Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L`Analisi di

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici
1. L’Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei
frammenti di DNA prodotti da diversi enzimi di restrizione usati
singolarmente e in combinazione con la possibilità di costruire una mappa
dell’acido nucleico analizzato.
2. Analisi di restrizione di frammenti di DNA + marcatura con sonde
geniche specifiche:
Southern blot
Nothern blot
Dot blot
IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o
RNA complementari
• Complementarieta’: una sequenza nucleotidica S e’ la
complementare di S’ se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di
Watson e Crick
L’ibridazione degli acidi nucleici ne richiede prima la
denaturazione
Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la
separazione delle due catene (denaturazione):
•
•
Alte temperature
pH alcalino estremo (>13)
•
•
Bassa forza ionica [Na+]
Presenza in soluzione di sostanze che rompono i ponti a
idrogeno (urea, formammide).
Tm
•
La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’ dell’ibrido
che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare.
•
La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale per usare sonde
oligonucleotidiche come sonde per ibridizzare o come inneschi per la reazione
di PCR, o sonde non perfettamente complementari.
•
La Tm dipende da:
–
–
–
–
Lunghezza della sonda
Composizione in basi (G+C e A+T)
Grado di omologia
Ambiente chimico:
• Concentrazione salina (i cationi monovalenti come ioni Na+ stabilizzano la
doppia elica, i denaturanti chimici come formamide o urea la destabilizzano)
•Tm (temperatura di fusione):
temperatura alla quale il 50% di una certa
sequenza nucleotidica e’ ibridizzata al suo
filamento complementare.
•La Tm dipende da:
–Lunghezza della sonda
–Composizione in basi
(% di G+C)
La discesa graduale della temperatura e la permanenza delle molecole per un
certo tempo pochi gradi al di sotto della temperatura di denaturazione sono
fondamentali affinchè ci possa essere ibridazione, processo dipendente dai moti
di agitazione termica. Se dopo la denaturazione la soluzione viene portata a
bassa temperatura non si ha ibridazione, ma stabilizzazione della struttura
secondaria delle singole catene.
Per mezzo dell’ibridazione si possono formare delle doppie eliche di DNA-DNA,
DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che
in soluzione si mettano molecole con sequenza complementare (antiparallele).
L’ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica.
La denaturazione non è un processo irreversibile.
Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la
temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiare e la doppia
elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.
La denaturazione della doppia elica
si accompagna a grosse variazioni delle proprietà fisiche
delle soluzioni di DNA
•
•
Diminuzione della viscosità
Aumento di assorbanza a 260nm
STRINGENZA
•
Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e
bersaglio):
–
–
–
•
maggiore Temperatura
minore [ ] salina
presenza di denaturanti chimici
Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e
bersaglio):
–
minore Temperatura
–
–
maggiore [ ] salina
assenza di denaturanti chimici
In condizioni opportune di
temperatura e forza ionica
(stringenza) si possono
ottenere anche delle eliche
in cui sono tollerati degli
appaiamenti non perfetti
Progettazione e produzione di sonde
geniche
L’IMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E’
UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICA
MOLECOLARE
SI SFRUTTA LA CAPACITA’ DELLE MOLECOLE DI
ACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI
FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO
IBRIDAZIONE
SAGGI DI IBRIDAZIONE STANDARD E SAGGI INVERSI
• STANDARD
DOT-BLOT
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOT
IBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI
• INVERSI (MARCATURA DEL TARGET)
MICROARRAY
Saggi di ibridazione standard e inversa
• STANDARD:
bersaglio non marcato legato a supporto solido,
sonda marcata in soluzione
– Northern blot, slot blot
– Ibridazione in situ su tessuto o su cromosomi
• INVERSA:
sonda non marcata legata a supporto solido,
bersaglio marcato in soluzione
– Microarray o macroarray di DNA
– Microarray di oligonucleotidi
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Sintesi chimica
oligonucleotidi:
Con questo sistema si
possono sintetizzare in vitro
singoli filamenti di DNA di
grandezza compresa
tra 6 e 100 nucleotidi
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
Primer sintetico
3’
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
DNA polimerasi
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
DNA polimerasi
5’
5’
3’
DNA stampo (singolo filamento)
Le DNA polimerasi batteriche possono essere
purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro
3’
5’
5’
3’
Se nel corso della sintesi vengono incorporati
nucleotidi MARCATI (radioattivi, fluorescenti)
allora il filamento di nuova sintesi sara’ MARCATO
Utilizzando una RNA polimerasi invece di una DNA polimerasi potro
generare delle sonde di RNAantisenso marcate
cRNA
RNA polimerasi
Nucleotidi marcati
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati: Nucleotidi marcati con sostanze
non radioattive
- Fluorocromi (marcatura diretta)
-Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici
marcati con fluorocromi o enzimi)
- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con
fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati
Fluorocromi
Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive:
digossigenina
• trasferimento dopo frazionamento
elettroforetico:
– DNA: Southern blot
– RNA: Northern blot
Cella elettroforetica per gel di agarosio
Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite
elettroforesi
Incubare con colorante fluorescente
(bromuro d’etidio)
Bande corrispondenti al DNA
Trasferimento di DNA-RNA su filtro dopo frazionamento elettroforetico
Trasferimento di RNA (Northern blot)
•
•
•
•
•
•
Estrazione dell’RNA
Separazione tramite elettroforesi su gel denaturante
Trasferimento su membrana
Promozione di legame covalente con la membrana (cross-linking)
Ibridazione con sonda specifica
Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)
Gel colorato con etidio
bromuro
28S rRNA
18S rRNA
SLOT o DOT-BLOT
• GOCCIA DI DNA CROMOSOMICO SU FILTRO DI NYLON O
NITROCELLULOSA >SONDA MARCATA
A
B
C
D
1
1
2
3
4
2
5
6
7
8
3
9
10
11
12
4
13
14
15
16
(sia con campioni di RNA che di DNA)
Ibridazione su membrana
DNA a doppio filamento
fusione
DNA a singolo filamento
Il DNA si lega sul filtro
filtro
Incubare con sonda marcata
Lavare via il DNA marcato non
ibridizzato
autoradiografia
Ibridazione in situ
• Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o tessuti.
Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato (in quest’ultimo caso si
parla whole-mount).
• E’ l’unica tecnica che permette di localizzare l’espressione di un dato mRNA a livello delle
singole cellule.
• Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all’interno di un tessuto, o
i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli
studi di biologia dello sviluppo).
Schema ibridazione in situ su sezioni istologiche
Esempio di ibridazione: FISH (fluorescent in situ
hybridization)
La FISH su cromosomi metafasici utilizzando sonde specifiche per un determinato allele
permette di evidenziare eventuali anormalita’ cariotipiche quali traslocazioni, duplicazioni o
polisomie