08 BSF Fattori di moltiplicazione batterica [modalità compatibilità]

C.d.L.
Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche
Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei
Microrganismi
AA 2007 2008
Nutrizione microbica
Fattori di moltiplicazione batterica
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Fattori di crescita
I microrganismi si riproducono quando hanno a disposizione minerali,
energia, carbonio, azoto, fosforo e zolfo
In genere i microorganismi a partire da questi elementi sono in grado di
risolvere tutte le loro esigenze nutrizionali
Molto spesso mancando di uno o più enzimi hanno bisogno di
assorbire dall’esterno alcuni elementi necessari (enzimi) o i loro
precursori.
Questi elementi si definiscono fattori di crescita :
aminoacidi (biosintesi delle proteine), purine e pirimidine (DNA),
vitamine (sintesi).
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Macroelementi
I macroelementi : sono elementi chimici di cui i batteri hanno
bisogno in grandi quantità.
Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo, Fosforo.
Tutti questi elementi entrano nella sintesi di proteine e lipidi.
Altri quattro elementi sono essenziali : Calcio (spora), Potassio
(enzimi), Magnesio (ribosomi e membrane cellulari), Ferro
(enzimi).
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Micronutrienti
Manganese, Zinco, Cobalto, nickel, rame. Elementi che possono essere
presenti anche in quantità infinitesimali, (tracce).
Si tratta di elementi che si possono trovare anche nei comuni terreni di
coltura.
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Fonti di carbonio energia ed e
Carbonio
Autrofi:: la CO2 è l’unica fonte di carbonio per la biosintesi.
Autrofi
Eterotrofi: Molecole organiche ridotte derivanti da altri organismi.
Energia
Fototrofi : luce
Chemiotrofi : ossidazione di composti organici o inorganici
Elettroni:
Litotrofi : molecole inorganiche ridotte.
Organotrofi
Organotrofi:: molecole organiche
Energia e
metabolismo
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Azoto, Fosforo, Zolfo
L’ azoto è importante per la
sintesi di proteine e
carboidrati, purine e pirimidine
tutti costituenti la cellula
batterica. Molti microorganismi
utilizzando direttamente
l’ammoniaca per ricavare
azoto, una vasta gamma di
organismi riducono l’azoto
atmosferico.
Il fosforo è presente negli acidi
nucleici nei nucleotidi, in vari
cofattori e proteine. Il fosfato
inorganico è la fonte di fosforo,
in molti ambienti acquatici la
sua mancanza rappresenta un
fattore limitante la crescita.
Lo zolfo è importante per la
sintesi di alcune sostanze
quali metionina e cisteina,
carboidrati come biotina e
tiamina, come fonte viene
usato il solfato.
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Assunzione dei nutrienti
Diffusione passiva o diffusione:
diffusione: (glicerolo): processo in cui le molecole si
spostano da una regione ad alta concentrazione ad una con bassa
concentrazione per effetto dell’agitazione termica.
Diffusione facilitata : diffusione che avviene in presenza di particolari
proteine (carrier) chiamate anche permeasi incluse nella membrana
citoplasmatica. La velocità di diffusione in questo caso aumenta . Le
proteine di trasporto sono in questo caso simili agli enzimi, ogni carrier
trasporta solo una ben determinata tipologia di sostanza. Non richiede
alcuna tipologia di energia metabolica.
Trasporto attivo : meccanismo che permette il movimento contro gradiente
di concentrazione, cioè in direzione di concentrazioni più alte. Differisce
dalla diffusione facilitata in quanto utilizza energia metabolica per il
trasporto delle sostanze all’interno della cellula.
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Assunzione di sostanze
dall’ambiente esterno
Il primo passo per l’assimilazione dei nutrienti è il loro assorbimento
da parte della cellula microbica.
I meccanismi devono essere specifici, devono essere assorbite le
sostanze necessarie e non altre.
Devono essere in grado di trasportare il nutriente al proprio interno
quindi contro gradiente di concentrazione.
