WestNile e USUTU.LB - Scuola di Specializzazione in

Virosi Aviari Emergenti:
Rischio Zoonosico
Prof. Alessandro FIORETTI
Facoltà di Medicina Veterinaria
Univesità di Napoli Federico II
West Nile Disease
Prof. Alessandro FIORETTI
Facoltà di Medicina Veterinaria
Univesità di Napoli Federico II
L’agente
Flaviviridae

Flavivirus


Singolo filamento di RNA
Correlato a:
- encefalite Saint Louis,
- encefalite giapponese,
- encefalite Murray Valley,
- Kunjin virus

Infetta uomini, uccelli,
zanzare, cavalli,
altri mammiferi
Storia
1937: West Nile District, Uganda
1950
− Egitto


Ecology studied
Disease varies
− Israele


1951-54
1957
- Meningoencefalite negli anziani
Storia
1962, 2000: Francia
1973-74: Sud Africa
1996: Romania
 Prima epidemia in
area urbana industrializzata
1998: Italia
1999
 Russia
 Stati Uniti, New York
- Prima segnalazione nell’emisfero ovest
Stati Uniti - 1999
New York
− 62
casi
− 7 morti
− Uccelli da zoo, corvi,
cavalli
St. Louis Encephalitis virus
primo sospettato
Simile al ceppo virale
trovato in Israele
Modi possibili di introduzione del West
Nile Virus negli USA
Ospiti infetti (uomo)
Ospite vertebrato trasportato dall’uomo
- Legale
- Illegale
Vettore(i) trasportato dall’uomo
Ospite vertebrato (uccelli) trasportato dalle
tempeste
Introduzione intenzionale
Diffusione di WNV negli USA: 1999-2002
Distribuzione mensile di WNV: 1999-2001
Distribuzione dei casi di WNV in base
all’età : 1999-2001
WNV negli USA, Uomini
Anno
Casi
Morti
1999
62
7
2000
21
2
2001
66
9
2002
4156
284
2003
9862
264
WNV negli USA: 2003
WNV negli USA: 2010
WNV Equini: 2002
WNV Equini: 2010
WNV Animali positivi, 2003
Casi USA
− 4,554
equini
− 30 cani
− 17 scoiattoli
− 1 gatto
− 32 specie animali
non identificate
Ecologia e Trasmissione
Trasmissione
Ospiti occasionali
Ospiti amplificatori
Uccelli
Vettori
Culex sp., Aedes sp.,
Ochlerotatus sp.
Uomo, cavallo, e
altri mammiferi
Ecologia e Trasmissione
Vettore primario
Culex spp.
43 specie
Ma anche Aedes spp.
−
Isolato
sporadicamente dalle
zecche
Asia, Russia
− Ruolo non chiaro nella
trasmissione
−
Culex pipiens
Culex restuans
Culex salinarius
Aedes vexans
In Italia nell’estate 2009
2 pool di zanzare sono risultate
positive sia a WND e USUV
Aedes albopictus
Ecologia e Trasmissione
Zanzare infette nel
periodo invernale
Trasmissione
transovarica
Uccelli
Contatto
− Migrazione
−
Trasmissione nell’Uomo
In laboratorio
− Lacerazioni
durante necroscopie
− Punture con aghi
Emotrasfusioni
− 23
casi in 2002
− Monitoraggio implementato nel 2003


737 presunti donatori viremici di West Nile
2 casi associati a trasfusioni
Trasmissione nell’Uomo
Trapianti d’organo
−4
casi documentati da 1 donatore d’organo
− Un donatore d’organo ha ricevuto sangue da
un donatore viremico
Trasmissione transplacentare
− WNV
27a settimana di gravidanza
Allattamento
− Una
madre ha ricevuto sangue infetto
− Neonato positivo a WNV
Malattia nell’uomo
Malattia nell’uomo
Incubazione: 3-14 giorni
− 80%
asintomatica o simil-influenzale
− 20% febbre, debolezza, emicrania, mialgia,
nausea, vomito
Sintomi ultimi 3-6 giorni
Rash maculo-papulare

