“Modelli di valutazione rischio-benefico in sicurezza alimentare”
ISS - Roma, 23 giugno 2009
L’effetto matrice nelle interazioni
tra fattori nutrizionali e non nutrizionali
Stefano LORENZETTI
[email protected]
ISS - Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto di Tossicologia Animale e Veterinaria
Molecole bioattive presenti negli alimenti: NUTRIENTI e NON NUTRIENTI
ALIMENTI - componenti nutrizionali:
¾ macro-nutrienti (carboidrati, lipidi e proteine);
¾ micro-nutrienti (vitamine, sali minerali).
* Carenze e/o eccessi nutrizionali di macro- e micro-nutrienti hanno ben noti
effetti sulla salute umana e sono spesso associati a ben definite malattie.
ALIMENTI – molecole biologicamente attive: diverse dai micro-nutrienti e
definite come non nutrienti o interferenti endocrini di origine naturale (p.es. i
fitoestrogeni o polifenoli)…
* … a differenza dei micro-nutrienti non se ne conoscono malattie da carenza!!!
9 Potenziali effetti benefici sulla salute sono ampiamente reclamizzati sia per i
NUTRIENTI (in particolare micro-nutrienti) che per i NON NUTRIENTI…
9 Assenza valutazione rischio-beneficio
NUTRIENTI (p.es. supplementazione )
per
sovraesposizione
a
NON
Molecole bioattive presenti negli alimenti assunte sotto forma di INTEGRATORI
¾ “dietary supplements” ( legge U.S.A.)
"un prodotto (diverso dal tabacco) destinato ad integrare l'alimentazione, contenente o composto da:
a) vitamine,
b) minerali,
c) erbe o altri prodotti vegetali,
d) aminoacidi,
e) sostanze alimentari per uso umano atte ad aumentarne il consumo totale,
f) un concentrato, un prodotto metabolico, un costituente, un estratto o una combinazione degli ingredienti sopra
descritti (lettere a, b, c, d, e,) . . . “
La legge USA è chiara nel constatare che gli integratori sono alimenti e sono così soggetti alle leggi
sugli alimenti. La legge specifica che non sono da considerarsi né medicinali, né additivi.
NB: In Germania vengono regolamentati come farmaci (maggiore tutela per i
cittadini tedeschi dal punto di vista della sicurezza e degli effetti avversi).
12.7.2002 (IT) Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 183/51
DIRETTIVA 2002/46/CE DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO - 10 giugno 2002
per il riavvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative agli integratori alimentari
Art. 2 “«integratori alimentari»: i prodotti alimentari destinati ad integrare la dieta normale e che costituiscono
una fonte concentrata di sostanze nutritive o di altre sostanze aventi un effetto nutritivo o fisiologico, sia
monocomposti che pluricomposti, in forme di dosaggio, vale a dire in forme di commercializzazione quali capsule,
pastiglie, compresse, pillole e simili, polveri in bustina, liquidi contenuti in fiale, flaconi a contagocce e altre forme
simili, di liquidi e polveri destinati ad essere assunti in piccoli quantitativi unitari;”
Art. 2 “«sostanze nutritive» o «nutrienti»: le seguenti sostanze:
i) le vitamine;
ii) i minerali.”
(vedi allegati I e II)
…
“Esiste un’ampia gamma di sostanze nutritive e di altri elementi che possono far parte
della composizione degli integratori alimentari, ed in particolare, ma non in via esclusiva
vitamine, minerali, aminoacidi, acidi grassi essenziali, fibre ed estratti di origine vegetale.”
Molecole bioattive presenti negli alimenti: CONTAMINANTI ALIMENTARI
CONTAMINANTI – altre molecole biologicamente attive (in)volontariamente
presenti negli alimenti: interferenti endocrini di origine antropogenica (p.es.
residui di fitofarmaci o sostanze ad azione steroidea o steroide-simile)
9 Potenziali effetti dannosi sulla salute sia per azione diretta che tramite interazione con le
molecole bioattive naturalmente presenti negli alimenti
¾ 2001. Analisi dei prodotti di 215 diversi fornitori (13 stati) da parte del CIO (comitato olimpico
internazionale): 94 (14,8%) campioni contenenti sostanze dopanti non dichiarate nell’etichetta.
