental Concentration,
concentrazione di non effetto (Predicted
PEC) e la
No Effect Concentration,
PNEC).
Qualità Ecologica EQ=PEC/PNEC
Le dosi di riferimento derivano da database accreditati internazionalmente (ECOTOX, IRIS, ISS), dalla letteratura scientifica peer reviewed oppure sono state predette con modelli Q S A R riconosciuti a livello internazionale.
I dati relativi alle proprietà chimico‐fisiche provengono da database accreditati o, nel caso di dati mancanti, vengono calcolati utilizzando modelli QSAR predittivi validati e utilizzati a livello internazionale (EPIsuite, ACD, DEMETRA, TOPKAT, HAZARD EXPERT, CAESAR, DEREK, DRAGON, SPARC, ANTARES).
• I livelli ambientali degli inquinanti analizzati sono usati come input per il calcolo della Dose Cronica Giornaliera (Chronic Daily Intake, CDI)
CDI = Conc.Inq. X (ContactRateMatrix x ExpFreq x ExpDuring) (Peso corporeo x Tempo mediazione x ConvFact )
• L’equazione generale è adattata alle diverse vie di esposizione del recettore attraverso l’utilizzo di parametri espositivi descrittivi.
gg‐hh
• La CDI è utilizzata per il calcolo dell’indice di qualità “umana” (Human Quality Index, HQ) e dell’indice di rischio cancerogenico
(Cancer Risk, CR) attraverso le equazioni:
HQ = CDI/RfD (dose di riferimento per gli effetti tossici)
CR = CDI x SF (Slope factor _FattoreProbabilitàIncerementoTumori )
Eco
Human
• Alghe
• Daphnie
• C.Elegans
• Fitotest
sulle acque
Sui terreni irrigati
• Influenza della In modelli cellulari di proliferazione cellulare
interesse • Citotossicità
tossicologico
• Genotossicità
(fegato, intestino, sangue)
• Cancerogenesi chimica e su modelli specifici (es. per EDCs, per cancerogenesi)
• 12 punti di campionamento:
• 8 sul Lago di Garda,
• 2 sul fiume Mincio,
• 2 Depuratore di Peschiera (in e out);
Caratterizzazione chimica degli EDCs
‐ Estrazione in fase solida (SPE con cartucce in polystyrene‐divinylbenzene)
‐ Electrospray ionization liquid chromatography tandem mass spectrometry (ESI‐LC‐MS/MS)
analysis with C8 column.
‐ Presenza
di
nonilfenolo,
bisfenolo A ed erbicidi triazinici in
tutti i punti di campionamento;
‐ Estrone ed estradiolo riscontrate
nei due punti di campionamento
del depuratore e nel Mincio;
‐ Concentrazioni paragonabili a
quelle di altri corpi idrici europei.
Valutazioni computazionali in silico
Analisi del rischio
‐ Uomo: ingestione cronica accidentale di acqua durante la balneazione, calcolo della dose cronica giornaliera e dell’indice di rischio per gli effetti tossici;
‐ Eco: calcolo del quoziente di Rischio (HQ = PEC/PNEC) per alghe, daphnidi e pesci (fathead minnow, rainbow trout, zebrafish, common carp e medaka).
‐ Utilizzo di database internazionali (IRIS e ECOTOX);
‐ Utilizzo di modelli QSAR nel caso di dati mancanti.
‐ Nessuna criticità per il rischio di
effetti tossici nell’uomo (Soglia di
rischio HI =1, HI max nei punti di
campionamento 0.0045)
‐ Criticità per il rischio di effetti
tossici
negli
organismi
acquatici
(soglia di rischio HQ = 1)
‐ terbutilazina e desetil‐atrazina sono
i composti con maggior impatto
ecologico nelle condizioni da noi
applicate
Valutazioni sperimentali Biologiche_Modelli in vitro
‐ Cellule epatiche (HepG2) utilizzate per lo studio della tossicità dei campioni di acqua tal quale mediante saggio di proliferazione cellulare a 72 ore (MTS assay).
‐ L’acqua campione è stata utilizzata per diluire il medium di coltura concentrato (10X) Æ 1 ml di medium + 9 ml di acqua campione.
Nessun effetto citotossico registrato. Stimolazione della proliferazione nei campioni di Malcesine, Garda e per le acque di ingresso al depuratore
Valutazioni sperimentali Biologiche_Modelli in vitro
‐Valutazione della proliferazione indotta dagli estratti contenenti EDCs in concentrazione
non citossicità su cellule di tumore al seno responsive all’estradiolo (E‐SCREEN assay).
Gli estratti hanno indotto
proliferazione significative
nel modello utilizzato con effetti proliferativi
paragonabili o superiori a quelli ottenuti con estradiolo
puro nel range 1‐10 pM.
Possibile presenza di altri
agenti stimolanti non identificati dall’analisi
chimica
Una ulteriore
caratterizzazione chimica ha evidenziato livelli significativi
di Galaxolide e Tonalide, composti potenzialmente
EDCs.
L’interpretazione dei dati
Valutazioni finali vengono effettuate dal gruppo di lavoro interdisciplinare relativamente ai diversi aspetti indagati con riferimento allo stato di salubrità dell’ecosistema e danno dei recettori esposti.
Ringrazio per il contributo il nostro gruppo di lavoro formato da:
Emilio Benfenati, Diego Baderna , Fabrizio Natolino, Andrea Colombo, Federico Teoldi,
Luisa Diomede,
Eva Negri
Grazie a ecocenter _ ecoreasearch
per averci voluto nel gruppo di lavoro Pro Acqua