Le molecole di nutrienti devono esser in grado di passare la
membrana citoplasmatica che notoriamente è di tipo selettivo.
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Coltivazione dei batteri
Una condizione per poter studiare i microrganismi è
poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio.
Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze
nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono.
Tali informazioni hanno consentito di sviluppare
numerosi terreni o mezzi per la loro coltura.
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Preparazione dei terreni colturali
Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O.
Determinazione del pH ed eventuale correzione.
Distribuzione in contenitori idonei.
Sterilizzazione.
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Terreni impiegati per la coltivazione dei
microrganismi in laboratorio
Stato fisico
fisico::
liquido;;
liquido
semisolido (+Agar 0,5%);
solido (+Agar 2%).
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Terreni impiegati per la coltivazione dei
microrganismi in laboratorio
L’agar è un polimero composto principalmente di D - galattosio, lo si ottiene di
solito dalle alghe rosse è un ottimo agente solidificante perché dopo
essere stato sciolto in acqua bollente può raffreddare a 42°
42°C,
C,prima
primadidi
solidificare e poi liquefa a 80°
80°-- 90
90°
°C.
Non può essere degradato dai microrganismi non ha caratteristiche di nutriente.
Un terreno liquido può essere reso solido mediante l’aggiunta di agar 11-2 % il
più delle volte 1,5%.
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Terreni impiegati per la
coltivazione dei microrganismi in
laboratorio
Terreni chimicamente definiti (terreni di cui è nota la quantità di ogni
singolo componente, spesso a scopo di ricerca è necessario
conoscere quello che i batteri metabolizzano).
Terreni complessi (si ignora la loro composizione clinica, utili poiché
le necessità di un batterio sono sconosciute è quindi impossibile
preparare un terreno definito).
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Terreni usati in batteriologia
1.
Terreni arricchiti: sono aggiunti di altre sostanze come sangue, siero ed
emoglobina al fine di favorire la crescita di batteri eterotrofi esigenti .
Brodo selenite per isolare salmonelle e shigelle da campioni di feci.
2.
Terreni selettivi: terreni arricchiti con Sali biliari o coloranti come fucsina
basica favoriscono la crescita dei gram negativi sfavorendo i gram
postivi. Agar Endo, EMB (agar all’ eosina e Blu di metilene) e l’agar Mac
Conkey che contengono coloranti che inibiscono la crescita dei Gram +
mentre MSA inibisce la crescita di batteri diversi dagli stafilococchi).
Anche il terreno Sabouraud può essere considerato un terreno selettivo
per il pH e il contenuto in zuccheri.
3.
Terreni differenziali: mettono in evidenza la presenza di particolari generi
batterici sfruttando un colorante e il lattosio che fermentando abbassa il
pH provocando il viraggio del colorante, la colonia diviene rossa, i gram
negativi gastro intestinali patogeni non fermentano il lattosio e vengono
identificati facilmente . L’agar sangue evidenzia batteri in grado di
produrre una lisi dei globuli rossi con diverse forme di emolisi. (Beta
emolisi, alfa emolisi, gamma emolisi).
4.
Terreni di saggio (ad esempio per antibiotici, disinfettanti).
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Terreni di coltura
Conservazione temporanea del microrganismo,
non contiene metaboliti essenziali al
metabolismo microbiale.
Terreni di trasporto
Contengono particolari fattori di crescita che
permettono la replicazione della maggior parte
dei batteri di interesse medico compresi i
patogeni più esigenti, agar sangue agar
cioccolato.
Terreni ricchi
Terreni di arricchimento
Terreni selettivi
Terreni differenziali
Contengono un fattore che favorisce
selettivamente la crescita di un particolare
microrganismo come ad es. il brodo-selenite che
favorisce la crescita dei gram negativi.
Terreni solidi che contengono sostanze capaci di
inibire la crescita di alcuni generi batterici
consentendo la più crescita di altri. EMB, MSA,
Sabouraud.