Stati
N° integratori
testati
N° di
“positivi”
% di
“positivi”
Olanda
Austria
GB
USA
Italia
Spagna
Germania
Belgio
Francia
Norvegia
Svizzera
Svezia
Ungheria
Totale
31
22
37
240
35
29
129
30
30
30
13
6
2
634
8
5
7
45
5
4
15
2
2
1
94
25.8%
22.7%
18.9%
18.8%
14.3%
13.8%
11.6%
6.7%
6.7%
3.3%
14.8%
11 diversi STERODI ANABOLIZZANTI
(precursori del TESTOSTERONE E DEL
NANDROLONE).
Non sono stati pubblicati i nomi dei prodotti
positivi.
9 residui della lavorazione potenzialmente
tossici o sostanze dopanti aggiunte in piccole
dosi per aumentare l’efficacia del prodotto ?!
Interazioni molecolari di molecole alimentari bioattive:
sostanze bioattive e legami aspecifici con proteine presenti negli alimenti
Plasma antioxidants from chocolate
Total Antioxidant Capacity (TAC)
as ferric-reducing antioxidant potential
Nature (2003) 424:1013
SCOPO:
In soggetti umani in buona salute,
valutazione della capacità antiossidante totale (TAC)
e dei livelli dell’epi-catechina
confrontando cioccolato puro (DC), cioccolato
puro+latte (DC + MK) e cioccolato al latte (MC)
RISULTATO:
¾ Dopo 1 hr dall’ingestione di DC, la TAC plasmatica
è del 20% superiore a quella di MC e DC+MC;
¾ I livelli plasmatici di epicatechina si abbassano di
circa il 46% in DC+MC e di circa il 69% in MC.
I livelli plasmatici di una molecola bioattiva
dipendono ANCHE dalla interazione con altri fattori
nutritivi
DC
MC
Mean (-)epicatechin levels
Interazioni molecolari complesse: β-carotene (pro-vitamina A), condensato di sigaretta
e pressione dell’ossigeno nei tessuti bersaglio (1)
Il fumo di sigaretta contiene una miscela di più di 4000 sostanze chimiche, molte
delle quali bioattive e interagenti in particolare con i micronutrienti assunti mediante
la dieta, p.es. vitamina C, acido folico, β-carotene, Zn++, Se++, etc...
Un alto consumo di frutta e verdura e un alto livello plasmatico di β-carotene sono
associato con un minor rischio di malattie croniche quali i tumori, in particolare del
polmone.
Interazioni molecolari complesse: β-carotene (pro-vitamina A), condensato di sigaretta
e pressione dell’ossigeno nei tessuti bersaglio (2)
Il β-carotene è uno “scavenger” liposolubile di radicali liberi le cui proprietà antiossidanti in vivo dipendono dal livello di tensione dell’ossigeno.
β-carotene anti-OX
Danno lipidico (lipid peroxidation) in polmoni di ratto
pO2 polmone = circa 105-150 mmHg
pO2 altri tessuti = da 5 a 71 mmHg
loss of anti-OX properties
β-carotene pro-OX
9 All’aumentare della tensione di ossigeno (pO2 da
15 a 150 mmHg), il β-carotene non previene più il
danno lipidico nel polmone del condensato di
sigaretta (TAR) ma addirittura lo amplifica !
Palozza et al., 2006, Carcinogenesis 27:2383–2391
Interazioni molecolari complesse: β-carotene (pro-vitamina A), condensato di sigaretta
e pressione dell’ossigeno nei tessuti bersaglio (3)
I livelli plasmatici di β-carotene sono inversamente proporzionali alla quantità di
sigarette fumate::
β-carotene
β-carotene (μmol/l) increase
(μmol/l)
each 1 mg dietary uptake
Non smokers
0.72
+ 0.04
Lightiest smokers
(< 10 cigarette/day)
0.48
+ 0.01
Heaviest smokers
(> 20 cigarette/day)
0.37
Ex smokers
0.58
---
In vitro e in vivo, il β-carotene agisce come anti-carcinogeno, MA
i suoi prodotti ossidati possono facilitare la carcinogenesi:
9 il fumo di tabacco è un potente ossidante capace di distruggere o ossidare il βcarotene;
9 a loro volta, i metaboliti ossidati del β-carotene stimolano il legame al DNA dei
metaboliti del benzopirene aumentando così il rischio di danno al genoma e quindi il
rischio di tumore.
