081 - Dipartimento di Scienze Chimiche, della Vita e della

DETERMINAZIONE CHEMILUMINESCENTE ULTRASENSIBILE
DELL’ATTIVITA’ DELL’URATO OSSIDASI NEL SIERO
Massimo Guardigli, Aldo Roda
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Bologna, Via Belmeloro 6,
40126 Bologna
E-mail: [email protected]
L’urato ossidasi (EC 1.7.3.3) è un enzima, attualmente disponibile in forma ricombinante,
utilizzato a scopo terapeutico nel trattamento sintomatico delle patologie che determinano
elevati livelli ematici di acido urico. Esso è infatti in grado di convertire l’acido urico in
allantoina, una specie che risulta più facilmente eliminabile dall’organismo, attraverso una
serie di reazioni che comportano l’ossidazione dell’acido urico ad acido 5-idrossiisourico e la
sua decomposizione spontanea in allantoina.
O
O
NH
HN
-
O
O
N
NH
+ O2
HN
urato
ossidasi
O
N
OH
NH
O-
+ H2O 2
NH
acido urico
H2O
CO2
O
O
NH2
NH
NH
NH
O
allantoina
L’efficacia del trattamento terapeutico con urato ossidasi viene normalmente valutata
attraverso la misura dei livelli ematici di acido urico, ma sarebbe comunque utile potere
misurare direttamente, in modo semplice e rapido, l’attività dell’enzima nel sangue.
L’attività enzimatica può essere misurata mediante la quantificazione dell’acqua ossigenata
ottenuta in presenza in un eccesso di acido urico. Questa determinazione può essere effettuata
ad esempio per via spettrofotometrica, ma per aumentare la sensibilità della misura e ridurre i
tempi di analisi è stato messo a punto un metodo basato sulla chemiluminescenza. A causa
dell’effetto antiossidante dell’acido urico (che interferisce nella produzione del segnale) non è
stato possibile sfruttare il sistema chemiluminescente luminolo/perossidasi, comunemente
impiegato per misurare l’attività delle ossidasi utilizzando reazioni enzimatiche accoppiate. E’
stata quindi utilizzata la reazione chemiluminescente fra l’acqua ossigenata ed il bis(2,4,6triclorofenil)ossalato (TCPO) in presenza di dipiridamolo, una molecola fluorescente che
funge da accettore di energia e produce l’emissione. L’analisi viene effettuata in piastra
microtiter a 96 pozzetti, e consiste essenzialmente nell’incubazione del campione in presenza
di un eccesso di substrato enzimatico (acido urico), seguita dall’aggiunta di dipiridamolo in
acetonitrile (che inoltre blocca la reazione enzimatica) e dalla misura del segnale
chemiluminescente transiente ottenuto per aggiunta di TCPO. Viene quindi calcolato
l’integrale del segnale chemiluminescente, che è proporzionale alla concentrazione di acqua
ossigenata, e quindi all’attività dell’enzima nel campione in esame.
I risultati preliminari ottenuti finora mostrano che il metodo permette la determinazione
quantitativa dell’urato ossidasi in tampone con un limite di rivelazione di circa 0,2 ng/mL ed
un intervallo di linearità che si estende almeno fino a 20 ng/mL. Nei campioni di siero è stata
osservata una forte interferenza da parte della matrice, che provoca la riduzione dell’intensità
del segnale chemiluminescente. L’interferenza può essere ridotta mediante diluizione del
campione, e diventa praticamente trascurabile per diluizioni sufficientemente elevate (1:100 o
1:200). Il limite di rivelazione effettivo dell’urato ossidasi nel siero ottenibile con questo
metodo è quindi notevolmente più elevato di quello misurato in tampone, risultando
dell’ordine della decina di nanogrammi per millilitro. Questo valore è comunque più che
sufficiente per misurare la concentrazione di urato ossidasi nel sangue a livelli terapeutici.
250
2000
Segnale CL
200
20,0 ng/mL
4,0
2,0
1,0
0,50
0,25
150
100
50
0
Segnale CL integrato
a
b
1500
1
2
Tempo (sec)
3
4
siero 1:200
1000
siero 1:50
500
siero 1:20
0
0
tampone
0
5
10
15
20
25
Urato ossidasi (ng/mL)
(a) Profili cinetici di chemiluminescenza ottenuti in presenza di diverse quantità di urato
ossidasi. (b) Curve di calibrazione ottenute in tampone ed in siero a diverse diluizioni.
L’analisi richiede volumi ridotti di campione (alcune decine di microlitri), è più veloce ed ha
un limite di rivelazione inferiore rispetto al metodo colorimetrico basato sulla quantificazione
dell’acqua ossigenata prodotta dalla reazione mediante il sistema perossidasi/cromogeno (che
richiede un secondo stadio di incubazione prima della misura). Il sistema può inoltre essere
facilmente automatizzato utilizzando sistemi di preparazione del campione e dispensazione
dei reagenti disponibili in commercio.
L’elevata sensibilità della misura potrebbe essere inoltre sfruttata per mettere a punto il
metodo in un formato ad alta produttività, ad esempio in piastra microtiter a 384 pozzetti. La
prcedura di analisi messa a punto per l’urato ossidasi potrebbe essere poi applicata alla
determinazione dell’attività di altre ossidasi, permettendo ad esempio di effettuare screening
di inibitori enzimatici.