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6746 BROWN Iniziali I-XIV
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Indice
Parte I
I principi fondamentali della clonazione dei geni e dell’analisi del DNA
Capitolo 1
L’importanza della clonazione dei geni e dell’analisi del DNA
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Le prime fasi dello sviluppo della genetica
L’avvento della clonazione dei geni e della reazione a catena della polimerasi
Che cos’è la clonazione dei geni?
Che cos’è la PCR?
Perché la clonazione dei geni e la PCR sono così importanti?
1.5.1 Isolamento dei geni mediante clonazione
1.5.2 Isolamento dei geni mediante PCR
1.6 In che modo orientarsi in questo libro
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Capitolo 2
Vettori per la clonazione dei geni: plasmidi e batteriofagi
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2.1 I plasmidi
2.1.1 Caratteristiche fondamentali dei plasmidi
2.1.2 Dimensioni e numero di copie
2.1.3 Coniugazione e compatibilità
2.1.4 Classificazione dei plasmidi
2.1.5 Plasmidi di organismi diversi dai batteri
2.2 I batteriofagi
2.2.1 Le caratteristiche fondamentali dei batteriofagi
2.2.2 I fagi lisogeni
2.2.3 I virus come vettori di clonaggio in altri organismi
Letture ulteriori
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Capitolo 3
Purificazione di DNA da cellule vive
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3.1 Preparazione di DNA cellulare totale
3.1.1 Crescita e raccolta di una coltura batterica
3.1.2 Preparazione di un estratto cellulare
3.1.3 Purificazione del DNA da un estratto cellulare
3.1.4 Concentrazione dei campioni di DNA
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3.1.5 Misurazione della concentrazione del DNA
3.1.6 Altri metodi di preparazione di DNA cellulare totale
3.2 Preparazione di DNA plasmidico
3.2.1 Separazione in base alle dimensioni
3.2.2 Separazione in base alla conformazione
3.2.3 Amplificazione del plasmide
3.3 Preparazione del DNA di batteriofago
3.3.1 Crescita delle colture per ottenere un alto titolo di 3.3.2 Preparazione di fagi non lisogeni
3.3.3 Raccolta dei fagi da una coltura infettata
3.3.4 Purificazione del DNA da particelle di fago 3.3.5 La purificazione del DNA di M13 pone pochi problemi
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Capitolo 4
Manipolazione di DNA purificato
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4.1 La gamma degli enzimi di manipolazione del DNA
4.1.1 Nucleasi
4.1.2 Ligasi
4.1.3 Polimerasi
4.1.4 Enzimi di modificazione del DNA
4.1.5 Topoisomerasi
4.2 Gli enzimi che tagliano il DNA – le endonucleasi di restrizione
4.2.1 La scoperta e la funzione delle endonucleasi di restrizione
4.2.2 Le endonucleasi di restrizione di tipo II tagliano il DNA a livello di sequenze
nucleotidiche specifiche
4.2.3 Estremità nette ed estremità coesive
4.2.4 La frequenza delle sequenze di riconoscimento in una molecola di DNA
4.2.5 Esecuzione di una digestione di restrizione in laboratorio
4.2.6 Analisi del risultato del taglio delle endonucleasi di restrizione
4.2.7 Stima delle dimensioni delle molecole di DNA
4.2.8 Mappatura delle posizioni di siti di restrizione diversi in una molecola di DNA
4.3 La legatura – l’unione di molecole di DNA
4.3.1 Il meccanismo di azione della DNA ligasi
4.3.2 Le estremità coesive fanno aumentare l’efficienza della legatura
4.3.3 Aggiunta di estremità coesive a una molecola a estremità nette
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Capitolo 5
Introduzione di DNA in cellule vive
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5.1 Trasformazione – l’assunzione di DNA da parte di cellule batteriche
5.1.1 Non tutte le specie batteriche assumono DNA con la stessa efficienza
5.1.2 Preparazione di cellule competenti di E. coli
5.1.3 Selezione delle cellule trasformate
5.2 Identificazione dei ricombinanti
5.2.1 Selezione dei ricombinanti con pBR322 – inattivazione inserzionale
di un gene della resistenza a un antibiotico
5.2.2 L’inattivazione inserzionale non riguarda sempre la resistenza agli antibiotici
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5.3 Introduzione di DNA fagico in cellule batteriche
5.3.1 Trasfezione
5.3.2 Packaging in vitro di vettori di clonaggio 5.3.3 L’infezione fagica si visualizza sotto forma di placche su un mezzo di agar
5.4 Identificazione di fagi ricombinanti
5.4.1 Inattivazione inserzionale di un gene lacZ ⬘portato dal vettore fagico
5.4.2 Inattivazione inserzionale del gene cI di 5.4.3 Selezione mediante utilizzo del fenotipo Spi
5.4.4 Selezione in base alle dimensioni del genoma di 5.5 Introduzione di DNA in cellule non batteriche
5.5.1 Trasformazione di singole cellule
5.5.2 Trasformazione di interi organismi
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Capitolo 6
Vettori di clonaggio per E. coli
101
6.1 Vettori di clonaggio basati su plasmidi di E. coli