9 Di conseguenza, un eventuale supplementazione di β-carotene in fumatori può
risultare nociva alla salute !
Northrop-Clewes & Thurnham (2007) Clinica Chimica Acta 377:14–38
Effetti biologici di molecole alimentari bioattive: alimento versus integratore
“Orange juice vs vitamin C:
effect on hydrogen peroxide-induced DNA damage
in mononuclear blood cells”.
Br J Nutr. (2007) 97(4):639-643
SCOPO: In soggetti umani in buona salute, valutazione dell’effetto antiossidante confrontando
l’assunzione di vit. C da una singola porzione di succo di frutta d’arancia (300 ml contenente 150 mg
vit. C) e da una bevanda supplementata della stessa quantità di vit. C.
Effetto antiossidante considerato: danneggiamento in vitro del DNA indotto da perossido di idrogeno in
cellule mononucleari del sangue (MNBC).
RISULTATI analisi HPLC:
9 La concentrazione plasmatica di vit. C aumentata in maniera analoga.
RISULTATI esperimento DNA damage (dopo vit.C intake):
¾ Significativamente diminuito dopo 3 ore dall’assunzione del succo di frutta
d’arancia (circa 18 %; P < 0.01) e costante per circa 24 ore (circa 16 %; P < 0.01).
¾ Nessun effetto osservato nella bevanda supplementata.
9 Effetto protettivo non spiegabile con la sola presenza di vit. C:
altre sostanze bioattive coinvolte o effetto matrice ?
Effetti biologici di molecole alimentari bioattive: alimento versus integratore
IL CASO DEL LICOPENE (1)
Il licopene, un carotenoide antiossidante e antiproliferativo, è stato ipotizzato
essere il responsabile degli effetti benefici dei pomodori.
Porrini M et al., 2005. British Journal of Nutrition 93:93
Daily intake (26 days) of a formulated tomato
drink (Lyc-o-Mato®) affects carotenoid plasma
and lymphocyte concentrations and improves
cellular antioxidant protection
Lymphoctye DNA damage after ex vivo treatment with
H2O2 (500 μmol/l) evaluated by the comet assay (% DNA
in tail) (n 24, means±s.d.) before and after each
intervention period. (■) before placebo; (□) after placebo;
(■) before Lyc-o-mato; (░) after Lyc-o-mato.
* Significantly different from each other points (P<0.0001)
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
BEVANDE ALCOLICHE E DIABETE DI TIPO 2: RISCHIO RELATIVO
Koppes et al., 2005: prima meta-analisi (15 diversi studi di coorte) la relazione tra
consumo di alcool e diabete di tipo 2 (RR).
U-shaped relationship con una significativa riduzione del 30% circa del RR nei
consumatori di alcool (6-48 gr al giorno) rispetto ai consumatori forti o ai non
consumatori.
In assenza di studi di intervento randomizzati a lungo-termine, questa può essere
considerata la migliore evidenza disponibile.
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
ESTRATTI VEGETALI ED EFFETTI ANTI-DIABETICI
Circa 400 estratti vegetali conosciuti per il trattamento del diabete di cui solo pochissimi
hanno ricevuto un’attenzione medico-scientifica per valutarne l’efficacia.
Dey et al., 2002, Altern Med Rev, 7(1):45-58
Gli effetti ipoglicemici di alcuni di questi estratti vegetali (p.es. piante contenenti
epicatechine, alcuni frutti di bosco, agli e cipolle) sono stati confermati in modelli
sperimentali in vivo di diabete di tipo 2 tanto da convincere un comitato di esperti del WHO
che “traditional medicinal herbs be further investigated”
Bailey & Day, 1989, Diabetes Care, 12:553-564.
