Strumenti, obiettivi e frontiere della terapia genica
Michela A. Denti, PhD
Centro Interdipartimentale per la Biologia Integrata
Università degli Studi di Trento
[email protected]
www.unitn.it/cibio
Trento,
11 Dicembre 2009
Le malattie genetiche
•Identificazione dei geni malattia
•Diagnosi genetica
•Terapia Genica
•Vettori virali per la terapia genica
Le malattie genetiche
Il destino è nei geni?
Malattie monogeniche: almeno 6.000, la maggior parte
rare (<1/2000)
Malattie multifattoriali o complesse: interazioni geneambiente, suscettibilità, più di un gene coinvolto
Si stima che ogni anno il 6% dei neonati (8 milioni di bambini) nasca
con un grave difetto di origine totalmente o parzialmente genetica!
La diagnosi genetica
Una delle più importanti applicazioni della tecnologia
genica è la capacità di identificare mutazioni genetiche che
causano malattie specifiche, o la predisposizione allo
sviluppo di una malattia.
La diagnosi genetica: primo risultato della ricerca
Test diagnostici: conferma di un sospetto clinico
Test di identificazione di portatori sani: su familiari o screening di
popolazioni
Test preclinici o presintomatici effettuati prima dell’insorgenza della
malattia
Test di suscettibilità fornisce una probabilità statistica di ammalarsi (es.
BCRA1 o BCRA2)
Problemi etici
1997
La scala della ricerca: dalla malattia alla cura
(Fondazione Telethon Italia, 2007)
I tempi della ricerca ed i tempi della cura…
Fase I su un numero molto ristretto di volontari sani, obiettivo è determinare
il meccanismo d’azione e se il preparato è tollerato come previsto in base ai
risultati sugli animali.
Fase II su un numero ristretto di pazienti malati volontari; a gruppi diversi si
somministrano dosi differenti del composto, per determinarne la dose più
adatta a esercitare effetti terapeutici senza scatenare danni collaterali.
Fase III su un numero di pazienti elevato e significativo, l’obiettivo è
verificare l’effettiva efficacia del farmaco.
Terapia genica
-Sostituzione di un gene “malato” o mancante con uno sano
-Correzione di un gene “malato”
-Impedire al gene malato di esprimersi
Terapia genica
-Somatica: si alterano solo cellule somatiche, il trattamento non è
ereditabile ed influenza soltanto il singolo paziente
-Germinale comporterebbe modificazione dei gameti o
dell’embrione: i cambiamenti verrebero passati alla generazione
successiva. Non accettata al momento, non praticata: il problema è
che le tecniche usate per la correzione germinale di malattie
ereditarie sono esattamente le stesse che potrebbero essere usate
per la manipolazione germinale di altre caratteristiche ereditarie
Il 70% delle sperimentazioni di terapia genica in atto (tutte
somatiche) riguarda i tumori.
Terapia genica
-1990 Primo protocollo di terapia genica in USA per una deficienza
ereditaria del sistema immunitario
-Oggi più di 900 protocolli in corso
2/3 per il trattamento di vari stadi e forme di cancro
malattie cardiovascolari
Malattie infettive (quasi tutti HIV)
Disordini ereditarii autosomici recessivi provocati da difetti di
un singolo gene, come la fibrosi cistica.
Vettori per la terapia genica somatica
Per introdurre geni nelle cellule di un organismo umano
servono dei “vettori” che:
-Sappiano riconoscere le cellule bersaglio
-Non vengano distrutti dal sistema immunitario del ricevente
Espressione: transiente o permanente
Introduzione: in vivo oppure ex vivo
Terapia genica
-In vivo Il gene bersaglio è introdotto nel tipo di cellule desiderato
all’interno del paziente.
-Ex vivo Le cellule sono manipolate fuori dal corpo e quindi
reimpiantate nel paziente.
-Le cellule bersaglio devono essere rimuovibili, reiniettabili, a lunga
vita, resistenti ed accessibili.
-Introdotte ad es. mediante aerosol, iniezione nel torrente circolatorio
o rimozione chirurgica e manipolazione
-Spesso si usano cellule staminali perché si dividono attivamente
(ma sono rare e non tollerano bene le manipolazioni)
Le due strategie principali per la terapia genica somatica
Terapie cellulari
Isolamento ed amplificazione di
cellule (staminali) da paziente o
da donatore
Eventuale “cura” mediante
terapia genica
Re-infusione nel
paziente
Trasferimento genico ex vivo in cellule staminali
Vettori per la terapia genica somatica
Vettori liposomici
Vettori retrovirali
Vettori adenovirali
Vettori adenoassociati
Vettori liposomici
Vantaggi:
mancanza di tossicità
mancanza di immunogenicità
Svantaggi
trasferimento genico scarsamente efficiente
espressione transitoria
I liposomi sono minuscole sfere lipidiche in cui il doppio strato lipidico intrappola il
DNA.