6.1.1 La nomenclatura dei vettori di clonaggio plasmidici
6.1.2 Le proprietà utili di pBR322
6.1.3 Il pedigree di pBR322
6.1.4 Vettori di clonaggio plasmidici di E. coli più sofisticati
6.2 Vettori di clonaggio basati sul batteriofago M13
6.2.1 Sviluppo dei vettori di clonaggio M13
6.2.2 Vettori ibridi plasmide-M13
6.3 Vettori di clonaggio basati sul batteriofago 6.3.1 Segmenti del genoma di possono essere deleti senza alterarne la vitalità
6.3.2 Si può usare la selezione naturale per isolare modificato privo di certi siti
di restrizione
6.3.3 Vettori di inserzione e di sostituzione
6.3.4 Esperimenti di clonazione con vettori di inserzione o di sostituzione
6.3.5 Usando un cosmide si possono clonare lunghi frammenti di DNA
6.4 I vettori e altri vettori ad alta capacità permettono la costruzione di librerie
genomiche
6.5 Vettori per altri batteri
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Letture ulteriori
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Capitolo 7
Vettori di clonaggio per gli eucarioti
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7.1 Vettori per lievito e altri funghi
7.1.1 Marcatori selezionabili per il plasmide da 2 m
7.1.2 Vettori basati sul plasmide da 2 m – plasmidi episomici di lievito
7.1.3 Uno YEp si può inserire nel DNA cromosomico del lievito
7.1.4 Altri tipi di vettori di clonaggio di lievito
7.1.5 I cromosomi artificiali possono essere usati per clonare lunghi frammenti
di DNA nel lievito
7.1.6 Vettori per altri lieviti e per i funghi
7.2 Vettori di clonaggio per le piante superiori
7.2.1 Agrobacterium tumefaciens – l’ingegnere genetico più piccolo esistente in natura
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7.2.2 Clonazione di geni nelle piante mediante trasferimento genico diretto
7.2.3 I tentativi di usare virus vegetali come vettori di clonaggio
7.3 Vettori di clonaggio per gli animali
7.3.1 Vettori di clonaggio per gli insetti
7.3.2 La clonazione nei mammiferi
Letture ulteriori
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Capitolo 8
Il modo in cui si ottiene un clone di un gene specifico
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8.1 Il problema della selezione
8.1.1 Esistono due strategie fondamentali per ottenere il clone desiderato
8.2 Selezione diretta
8.2.1 La sopravvivenza dovuta al marcatore estende le applicazioni della selezione diretta
8.2.2 Gli scopi e le limitazioni della sopravvivenza dovuta al marcatore
8.3 Identificazione di un clone in una libreria di geni
8.3.1 Librerie di geni
8.3.2 Non tutti i geni sono espressi contemporaneamente
8.3.3 L’mRNA può essere clonato come DNA complementare
8.4 Metodi per identificare il clone
8.4.1 I filamenti complementari di acido nucleico ibridano fra loro
8.4.2 Sondaggio di colonie e placche mediante ibridazione
8.4.3 Esempi dell’uso pratico del sondaggio mediante ibridazione
8.4.4 Metodi di identificazione basati sulla rivelazione del prodotto della traduzione
del gene clonato
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Letture ulteriori
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Capitolo 9
La reazione a catena della polimerasi
171
9.1 I principi generali della reazione a catena della polimerasi
9.2 La PCR in maggiori dettagli
9.2.1 Il progetto dei primer oligonucleotidici per una PCR
9.2.2 Scelta delle temperature corrette
9.2.3 Dopo la PCR: studio dei prodotti della PCR
9.3 I problemi dovuti alla frequenza di errore della Taq polimerasi
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Parte II
Le applicazioni della clonazione dei geni e dell’analisi del DNA nella ricerca
Capitolo 10
Lo studio della posizione e della struttura dei geni
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10.1 Il modo in cui si studia la posizione di un gene
10.1.1 Individuazione della posizione di un gene su una piccola molecola di DNA
10.1.2 Determinazione della posizione di un gene su una grande molecola di DNA
10.2 Il sequenziamento del DNA – la definizione della struttura di un gene
10.2.1 Il metodo di Sanger-Coulson – nucleotidi che terminano la catena
10.2.2 Sequenziamento automatizzato del DNA
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10.2.6
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Sequenziamento dei prodotti della PCR
Il metodo di Maxam-Gilbert – degradazione chimica del DNA
Costruzione di una lunga sequenza di DNA
I risultati ottenuti con il sequenziamento del DNA
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Letture ulteriori
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Capitolo 11
Studio dell’espressione e della funzione dei geni
206
11.1 Studio del trascritto di un gene clonato
11.1.1 Microscopia elettronica di molecole di acidi nucleici
11.1.2 Analisi degli ibridi DNA-RNA mediante trattamento con nucleasi
11.1.3 Analisi del trascritto mediante estensione del primer
11.1.4 Altre tecniche per lo studio dei trascritti di RNA