Frequente nei bambini
Recenti epidemie: menigoencefaliti
Malattia nell’uomo
Meno dell’1% (1:150) infetto
− Sviluppa

grave malattia
Con segni neurologici
− Encefalite

(meningoencefalite)
Febbre, disorientamento, atassia, tremori,
rigidità cervicale, ± coma
− Debolezza
muscolare fino a paralisi flaccida
delle estremità
Diagnosi nell’uomo
Monitoraggio anticorpale
− Siero
o Liquido cerebro-spinale
− IgM capture ELISA (MAC-ELISA)

Entro 8 gg.
− Aumento


del titolo Ac di 4 volte o superiore
Acuto/convalescente – a distanza di 3 settimane
Forte evidenza dell’infezione
− IgM
in LCS suggerisce l’infezione del SNC
− Cross-reattività con altri virus
Diagnosi nell’uomo
Plaque reduction neutralization test
− Per
differenziare le cross-reattività
− CDC test per indentificare gli stadi iniziali
− Test negativi
Raccolta entro 14 gg dall’esordio della malattia
 Riconferma

Durata dell’immunità
− IgM
possono persistere nel sangue 6 mesi o più
− Fino a 16 mesi nel LCS
Trattamento nell’uomo
No terapia specifica
Cure di supporto
Ribavirina?
Interferone alfa-2b?
Vaccino in fase di prova
è stato dimostrato che la somministrazione passiva di
anticorpi prodotti da donatori selezionati ha dato
risultati promettenti nei modelli animali.
WNV negli Animali
Cavalli (*)
Orso bruno
Pipistrelli
Capre (*)
Pecore (*)
Cane (*)
Lupo (*)
Alpaca (*)
Capra delle montagne
rocciose
Alligatore (*)
Lama (*)
Bovino (*)
Foca (*)
Scoiattolo grigio (*)
Cervo
Coniglio
Scoiattolo
striato
Puzzola
Coccodrillo (*)
Gatto (*)
Segni clinici nella fauna selvatica
Uccelli
− Solitamente
trovati morti (es. Corvidi)
Pipistrelli, scoiattoli striati, puzzole e
conigli domestici
− La
maggioranza non sviluppa segni clinici
Scoiattolo grigio
− Letargia,
vocalizzazioni, atassia, movimenti
di maneggio, encefalite, miocardite
Segni clinici nei grandi animali
Bovino
− Progressiva
atassia fino alla paralisi
Alpaca, pecora, capra
− Febbre,
nistagmo, torcicollo, atassia
− Vocalizzazioni
− L’alpaca presenta moderata
meningoencefalite non-suppurativa
Segni clinici nei piccoli animali
Cani e gatti
― Raramente
mostrano segni di malattia
Febbre, depressione
• Debolezza muscolare, spasmi
• Paralisi, miocarditi
•
Lupo - 1 caso
−3
mesi di età, animale da zoo, segni nervosi
Sospetto di WNV negli animali che
mostrano segni neurologici e cardiaci
Segni clinici nei piccoli animali
Cani e gatti infettati sperimentalmente
− Puntura
di zanzara: cani

Tutti i cani mostravano viremia, no segni clinici

Tutti i gatti mostravano viremia
Quasi tutti mostravano moderati segni clinici
− Puntura

di zanzara: gatti
− Predazione:


gatti
Tutti i gatti sviluppavano viremia
Nessuno mostrava segni clinici
Conclusioni: si infettano rapidamente,
ma non sono ospiti amplificatori
Segni clinici nei cavalli






Paralisi delle labbra,
muscoli facciali, o
lingua
Torcicolo, difficoltà
deglutizione
Alterata mentazione
Iperacusia
Cecità
Depressione





Simil-influenzale,
anoressia,
depressione
Contrazione
muscolare e cutanea
Iperestesia
Debolezza, atassia
Decubito
Diagnosi e Trattamento nei cavalli
Diagnosi
− Sierologia