Il doppio strato lipidico può essere costruito in modo da far aumentare il legame a certi
tipi cellulari, ad esempio tramite anticorpi, lipidi o carboidrati.
I complessi plasmide-liposoma si fondono con la membrana plasmatica ed entrano
nella cellula.
La maggior parte del materiale non va al nucleo ma viene dirottata negli endosomi
(organelli citoplasmatici in cui il materiale viene degradato). Una parte riesce ad
arrivare al nucleo ma il DNA non si integra nei cromosomi della cellula ospite.
Trasferimento genico mediato da liposomi
Vettori retrovirali
Il 34% dei trial attuali di terapia genica utilizza retrovirus.
I vettori retrovirali traggono vantaggio dalla capacità innata dei retrovirus di entrare in
modo efficiente nelle cellule.
Dopo l’infezione il genoma a RNA è copiato in DNA dalla trascrittasi inversa ed
integrato stabilmente nei cromosomi dell’ospite. L’integrazione non è del tutto
casuale: tendenza ad inserirsi nei geni attivi.
Non infettano con efficacia cellule che non si dividono (es. cellule nervose) poiché il
DNA virale può raggiungere i cromosomi solo se la membrana nucleare viene
demolita (divisione cellulare).
Rischio di alterazione di funzioni di geni adiacenti o attivazione di un oncogene
Vettori adenovirali
Il 27% dei trial attuali di terapia genica utilizza adenovirus.
La prima morte attribuita direttamente a terapia genica è avvenuta con vettori
adenovirali
Gli adenovirus sono una famiglia di virus a DNA a doppio filamento che infettano i
vertebrati provocando malattie blande del tratto respiratorio, della congiuntiva e della
cornea, del tratto gastrointestinale e del tratto genito-urinario.
Hanno la capacità di infettare una vasta gamme di cellule che si dividono e che non
si dividono. Sono tra i vettori più efficienti per il trasferimento genico in cellule di
mammifero. Possono accogliere geni estranei di maggiori dimensioni.
Svantaggio: poiché il DNA virale non si integra può essere necessaria la
somministrazione ripetuta e questo può portare a risposta immunitaria.
La prima morte per terapia genica
Prima del 17 Settembre 1999 si riteneva comunemente che la terapia genica
somatica per il trattamento di una malattia grave fosse un’opzione terapeutica
corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per
malattie mortali o terminali.
Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta
iperimmune contro la grande quantità di vettore necessaria per una terapia non
mirata: il consenso generale è messo in discussione.
Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza
parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con
la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia,
per una incapacità a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo
tossico di ammoniaca.
La prima morte per terapia genica
In un trial clinico, il 13 settembre 1999 Gelsinger riceve un’alta dose di vettore
adenovirale contenente il gene OTC nella vena porta (che irrora il fegato): 38 miliardi
di miliardi di particelle virali (la dose più alta mai somministrata in un trial clinico.
Solo l’1% raggiunge il fegato. Non si osserva espressione significativa del gene.
Le particelle virali invasero tutti gli altri organi del corpo successivamente esaminati:
milza, polmoni, tiroide, cuore, rene, testicoli, cervello, pancreas, linfonodi, midollo
osseo, vescica.
Quattro giorni dopo Gelsinger morì a causa di una risposta infiammatoria
sistemica alle proteine virali che portò ad insufficienza generalizzata degli organi.
La prima morte per terapia genica
21 Gennaio 2000 L’FDA (US Food and Drug Administration) chiuse 5 trial di terapia
genica dell’Università della Pennsylvania dopo aver scoperto gravi mancanze nella
supervisione e nel monitoraggio di questo trial in 18 aree.
Ad esempio:
-I pazienti non erano stati informati della morte di due scimmie Rhesus che avevano
ricevuto il trattamento sperimentale
- i moduli di consenso informato non erano stati compilati in modo appropriato
5 anni dopo il Dipartimento di Giustizia degli Stati Uniti commina multe pesanti ed
opera restrizioni alla ricerca clinica per i ricercatori e l’istituzione.
Vettori virali adeno-associati
I virus adeno-associati (AAV) hanno un genoma a DNA a singolo filamento, non
causano alcuna malattia negli esseri umani e tendono a rimanere inattivi in assenza
di adenovirus. Sono considerati sicuri, perché non si integrano nei cromosomi
dell’ospite. Hanno lo svantaggio di non poter accomodare grossi pezzi di DNA.
Interferenza a RNA e micro RNA
Ambros, V. A (1989).
Arasu P, Wightman B, Ruvkun G. (1991).