Animali diabetici trattati con epicatechine hanno una migliore funzione pancreatica (cellule β)
Chakravarthy et al., Lancet 1981 & Life Sci 1982
NB
Epicatenine contenute anche nel vino rosso
così come il resveratrolo (frutti di bosco) e la quercetina (cipolle)
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche: effetti biologici
CLASSIFICAZIONE DEI FITOESTROGENI
ISOFLAVONES (IFs)
Genistein, Daidzein, Glycitein,
Formononetin, Biochanin A,
(others)
FLAVONOLS
Quercetin, Kaempferol, Rutin, (others)
IFs-PRECURSORS
Deoxybenzoins
IFs-METABOLYTES
Equol, (others)
FLAVONES
Apigenin, Luteolin, (others)
FLAVONOIDS
FLAVANONES
Naringenin, Hesperidin, (others)
FLAVANOLS / CATECHINS
Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), (others)
ANTHOCYANINS / STILBENES
Cyanidin-3-glycoside (C3G) or kuromanin,
trans-resveratrol, (others)
PHYTOESTROGENS
COUMESTANS
Coumestrol, (others)
PRENYL-FLAVONOIDS
8-prenylnaringenin,
Xanthohumol, Isoxanthohumol, (others)
NON - FLAVONOIDS
Lorenzetti, NUTRAfoods 2005, 4(4):29-44
PLANT LIGNANS
Matairesinol, Isolariciresinol,
Secoisolariciresinol,
Lariciresinol, Pinoresinol,
Syringaresinol, (others)
MAMMALIAN
LIGNANS
Enterodiol,
Enterolactone
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
FITOESTROGENI E BEVANDE ALCOLICHE (1)
FLAVONOLI PRENILATI
Xanthohumol e 8-prenyl-naringenina
Lo Xanthohumol si trova esclusivamente nel luppolo (0.1-1% of dry
weight) e la 8-prenyl-naringenina rappresenta il prenyl-flavonoide
bioattivo che si forma durante il processo di produzione della birra
(fino a 240 mg/l, in media meno di 20 mg/l (Stevens and Page, 2004).
8-prenyl-naringenina
FLAVONOLI
Quercetina
Pressochè ubiquitaria in frutta e vegetali.
Particolarmente abbondante in cipolle, mele, frutti di bosco e the (1025 mg/l) (Hertog et al., 1993).
Nel vino rosso tra 0.03 e 11.5 mg/ml (Paixao et al., 2008)
quercetina
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
FITOESTROGENI E BEVANDE ALCOLICHE
FLAVANOLI / CATECHINE
Epicatechine e epigallocatechine
Abbondanti nel the verde, ma anche nel cioccolato e nel vino rosso
dove possono raggiungere concentrazioni di 270 mg/l (Frankel et al.,
1995).
epicatechina
STILBENI
Resveratrolo (3,4',5-trihydroxy-trans-stilbene)
Principalmente in uva e vino rosso.
Nelle uve, il trans-resveratrolo (l’isomero bioattivo) si trova solo
nelle bucce per cui il contenuto nel vino rosso è proporzionale ai
tempi di fermentazione.
Il contenuto di trans-resveratrolo nel vino rosso oscilla tra 0.1-15 mg/l
(Fremont, 2000; Cornwell et al., 2004; Opie and Lecour, 2007) e la sua
variabilità dipende da cultivar, condizioni pedo-climatiche, pratiche
enologiche e presenza di funghi del genere Botrytis (Fremont, 2000).
