Perché la storia della biochimica nella didattica
Ho insegnato all'I.T.I.S. di Arezzo Chimica Organica , Biochimica nel corso Biologico Sanitario e Chimica delle Fermentazioni nel corso Chimici . Nelle prime due
discipline era prevista una intensa attività di laboratorio. Il programma dei corsi era
svolto ad un livello molto vicino a quello universitario . E' stata una esperienza di
insegnamento molto impegnativa , didatticamente ricca e interessante . Vorrei in
questo articolo riportare alcune riflessioni che ho maturato durante quegli anni di
insegnamento di Biochimica e Chimica delle Fermentazioni . Per prima cosa credo
di essermi fatto una idea precisa su come la Biochimica non deve essere insegnata .
Riporto , per farmi comprendere , un episodio a cui ho assistito durante un anno
scolastico . L'insegnante di biologia stava interrogando , durante l'ora di laboratorio,
un alunno nella saletta adiacente al laboratorio stesso. L'argomento della
interrogazione era la glicolisi . L'alunno doveva "mettere in fila " i dieci passaggi
della glicolisi citando di volta in volta i metaboliti coinvolti . Non era richiesta una
conoscenza della struttura chimica . L'alunno era in crisi , aveva difficoltà a
memorizzare . Il disappunto dell'insegnante era evidente . Il colloquio si concluse
con l'insegnante che allargando le braccia esclamava : " ma come si fa a non capire ,
è tanto semplice ! " . Vi chiederete se è l'insegnante di biologia che insegna la
biochimica . La biochimica è affrontata una prima volta nell'ambito della biologia
cellulare , che viene svolta al terzo anno del corso e il docente è un biologo . Il
nostro insegnante , protagonista della interrogazione , aveva
impostato
l'insegnamento della biochimica , in particolare delle vie metaboliche , richiedendo
una conoscenza solo nominale delle sostanze coinvolte. Le sostanze chimiche non
avevano una formula, era scomparso il criterio di identità di una sostanza .
Lo studio della glicolisi secondo il biologo
Una simile stortura scientifica , prima ancora che didattica , insinuava negli studenti
l'idea che nella cellula la chimica avesse un ruolo non precisato . Molte volte ho
constatato la difficoltà degli studenti a valutare il ruolo della chimica nella vita
cellulare quando li incontravo al quinto anno , dopo che essi avevano avuto un
simile impatto al terzo anno . Da notare che il nostro insegnante non era un caso
particolare , faceva invece parte di un approccio condiviso dagli insegnanti biologi .
Successivamente la biochimica viene ripresa al quinto anno del corso e questa volta
il docente è un chimico . Questa volta , voi direte , al quinto anno il chimico
insegnante metterà le cose al loro giusto posto . Le cose non sono invece così
semplici . Ma per spiegare in modo autorevole come l'approccio del chimico alla
biochimica non sia esente da limiti e passi falsi userò le parole di un grande
scienziato premio nobel Arthur Harden che ha vinto il Premio Nobel per la Chimica
nel 1929 , per le sue ricerche sulla glicolisi :
".......si è trovato che gli arseniati hanno il potere di stimolare molto l'effetto della
fosfatasi . Questa osservazione fu in realtà un premio non meritato al modo di
pensare strettamente chimico intorno ai problemi della biochimica . In molti tipi di
reazione chimiche il tipo di sostanze implicate è di importanza primaria , gli
arseniati reagiscono in modo simile ai fosfati, il potassio può essere sostituito dal
sodio , il ferro dal nichel o dal cobalto . In biochimica la differenza tra potassio e
sodio può essere la differenza tra la vita e la morte , e quando il ferro non è usato
nei pigmenti respiratori non è rimpiazzato dal nichel o dal cobalto, ma dal rame o
dal vanadio . Così anche l'arseniato non gioca una parte simile al fosfato nella
fermentazione , ma agisce in modo completamente diverso ... "
Harden è un chimico di formazione ma ha fatto un lungo tirocinio nei laboratori di
Biochimica . L'approccio alla biochimica richiede una conoscenza di problematiche
che il chimico non conosce . Allora quale è l'approccio che l'insegnante chimico ha
sulla biochimica ? Se rimaniamo nel campo delle vie metaboliche come la glicolisi ,
ecco cosa farà imparare agli studenti :
Lo studio della glicolisi secondo il chimico