Napoli et al., (1990)
Jorgensen et al., (1996)
L’RNA interference (RNAi) è un processo
naturale di silenziamento post-trascrizionale
dell’espressione genica iniziato da RNA a
doppio filamento (dsRNA) di sequenza
omologa al gene target.
dsRNA
nucleo
cap
AAAAAA
RNA target
L’RNA interference (RNAi) è un processo
naturale di silenziamento post-trascrizionale
dell’espressione genica iniziato da RNA a
doppio filamento (dsRNA) di sequenza
omologa al gene target.
nucleo
Uso terapeutico dell’ RNA interference
19 nt duplex
Respiratory syncitial virus, Fase II
Diabetic Macular Edema, Fase II
Acute kidney injury, Fase I
Tumore epatico, Fase I
Tumori solidi, Fase I
2 nt 3’ overhangs
Age-related Macular Degeneration, Fase II
Uso terapeutico dell’ RNA interference
Trial clinico per uso di RNA interference contro HIV (Benitec/City of Hope)
Fase II
Terapie di splicing
Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
• Nei muscoli degli individui affetti da DMD manca una proteina: la distrofina.
distrofina
• La distrofina e’ richiesta per il mantenimento del muscolo e previene l’atrofia
muscolare.
proteina= 427 KDa
DNA: l’informazione genetica nei nostri geni
Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene
Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene
Introne
ESONE 1
ESONE 2
Introne
ESONE 1 ESONE 2 ESONE 3
mRNA – RNA messaggero
ESONE 3
DNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
DNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
DNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
mRNA
STOVIACONMIAZIAPERTREORE
DNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
Pre-mRNA
STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE
mRNA
STOVIACONMIAZIAPERTREORE
STO VIA CON MIA ZIA PER TRE ORE
mRNA – RNA messaggero,
porta l’informazione dal DNA alle proteine
ESONE 1 ESONE 2 ESONE 3
proteina – i “mattoni” che costituiscono le cellule
•Delezioni e mutazioni puntiformi nel gene della distrofina.
•Nella piu’ lieve Distrofia Muscolare di Becker (BMD) la
distrofina e’ presente, anche se mutata o in quantita’ minori.
Delezione frame-shift : ∆48-50
47
51
AAG
52
CT
47
52
CU
Splicing
52
GCA
STOP
47
Pre-mRNA
GCA
52
47
AAG
GCA
Splicing
51
AAG CU
52
47
AAG
GCA
STOP
47
DNA
GCA
51
AAG
Delezione non frame-shift : ∆48-51
51
DMD
52
mRNA
DEGRADAZIONE TRADUZIONE
47
52
AAG GCA
Distrofina
BMD
DMD
CO
STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E
BMD
CON MIA ZIA
STO VIA PER TRE ORE
DMD
CO
STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E
BMD
CON MIA ZIA
STO VIA PER TRE ORE
Exon skipping o “cerotto molecolare”
per la correzione di mutazioni DMD
47
52
51
AAG
CT
DNA
GCA
Pre-mRNA
51
47
52
AAG
GCA
Splicing
mRNA
47
52
AAG GCA
Traduzione
Distrofina
Exon Skipping o “cerotto molecolare”
Uso di oligonucleotidi antisenso (AON):
piccoli frammenti di DNA che si legano
all’esone da saltare e ne inibiscono
l’inclusione nell’RNA messaggero
Dr. J.C.T. van Deutekom, Olanda
MDEX Consortium
Prosensa
oligonucleotidi antisenso
E3
E2
E1
E1
E3
Molecole di RNA antisenso come “cerotto molecolare”
RNA ANTISENSO
3’
5’
5’
47
52
AAG
51
47
52
AAG GCA
3’
GCA
AAAAAAA
Vantaggi:uso di vettori virali
Antisense
U1/U7
promoter
5’-ITR
CMV
promoter
GFP
SV40 misc
intron
3’-ITR
Wpre
BGH pA
Produzione di
Particelle virali
5’
3’
Produzione
dell’RNA antisenso
e correzione
molecolare del
difetto
Somministrazione
locale o sistemica
Molecole di RNA antisenso come “cerotti molecolari”
RNA ANTISENSO
3’
5’
5’
E1
E3
3’
E2
E1
E3
AAAAAAA
Alcuni esempi di mutazioni che si possono correggere con exon skipping:
• Distrofia Muscolare di Duchenne
• Beta-Talassemia
• Fibrosi Cistica
• Malattie Metaboliche (Malattie da accumulo lisosomiale)
• Retinopatie
• Demenza Frontotemporale con Parkinsonismo legata al cromosoma 17
3
“Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica
della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata
al cromosoma 17 (ftdp-17)”
E11
E10
E9
E11
E9
*E10
E9
nei neuroni sani
E9
E10
E11
nei neuroni di
pazienti FTDP-17
E11
FTDP-17
Tau “microtubule associated protein”
“Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica
della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata
al cromosoma 17 (ftdp-17)”
*
E10
E9
E11
RNA
antisenso
E9
E11
nei neuroni di
pazienti FTDP-17
curati