11.2 Studio della regolazione dell’espressione genica
11.2.1 Identificazione dei siti di legame di proteine su una molecola di DNA
11.2.2 Identificazione delle sequenze di controllo mediante analisi delle delezioni
11.3 Identificazione e studio del prodotto della traduzione di un gene clonato
11.3.1 HRT e HART possono identificare il prodotto della traduzione di un gene
clonato
11.3.2 Analisi delle proteine mediante mutagenesi in vitro
11.3.3 Studio delle interazioni proteina-proteina
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Letture ulteriori
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Capitolo 12
Lo studio dei genomi
236
12.1 La genomica – il modo in cui si sequenzia un genoma
12.1.1 L’approccio a shotgun al sequenziamento del genoma
12.1.2 L’approccio dei contig di cloni
12.1.3 Uso di una mappa per assistere l’assemblaggio della sequenza
12.2 La postgenomica – il tentativo di comprendere una sequenza genomica
12.2.1 Identificazione dei geni in una sequenza genomica
12.2.2 Determinazione della funzione di un gene sconosciuto
12.3 Lo studio del trascrittoma e del proteoma
12.3.1 Lo studio del trascrittoma
12.3.2 Lo studio del proteoma
Letture ulteriori
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Parte III
Le applicazioni della clonazione dei geni e dell’analisi del DNA in biotecnologia
Capitolo 13
Produzione di proteine a partire da geni clonati
261
13.1 Vettori speciali per l’espressione di geni estranei in E. coli
13.1.1 Il promotore è il componente cruciale di un vettore di espressione
13.1.2 Cassette e fusioni di geni
13.2 Problemi generali inerenti alla produzione di proteine ricombinanti in E. coli
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13.2.1 Problemi derivanti dalla sequenza del gene estraneo
13.2.2 Problemi causati da E. coli
13.3 Produzione di proteine ricombinanti in cellule eucariotiche
13.3.1 Proteine ricombinanti da lievito e funghi filamentosi
13.3.2 Uso di cellule animali per la produzione di proteine ricombinanti
13.3.3 Pharming – proteine ricombinanti da animali e vegetali vivi
Letture ulteriori
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283
Capitolo 14
Clonazione di geni e analisi del DNA in medicina
284
14.1 Produzione di farmaci ricombinanti
14.1.1 Insulina ricombinante
14.1.2 Sintesi degli ormoni umani della crescita in E. coli
14.1.3 Fattore VIII ricombinante
14.1.4 Sintesi di altre proteine ricombinanti umane
14.1.5 Vaccini ricombinanti
14.2 Identificazione di geni responsabili di malattie umane
14.2.1 Identificazione di un gene di una malattia genetica
14.3 Terapia genica
14.3.1 Terapia genica di malattie ereditarie
14.3.2 Terapia genica e cancro
14.3.3 I problemi etici sollevati dalla terapia genica
Letture ulteriori
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Capitolo 15
Clonazione dei geni e analisi del DNA in agricoltura
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15.1 L’approccio dell’aggiunta di geni all’ingegneria genetica delle piante
15.1.1 Piante che producono i propri insetticidi
15.1.2 Piante resistenti agli erbicidi
15.1.3 Altri progetti di aggiunta di geni
15.2 Sottrazione di geni
15.2.1 Il principio alla base della tecnologia antisenso
15.2.2 RNA antisenso e ingegnerizzazione della maturazione dei pomodori
15.2.3 Altri esempi dell’uso di RNA antisenso nell’ingegneria genetica delle piante
15.3 I problemi delle piante modificate geneticamente
15.3.1 Problemi di sicurezza con i marcatori selezionabili
15.3.2 La tecnologia del terminatore
15.3.3 La possibilità di effetti dannosi sull’ambiente
Letture ulteriori
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Capitolo 16
Clonazione dei geni e analisi del DNA in medicina legale e archeologia
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16.1 L’analisi del DNA nell’identificazione di sospetti criminali
16.1.1 Fingerprinting genetico mediante sondaggio di ibridazione
16.1.2 Determinazione del profilo del DNA mediante PCR di brevi ripetizioni
in tandem
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Pagina XIII
1. L’importanza della clonazione dei geni e dell’analisi del DNA
16.2 Studi delle relazioni di parentela mediante determinazione del profilo del DNA
16.2.1 Individui correlati hanno profili di DNA simili
16.2.2 Determinazione del profilo del DNA e le spoglie dei Romanov
16.3 Identificazione del sesso mediante analisi del DNA
16.3.1 PCR dirette a sequenze specifiche del cromosoma Y
16.3.2 PCR del gene della amelogenina
16.4 Archeogenetica – uso del DNA per lo studio dell’evoluzione umana
16.4.1 Le origini degli esseri umani moderni
16.4.2 Il DNA può essere usato anche per studiare le migrazioni degli esseri umani
nella preistoria
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Letture ulteriori
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Glossario
Indice analitico
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