Certamente il linguaggio ora è diverso , le sostanze compaiono con le loro
formule , e le loro trasformazioni sono apprezzabili . Tuttavia anche qui siamo di
fronte ad una acquisizione che è nel complesso mnemonica . Ma come si passa da
un intermedio ad un altro ? Quale è il meccanismo delle reazioni ? Queste domande
fanno affacciare alla ribalta i grandi protagonisti di queste trasformazioni , cioè le
proteine - enzimi . Un chimico organico ha la sensazione , di fronte a questi nuovi
protagonisti , che il terreno gli manchi sotto i piedi . Abituato a seguire i cammini
delle trasformazioni delle sostanze organiche con collaudati e concreti meccanismi ,
ora non ha risposte a queste domande . La tentazione , come spesso accade , è di far
ricorso ad un apprendimento in gran parte mnemonico . Quello che ho detto per
Biochimica vale anche per l'insegnamento di Chimica delle Fermentazioni al corso
chimici , dove però gli studenti non hanno l'esperienza al terzo anno con
l'insegnante biologo. Sono del parere che la Biochimica costituisca un universo di
idee , conoscenze sperimentali , teorie , dubbi e problematiche , che ne fanno una
scienza di frontiera , dal cui "studio" si può apprendere la bellezza e la forza del
metodo scientifico . Non entro poi nel merito delle questioni , che si aprono con il
suo studio, come la formazione della vita nel nostro pianeta . Vi possono essere
alcune vie di uscita a un insegnamento che nel complesso non favorisce un
approccio razionale a questa disciplina . Vi sono dei grossi capitoli della biochimica ,
che possono essere affrontati in modo non convenzionale, come le proteine e gli
enzimi , ricorrendo alle risorse della rete , in particolare lo studio tridimensionale
della struttura delle proteine con l'uso di tutorial come MdL Chime e Protein
Explorer e i meccanismi con cui alcune classi di enzimi operano , attraverso
animazioni tridimensionali che sono in genere prodotte dalle università
anglosassoni. Però in questo articolo vorrei proporre un esempio di approccio
storico alla comprensione delle vie metaboliche , in particolare qui si parlerà della
glicolisi , rimandando ad un'altra occasione l'argomento proteine - enzimi. Di
fronte alla complessità di una via metabolica , la conoscenza delle modalità con cui
è stata nel tempo chiarita offre l'opportunità allo studente di rendersi pienamente
conto del metodo scientifico che è alla base della ricerca , inoltre del modo
problematico del procedere della scienza e in particolare della biochimica . Ma
acquisire in questo modo un argomento, che è considerato di solito poco
attraente , fa sentire lo studente più protagonista del suo studio , che risulterà
molto più consapevole e interessante . L'approccio storico inizia con un capitolo ,
tratto da un testo inglese ( vedi più avanti ) del Prof. Graham del Dipartimento di
Biochimica e Biologia Cellulare della Rice University di Houston Texas : "La Storia
della glicolisi : un esempio di via metabolica lineare " che fa la storia della glicolisi
attraverso un intreccio di geniali prove sperimentali e brillanti ipotesi . I
protagonisti di questo capitolo della biochimica che sono citati sono : Buchner ,
Harden e Young , Euler , Fiske e Subba Row, Meyerhof, Neuberg, Embden . Riporto
molto in breve le loro biografie . Una presentazione agli studenti degli scienziati
coinvolti nella glicolisi è didatticamente importante .
Eduard Buchner ( 1860 -1917 ) chimico tedesco , vincitore del Premio Nobel per la
Chimica nel 1907 per i suoi lavori sulla fermentazione .
Arthur Harden (1865 - 1940) chimico inglese , (a sinistra) , Hans von Euler - Chelpin - Facts ( a destra )
chimico tedesco , vincitori del Premio Nobel per la Chimica nel 1929 per i lavori sulla fermentazione degli
zuccheri e sugli enzimi della fermentazione
Yellapragata Subbarao ( 1895 - 1948 ) biochimico indiano (a sinistra ) e Cyrus H. Fiske (1890- 1978)
chimico statunitense (a destra) scoprirono il ruolo della fosfocreatina e adenosina trifosfato (ATP) nella
attività muscolare
Otto Fritz Meyerhof (1884-1951) medico e biochimico tedesco vincitore del
premio Nobel per la Medicina nel 1922 per la sua scoperta di una relazione fissa
tra consumo di ossigeno e il metabolismo dell'acido lattico nel muscolo .