LIGNANI
Soprattutto negli oli di semi ma a bassi livelli presenti nei cereali e
negli alimenti derivati
resveratrolo
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
MECCANISMI D’AZIONE CLASSICI DEI FITOESTROGENI
“ …any plant substance or metabolite that
induces biological responses in vertebrates and
can mimic or modulate the actions of
endogenous oestrogens usually by binding to
estrogen receptors.” (COT Report 2003 on
Phytoestrogens and Health - UK Food Standard
Agency)
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE: EFFETTI IN UN MODELLO ANIMALE
Modello sperimentale: ratti con diabete di tipo 2 indotto da streptozotocina(STZ)nicotinamide (Pellegrino et al., 1998)
The diabetic syndrome in rats administered STZ and nicotinamide is characterized by stable,
moderate hyperglycemia; glucose intolerance; and altered but significant glucose-stimulated insulin
secretion
Proprietà antidiabetiche del RESVERATROLO in ratti diabetici trattati oralmente con
RESV (5 mg kg−1 b.w d−1) per 30 giorni:
(Palsamy & Subramanian, 2008, Biomed Pharmacother. 62(9):598-605)
significativa (p<0.05) riduzione di
glicemia, emoglobina glicosilata, uremia, acido urico
e creatinina sierici;
diminuita attività di enzimi pato-fisiologici
aspartate & alanine transaminases (AST &
ALT), e alkaline phosphatase (ALP);
miglioramento dei livelli plasmatici di
insulina e emoglobina
Risultati comparabili con quelli del farmaco ipoglicemico orale GLICLAZIDE
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (1)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetto dose-dipendente del resveratrolo (RESV) sui livelli plasmatici di GLUCOSIO
STZ-nicotinamide
STZ
CTRL
Durata effetto ipoglicemico tende a scomparire completamente dopo 5 ore
Su, H.-C. et al., 2006,Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E1339-E1346
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (2)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetto CRONICO del resveratrolo (RESV) sui livelli plasmatici di GLUCOSIO
STZ + veicolo
STZ + RESV
STZ-nicotinamide + veicolo
STZ-nicotinamide + RESV
I ratti trattati con STZ o con STZ-nicotinamide + 0,5 mg/kg BW pro die RESV
hanno una riduzione di circa il 22% e il 14% rispettivamente
Su, H.-C. et al., 2006,Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E1339-E1346
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (3)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetto del resveratrolo (RESV) sui livelli plasmatici di INSULINA
STZ-nicotinamide + veicolo
STZ-nicotinamide + RESV
I ratti trattati con STZ-nicotinamide + 0,5 mg/kg BW pro die RSV mostrano anche una
diminuzione significativa dei livelli plasmatici di insulina
Su, H.-C. et al., 2006, Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E1339-E1346
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (4)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetto del resveratrolo (RESV) sui livelli plasmatici di TRIGLICERIDI
STZ + veicolo
STZ + RESV
STZ-nicotinamide + veicolo
STZ-nicotinamide + RESV
Effetto ipolipidemico del RESV con riduzione significativa dei livelli plasmatici di
trigliceridi:
nei ratti STZ
circa 50% al giorno 14
nei ratti STZ-nicotinamide circa 33% al giorno 14
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (5)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetti del resveratrolo (RESV) sul PESO CORPOREO ed il CONSUMO DI CIBO e H2O
CTRL
STZ + RESV
STZ
STZ
STZ + RESV
CTRL
STZ
STZ + RESV
CTRL
Il trattamento con RESV ha un effetto positivo
Per tutti e 3 i parametri considerati
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE IN UN MODELLO ANIMALE (6)
Modello sperimentale:
ratti con diabete indotto da streptozotocina(STZ); STZ-nicotinamide
Effetti del resveratrolo (RESV) sull’ UPTAKE di GLUCOSIO in tessuti insulinaresponsive di ratti STZ
soleo
Il RESV migliora l’uptake di glucosio
in tutti e tre i tessuti considerati
(> 2 volte a 1 mM)
Stimolazione dose-dipendente della sintesi di
glicogeno negli epatociti di ratti STZ
epatociti
adipociti
Molecole bioattive non nutrienti presenti nelle bevande alcoliche:
RESVERATROLO E DIABETE: QUALE MEDIATORE?
Topi ER-α knock-out, sia maschi che femmine, presentano (Heine et al., PNAS 2000):
insulino-resistenza;
alterata tolleranza al glucosio;
iperplasia e ipertrofia degli adipociti
L’interazione E2-ER è fondamentale per l’omeostasi del glucosio.
Il RESV lega preferenzialmente ER-α (rispetto a ER-β) e induce l’attivazione (mediante
fosforilazione) di ER-α e l’attivazione genica ER-α mediata (p.es. GLUT4) nei tessuti
ERα-responsive
GRAZIE per la vostra attenzione
e…
a Voi le domande