Contengono sostanze che consentono di sfruttare
il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra
specie di microrganismi differenti. Per i batteri
gram negativi Agar Mac Conkey. (diventa rosso al
di sotto di ph 6,8).
Lattosio positivi di colore rosso.
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batterica
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Terreni di coltura complessi
Non è nota l’esatta percentuale dei singoli ingredienti presenti
•
•
•
•
•
Brodo nutritivo : TSB (Triptic soy broth)
Agar nutritivo: TSA (Triptic soy agar)
Agar sangue
Agar cioccolato
Agar Mac Conkey
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Colture pure e caratteri colturali
I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un
terreno di laboratorio, sono chiamati coltura.
Per coltura pura si intende una coltura costituita da una popolazione di cellule
derivate tutte da un’unica cellula madre.
Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed
è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio.
Coltura mista: la popolazione microbica presente nel nostro ambiente è
grande e complessa. Molte differenti specie microbiche abitano
normalmente varie parti del nostro corpo (orale, intestinale, cutanea)
ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).
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Caratteristiche colturali
Il modo in cui le colonie batteriche si sviluppano sulla superficie dell’agar è
importante nella identificazione dei batteri sia per la dimensione che per
l’aspetto.
Un corretto piastraggio di una popolazione mista può portare al riconoscimento
e all’identificazione di una specie batterica.
In natura i batteri crescono sulle superfici in forma di biofilm ma a volte formano
colonie distinte, di norma la crescita batterica è rapida ai margini della
colonia e molto più lenta al centro. In alcune colonie la porzione
centrale va incontro ad autolisi, ai margini infatti ossigeno e nutrienti sono
abbondanti rispetto al centro.
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Variazioni rilevabili a occhio nudo nella morfologia delle
colonie, forma e andamento generale del suo margine
vengono rilevati osservando la colonia dall’alto, lo
spessore si rileva osservando la colonia di lato, tenendo la
piastra all’altezza degli occhi.
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FATTORI AMBIENTALI
classificazione e range di tolleranza
Psicrofili –7° ÷ 20° C optimum 18° C
Temperatura
Mesofili 20° ÷ 40° C optimum 37°C
Termofili > 40° C ÷ 90° C optimum diversificato
Aerobi
Anaerobi
Ossigeno
Anaerobi facoltativi
Microaerofili
Terreno colturale per batteri a
concentrazione idrogenionica ≅ 7
pH
Batteri optimum di sviluppo 6,5 ÷7,5
Lieviti e muffe optimum di sviluppo 4,5 ÷6,5
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Aerobi obbligati stretti
Ossigeno
Necessitano ossigeno (colture con agitazione e aria, es. M.
tubercolosis)
Anaerobi obbligati stretti
L’ossigeno è tossico ( bacteroides intestinali,clostridium
ed altri,)
Anaerobi facoltativi
(germi di interesse medico in flora intestinale,
metabolismo sia ossidativo che fermentativo: Vibrio,
Escherichia, Klebsiella, Salmonella)
Microaerofili (Bassa tensione di ossigeno: <
20%, per sviluppo ottimale – streptococchi e lactobacilli)
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Fattori ambientali
Grado di umidità (presenza di
acqua libera)
L’acqua rappresenta un elemento indispensabile
per la crescita dei microrganismi. In essa
avvengono le reazioni biochimiche essenziali al
loro metabolismo. I normali terreni solidi di
coltura contengono acqua (1-2%)
Un aumento di pressione osmotica dovuto alla
concentrazione salina o degli zuccheri determina
una stasi della crescita microbica.
I batteri hanno meccanismi di protezione contro gli
choc osmotici.
Le sostanze disciolte in
acqua determinano la
pressione osmotica
Microrganismi osmofili in grado di sopravvivere in
particolari condizioni di pressione osmotica (lieviti
in presenza di elevate concentrazioni di zucchero)
Microrganismi alofili in grado di vivere in presenza
di elevate concentrazioni saline (stafilococchi)
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