Carl Alexander Neuberg (1877- I956) chimico tedesco studiò i carboidrati , le fermentazioni , amminoacidi
ed enzimi
La storia della glicolisi : un esempio di una via metabolica lineare
del Prof. Graham Palmer
Rice University Houston Texas
GLICOLISI deriva dal greco e significa "tagliare lo zucchero " . E' un processo
attraverso il quale il glucosio, il monosaccaride più abbondante nei sistemi viventi ,
è convertito in prodotti più semplici . L'identità di questi prodotti dipende dal tipo di
sistema vivente e dalle condizioni nelle quali la via metabolica procede. Così in
assenza di ossigeno ( sotto condizioni anaerobiche ) il principale prodotto è lattato
quando la reazione è eseguita nel muscolo (e in quasi tutti gli altri sistemi ) , ma
etanolo quando è eseguita nel lievito . Tuttavia in presenza di ossigeno ( sotto
condizioni aerobiche ) il prodotto finale è diossido di carbonio e acqua sia nel
muscolo che nel lievito , sebbene il prodotto immediato della glicolisi sia sempre un
composto a tre atomi di carbonio , l'acido piruvico . Questo composto a 3C è di
seguito processato per produrre acqua e diossido di carbonio .
La comprensione degli stadi della via glicolitica fu il risultato delle ricerche che
procedettero contemporaneamente in due aree in apparenza non collegate tra
loro. La prima area fu quella della biochimica del muscolo , la quale era investigata
dai fisiologi per le loro ricerche accademiche .
La seconda area della ricerca fu la fermentazione alcolica , il processo con il quale il
lievito converte il glucosio a etanolo e diossido di carbonio . Il chiarimento di questo
processo fu la maggiore preoccupazione dell'industria del vino francese nell'ultima
parte del secolo diciannovesimo . Nel 1860 Pasteur mostrò che ogniqualvolta la
fermentazione alcolica si verificava , il lievito o un altro microorganismo era
presente nel fluido fermentante . Pasteur dimostrò che la fermentazione alcolica
non accadeva in soluzioni sterili o con microrganismi morti , e questi fatti furono la
base per il suo convincimento che la fermentazione era la manifestazione delle
cellule viventi . Egli disse " Io sono della convinzione che la fermentazione mai si
otterrà senza ........che continui la vita delle cellule presenti " . Questo punto di vista
venne formalizzato come teoria VITALISTA : LE CELLULE VIVENTI HANNO UNA
FORZA VITALE .
Nel 1897 i fratelli Buchner fecero una scoperta chiave la quale portò alla caduta di
questa teoria e che aprì la porta , non solo alla investigazione del meccanismo della
fermentazione , ma anche a tutta la moderna biochimica . I Buchner , che erano
biologi tedeschi , stavano tentando di fare un estratto di lievito per scopi terapeutici.
Essi mischiarono cellule di lievito con della sabbia e le schiacciarono in un mortaio
per rompere le resistenti pareti cellulari . Il succo risultante fu filtrato attraverso la
garza per rimuovere i detriti costituiti da sabbia , cellule non rotte e frammenti di
pareti cellulari .
Avendo ottenuto questo liquido essi si trovarono di fronte al problema della sua
conservazione . Poichè esso doveva essere usato per studi nutrizionali su animali
essi non potevano usare antisettici convenzionali come il fenolo ma invece fecero
ricorso alle loro conoscenze culinarie e usarono un metodo molto familiare al
cuoco . Essi addizionarono zucchero all'estratto !. Non attesero molto per notare
che l'estratto di lievito bolliva intensamente , e fu loro merito aver compreso che
erano di fronte alla fermentazione alcolica in un estratto privo di cellule ,
demolendo in questo modo il punto di vista di Pasteur . Tuttavia essi non portarono
avanti la loro fondamentale osservazione e quindi il significato più ampio della loro
scoperta non fu compreso per almeno i successivi dieci anni .
La prima importante utilizzazione del preparato di lievito di Buchner avvenne nel
1905 ad opera di Harden e Young . Questi scienziati incubarono glucosio con succo
fresco di lievito e misurarono la quantità di biossido di carbonio che si produceva .
