Diagnostica microbiologica
molecolare
Acidi nucleici
Acidi nucleici
La coppia CG ha 3 legami idrogeno rispetto alla coppia AT che ne ha 2
La stabilità di una molecola di DNA è direttamente correlata alla frequenza di CG
ed alla lunghezza dell’elica di DNA
La stabilità dell’interazione tra filamenti è misurata attraverso la temperatura
necessaria a rompere tutti i legami idrogeno (temperatura di melting)
MICROBIOLOGIA CLINICA
MOLECOLARE
IMPIEGO DI TECNICHE MOLECOLARI
a fini diagnostici servono per identificare
E/O caratterizzare in UN ISOLATO
CLINICO UN PATOGENO sfruttando le
caratteristiche degli acidi nucleici
MICROBIOLOGIA CLINICA
MOLECOLARE
• METODICHE DI IBRIDAZIONE
prevedono l’utilizzo di sonde per identificare e
caratterizzare un bersaglio specifico
– IN VITRO, IN VIVO
• AMPLIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI
– PCR, PCR-DGGE, RT-PCR, PCR REAL TIME
Estrazione degli acidi nucleici
• Per l’estrazione degli acidi nucleici si
utilizzano differenti tecniche in base
all’efficienza e facilità di estrazione
• Separazione con solventi organici
• Separazione per affinità
• Separazione per scambio ionico
• Separazione per bollitura
Metodiche di ibridazione
• Generalmente viene scelta una corta sequenza di DNA a
singolo filamento (sonda o probe) che ibrida una sequenza
bersaglio complementare
• I saggi che utilizzano le sonde genetiche non sono limitate
alle ibridazioni DNA-DNA ma anche DNA- RNA e RNARNA
• Le procedure diagnostiche che prevedono l’utilizzo di
sonde sono più facilmente utilizzabili rispetto a quelle di
amplificazione anche se la sensibilità è inferiore .
• Le infezioni più idonee per essere diagnosticate con queste
tecniche sono quelle in cui i patogeni sono difficili da
coltivare.
Metodiche a sonda di Dna
• Si dividono in tre categorie :
1. Ibridazione in fase solida,
2. Ibridazione in fase liquida,
3. Ibridazione in situ
Ibridazione in fase solida
• Ibridazione su filtro
1. Il Dna cromosomico o plasmidico è denaturato ed
immobilizzato su filtro
2. La sonda (DNA a singolo filamento marcato con
digossigenina) viene fatta reagire con il DNA
presente sul filtro
3. Se sono presenti sequenze omologhe ibridizza
4. L’ibridizzazione si rivela con un test appropriato
utilizzando un anticorpo anti digossigenina
marcato con la fosfatasi alcalina
Ibridazione in fase solida
Degli 8 campioni saggiati solo 3 sono positivi
IBRIDAZIONE
SLOT-BLOT, COLONY-BLOT
ADSORBIMENTO
SU FILTRO
SOSPENSIONE
CELLULE
O DNA CEPPI
ISOLATI
DENATUR
IBRIDAZIONE
SONDA
MARCATA
RIVELAZIONE SU
LASTRA
Ibridazione in fase liquida
• In questo caso sia l’acido nucleico bersaglio
sia la sonda sono risospesi in una soluzione
acquosa
• La rivelazione avverrà mediante analisi
elettroforetica su gel di agarosio
IBRIDAZIONE
IN FASE LIQUIDA
ESTRAZIONE DNA
TOTALE DAL
CAMPIONE
DENATURAZIONE
DEL DNA
IBRIDAZIONE
CON SONDA
SPECIFICA
DIGESTIONE CON
NUCLEASI S 1
DEL DNA
MONOCATENARIO
1
2
3
ANALISI
ELETTROFORETICA
4
1= MW MARKER
2=CAMPIONE NEGATIVO
3=CAMPIONE POSITIVO
4=DNA CONTROLLO
Figura 5.30
Ibridazione in situ
• È un tipo particolare di ibridazione in cui viene
conservata la morfologia delle cellule o del tessuto
da analizzare
• Viene utilizzata in particolare per analizzare
tessuti
• I limiti sono la difficoltà delle sonde a penetrare
all’interno dei tessuti più sono piccole più è facile,
• Le sonde sono marcate con la FISH (Fluorescent
in situ Hybridation)
Ibridazione in situ FISH
(Fluorescent In situ Hybridization)
2 cellule macrofagiche infettate da C. pneumoniae trattata con
sonda per l’ RNA 16S del batterio. La sonda è marcata con
fluorocromo Cy3 che dà un segnale rosso.