Essi scoprirono che la CO2 si sviluppava all'inizio vivacemente ma che la velocità della
sua produzione diminuiva e alla fine si riduceva a zero . A questo punto l'addizione
di fosfato (Pi è l'abbreviazione del fosfato inorganico ) portava alla ripetizione
dell'evento . Questo li condusse a controllare il comportamento del fosfato
inorganico durante la fermentazione . La scomparsa del fosfato inorganico dalla
miscela di incubazione suggerì a Harden e Young che si erano prodotti degli esteri di
fosfato organici 1 e essi furono abili da isolare dalla miscela di reazione un composto
che aveva la seguente struttura :
Questo zucchero fosfato è chiamato fruttofuranosio 1,6-difosfato o , più
comunemente , fruttosio difosfato (FDP ; più recentemente fruttosio bis- fosfato
FBP ) Harden e Young dimostrarono poi che FBP poteva essere aggiunto a succo di
lievito fresco con la contemporanea produzione di etanolo e diossido di carbonio .
Questa osservazione dimostrò che FBP era un probabile intermedio :
All'incirca nello stesso periodo Robison scoprì un secondo zucchero fosfato nel succo
di lievito in fermentazione ; mostrò che questo era un esoso monofosfato , il quale ,
attraverso studi dettagliati , fu scoperto essere una miscela in equilibrio di due
componenti , glucosio-6-fosfato ( G-6-P) e fruttosio-6-fosfato ( F6P) , nella
proporzione di 3:1
Allo stesso modo di FDP , entrambi questi zuccheri potevano essere fermentati fino
ad etanolo e considerazioni sulla loro struttura suggerirono la sequenza :
Succo di Lievito Dializzato : La Scoperta di ATP e Esochinase
Il successivo importante sviluppo fu ancora dovuto a Harden e Young . Essi
scoprirono che benchè il succo di lievito fresco fosse perfettamente capace di
fermentare , il succo dializzato era completamente incapace di fermentazione e non
poteva farlo neppure con l'aggiunta di uno zucchero fosfato .
L'attività del succo dializzato poteva essere ripristinata in due modi :
a) Addizione del dializzato ( il liquido esterno al sacco ) . Questo significava che il
fattore che causava la riattivazione aveva un basso peso molecolare
b) Addizione di estratto di lievito non dializzato che era stato inattivato con
l'ebollizione
Queste osservazioni dimostrarono che gli agenti attivanti erano piccole molecole e
non proteine .
L'osservazione che il succo dializzato più glucosio nè fermenta , nè produce zuccheri
fosfati , anche quando Pi è presente , suggerisce che un cofattore è necessario per
la tappa della fosforilazione .
Conclusioni : La Fermentazione richiede cofattori non proteici di basso peso
molecolare . Oggi sappiamo che un certo numero di tali fattori è necessario , e che
comprendono NAD , ADP/ATP , TPP , Mg , Pi , K .
L'identità del fattore cruciale (ATP) fu scoperta nel 1929 da Fiske e Subba Row . Esso
è necessario per i primi stadi della fosforilazione . Il relativo enzima era stato di
fatto scoperto precedentemente da Meyerhof da studi condotti su muscolo fresco
di coniglio . La capacità dell'estratto fresco di muscolo di convertire il glucosio in
lattato decresce rapidamente . Tuttavia se all'estratto di muscolo inattivo si
aggiunge succo dializzato di lievito l'attività del muscolo viene ripristinata . Partendo
da questi fatti Meyerhof fu capace di isolare dal lievito un fattore attivante il
muscolo . Questo si dimostrò essere un enzima che venne chiamato ESOCHINASI ( la
esochinasi del muscolo è intrinsecamente instabile e perde col tempo la sua
attività) . L'esochinasi catalizza il primo stadio della glicolisi .
Così :
ADP + Pi
ATP
da un meccanismo imprecisato
esochinase
ATP
Glucose + ATP G6P F6PFBP ethanol}
Apporto degli inibitori
La prima applicazione di inibitori metabolici a questo sistema ( e alla biochimica nel
suo insieme ) fu compiuta da NEUBERG nel 1918 . Negli anni seguenti alla scoperta
di Buchner furono incubati con succo di lievito molti composti , in parte per valutare
la capacità del succo di lievito di metabolizzare semplici composti organici . Un
risultato di queste indagini fu la scoperta che il succo di lievito poteva ridurre
l'acetaldeide ad etanolo . Neuberg volle controllare se questa reazione era l'ultima
reazione del processo di fermentazione . Così prese il succo di lievito , aggiunse
zucchero , più SODIO BISOLFITO , una trappola del gruppo carbonilico .