Ibridazione in situ
Epatociti di hamster infettato con C. pneumoniae. In questo caso la
sonda è marcata con 5.6 carbossifluorescina che dà un segnale verde
Amplificazione del segnale di
ibridazione
• In questo caso si cerca di amplificare il
segnale generato dalla sonda ibridata
• L’amplificazione del segnale di ibridazione
ha il vantaggio di non coinvolgere né
l’acido nucleico né la sonda evitando
possibili contaminazioni
Metodiche di amplificazione del
segnale di ibridazione
• Branched DNA, utilizza come bersaglio gli acidi
nucleici che vengono estratti e catturati mediante
ibridazione con diverse sonde a cui segue ulteriori
ibridazioni
• Hybrid capture, Utilizzato per alcuni virus dopo
l’estrazione del genoma si effettua una ibridazione
con RNA. L’ibrido DNA/RNA è rilevato
aggiungendo anticorpi specifici marcati con
fosfatasi
Amplificazione del segnale di ibridazione
secondo il sistema Branched DNA
• Non c’è estrazione del genoma virale ma si procede con
una lisi del virus
• Il genoma rilasciato è catturato e fissato su pozzetti
mediante ibridazione con delle sonde “capture probes” e
“extender probes”
• Queste si ibridizzano a loro volta con sonde di
preamplificazione che a loro volta si legano a sonde di
amplificazione a pettine
• Sonde con fosfatasi alcalina si legano alle sonde di DNA a
pettine ,e in seguito l’aggiunta di un substrato si legge la
reazione chemioluminescente
Amplificazione del segnale di ibridazione
secondo il sistema Branched DNA
Hibrid capture
Estrazione del genoma virale, ibridazione in fase liquida con sonda a
RNA , l’ibrido è catturato su un supporto solido mediante un anticorpo
specifico, i frammenti DNA-RNA vengono rilevati con altri anticorpi
marcati con fosfatasi che legano i siti liberi degli ibridi
Metodiche di amplificazione
degli acidi nucleici
• Le metodiche più utilizzate ai fini diagnostici
sono:
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
• TMA (Transcription Mediated Amplification)
• NASBA (Nucleic acid Sequence-Based
amplification)
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
• Metodo con cui una sequenza di acido nucleico viene
amplificata esponenzialmente in vitro.
• Può essere usata anche per modificare la sequenza amplificata
o per aggiungere nuova informazione di sequenza.
• Le estremità della sequenza da amplificare devono essere note,
per sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad
esse, per dare inizio alla reazione.
• Non è necessario che la sequenza sia inizialmente presente in
forma pura.
• La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente
come una molecola discreta oppure può essere parte di una
molecola più grande.
• In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola
discreta di dsDNA con estremità corrispondenti a quelle 5’
degli oligomeri utilizzati.
Altre metodiche di amplificazione degli
acidi nucleici
• TMA (Transcription
Mediated
Amplification) è un
metodo di
amplificazione
dell’RNA bersaglio che
utilizza la transcriptasi
inversa e la T7
polimerasi e due primer
Schema operativo TMA
La metodica è autocatalitica avviene a 41,5 °C, prevede una
incubazione a 60°C, per permettere l’ibridazione del primer, se
l’acido nucleico è il DNA la temperatura di denaturazione è 95100°C
Metodica NSBA (Nucleic acid Sequence-Based
amplification)
Si differenzia dalla
precedente solo per la
assenza di attività
RNAasica della
transciptasi inversa .
In questo caso è
necessario anche
aggiungere un terzo
enzima RNAasi H
per far avvenire la
reazione
Vantaggi delle metodiche descritte
1. Rapidità di esecuzione
2. Tutte le fasi avvengono in un’unica
provetta e senza lavaggi
3. Il prodotto di amplificazione è costituito da
RNA meno resistente alla degradazione
rispetto al DNA ottenuto alla fine della PCR
Rivelazione post amplificazione
Esistono differenti metodi di rivelazione:
1. Elettroforesi su gel di agarosio
2. Cattura del prodotto di amplificazione
3. Rivelazione mediante test di protezione
dell’ibridazione (HPA)
1. Elettroforesi su gel di agarosio
2. Cattura del prodotto di
amplificazione
• Si utilizzano sonde adese su piastre a 96
pozzetti o a biglie magnetiche
• Durante la fase di amplificazione i primer in
posizione 5’ si legano ad un enzima la
biotina
• Si aggiunge un substrato e si legge la
reazione colorimetrica
3. Rivelazione mediante test di
protezione dell’ibridazione (HPA)
• HPA (Hybridation Protection Assay)
• Ibridazione dell’amplificato con sonde
chemioluminescenti a singola elica
complementari marcate con estere di
acridinio (AE)
• Lettura con un luminometro
HPA (Hybridation Protection Assay)