Neuberg trovò che la presenza del bisolfito cambiava i prodotti da etanolo più CO2 a
eguali quatità di glicerolo , diossido di carbonio e l'addotto tra bisolfito e
acetaldeide . NON si era formato alcool ! Perciò vide che la riduzione
dell'acetandeide a etanolo era in realtà l'ultima reazione .
La comparsa di diossido di carbonio a questo stadio suggerì che il precursore
dell'acetaldeide fosse piruvato . Era già conosciuto che il lievito conteneva un
enzima , che noi chiamiamo piruvato decarbossilasi , che decarbossila in modo
ossidativo il piruvato ad acetaldeide e diossido di carbonio .
{ L'origine del glicerolo diverrà chiara più avanti }. Perciò appariva che :
Glucose ===FBP 2 (3C fragments) 2 CH3COCOOH 2 CH3CHO + 2 CO2 2 CH3CH2OH
La diretta dimostrazione di questa possibilità fu dimostrata da EMBDEN usando il
composto IODIOACETATO ( ICH2COOH ) ; questo composto si conosce ora che è un
inibitore degli enzimi che contengono un gruppo solfidrilico3 . Quando lo
iodioacetato era aggiunto al succo di lievito in attiva fermentazione sia con zucchero
che con FBP i prodotti principali che si trovavano erano :
CH2OH
|
C=O
|
CH2OP
Dihydroxy-acetone phosphate (DHAP)
CHO
|
C ̶ OH
|
CH2OH
Glyceraldehyde 3-phosphate (G3P or 3PGA)
Embden perciò suggerì la sequenza :
Dihydroxy-acetone phosphate (DHAP)
Glyceraldehyde 3-phosphate (G3P or 3PGA)
L'aldolase , l'enzima che catalizza questa reazione fu successivamente isolato da
Meyerhof . Il terzo esempio dell'uso di un inibitore fu fornito sempre da EMBDEN .
Egli addizionò FLORURO4 al succo di lievito in fermentazione attiva e trovò che si
erano accumulati tre nuovi composti a tre atomi di carbonio . Questi erano
fosfoglicerolo insieme ad una miscela degli isomeri 2-, 3- dell'acido fosfoglicerico :
.
Questi presubilmente si formavano attraverso una ossidazione-riduzione
accoppiata nella quale il dihydroxy-acetone phosphate (DHAP) era ridotto a
glicerolo-3-P con la contemporanea ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato ( G3P )
ad acido 3-fosfoglicerico ; il 3-fosfoglicerato è in equilibrio con 2-fosfoglicerato.
{fu successivamente stabilito che questa reazione accoppiata richiedeva due
deidrogenasi con NADH che serve come mediatore di equivalenti di riduzione ; l'NAD
3
è ridotto dalla trioso-P-idrogenasi e riossidato dall'α-glicerofosfato deidrogenasi }.
Il succo di lievito integro converte il 2-fosfoglicerato in etanolo . Tuttavia con succo
dializzato l'aggiunta di 2-fosfoglicerato provoca l'accumulo di un nuovo intermedio
( dovuto alla rimozione dell'ATP dal succo dializzato) )
Se ora si aggiunge ADP al succo di lievito dializzato contenente il fosfo -enolpiruvato
( PEP) , il PEP scompare e appaiono ATP e piruvato (piruvato , non etanolo , per la
piruvato decarbossilasi è richiesto TTP e questo è stato rimosso dalla dialisi )
PEP + ADP ATP + pyruvate {ETOH}
Con questo schema abbiamo toccato le osservazioni principali che hanno portato
alla comprensione degli stadi che comprendono la via metabolica della
fermentazione . Furono impiegati tre linee sperimentali fondamentali :
1). La identificazione di possibili intermedi e la dimostrazione che potevano
essre convertiti nei prodotti
2). La rimozione di Cofattori tramite dialisi
3). L'uso di inbitori
Molte di queste ricerche vennero condotte nel periodo 1890 - 1930
Note
1
I metodi analitici conosciuti riguardavano il fosforo inorganico e non quello organico
2 Questo composto e il mercurio inibiscono l'enzima gliceraldeide -3-fosfato idrogenasi regendo con i gruppi tiolici
-SH dell'enzima
3 Vedi il sistema shuttle del glicerolo fosfato
4 I fluoruri sono inibitori dell'enzima enolasi