Sieropositivo e non vaccinati
infezione da WNV
Immunità
− Molti
mesi
Effettuare necroscopie con dovute
precauzioni
Terapia di supporto
=
Vaccino nei cavalli
Vaccino pienamente approvato
− Novembre
2002
− Vaccino spento
− 2 dosi

Distanziato di 3-6
− Richiamo
annuale
− Ristretto uso veterinario
WEST NILE DISEASE NEL BACINO DEL
MEDITERRANEO 2010
La West Nile Disease è stata segnalata tra luglio e novembre 2010
in diversi paesi del Bacino del Mediterraneo sia negli animali sia
nell’uomo.
Gli Stati coinvolti dai focolai sono:
Bulgaria, Grecia, Israele, Italia,
Marocco, Portogallo, Romania,
Russia, Spagna, Turchia, Ungheria.
Situazione Bacino delMeditarraneo
Il ciclo di trasmissione della WND è intimamente legato:
componenti biotiche dell'ecosistema (uccelli selvatici, zanzare,
animali domestici)
componenti abiotiche (variabili climatiche, tipologia di suolo ecc.),
che influenzano la distribuzione e l'andamento dell'infezione.
La malattia ha un chiaro trend stagionale nei Paesi del Bacino del
Mediterraneo ed i focolai si verificano generalmente in prossimità
di aree umide (per es. delta dei fiumi) dove spesso una maggiore
densità di uccelli coesiste con una elevata abbondanza di vettori.
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
La WND è ricomparsa in Italia per il terzo anno consecutivo
interessando sia territori coinvolti dalla circolazione virale nel
2008–2009 (Veneto, Emilia Romagna, Molise), sia territori in
precedenza non colpiti (Sicilia).
Sorveglianza
Ai sensi del Decreto Dirigenziale 15 settembre 2009 la
sorveglianza nei confronti della West Nile Disease (WND) si
basa sulle seguenti componenti:
sorveglianza su uccelli stanziali di specie “sinantropiche”.
In caso di mancato raggiungimento del 50% delle attività
previste, è possibile, in alternativa, attuare la sorveglianza su
allevamenti avicoli rurali o all’aperto o tramite il posizionamento
di gruppi di polli sentinella;
sorveglianza negli equidi;
sorveglianza entomologica;
sorveglianza dell’avifauna selvatica di specie migratorie.
Sorveglianza
Per il 2010 sono state individuate 3 aree
geografiche distinte (Fig. 1):
A. area con circolazione virale (ACV); è
l’area che è stata interessata dalla
circolazione del West Nile virus (WNV) nel
corso del 2009;
B. area di sorveglianza esterna alla ACV
(AE), estesa per un raggio di 20 km intorno
ai casi verificatisi nelle zone più esterne
dell’ACV;
C. undici aree a rischio (AR).
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
Ad oggi, sono stati confermati dal Centro di Referenza
Nazionale per lo Studio delle Malattie Esotiche (CESME):
una positività alla PCR su organi di un esemplare di ghiandaia
(Garrulus glandarius) catturato in provincia di Modena;
nove positività alla PCR di altrettanti pool di zanzare
catturate in provincia di Venezia, di Rovigo e di Modena;
quarantacinque focolai di WND negli equidi distribuiti nelle
province di Trapani, Venezia, Campobasso (primo in Molise),
Bologna.
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
Equidi
La sorveglianza negli equidi viene effettuata tramite l’esame
periodico di equidi sentinella e la verifica di casi sospetti di WND.
Tali attività di sorveglianza hanno permesso
di confermare 45 focolai di WND negli equidi
41 in provincia di Trapani;
2 in provincia di Venezia;
1 in provincia di Campobasso;
1 in provincia di Bologna.
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
Uccelli
La sorveglianza su uccelli stanziali appartenenti a specie
sinantropiche è effettuata per evidenziare precocemente la
circolazione virale.
Ad oggi, una ghiandaia (Garrulus
glandarius) catturata in provincia di
Modena il 4 agosto 2010 è risultata
positiva alla PCR
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
Specie Avicole
La sorveglianza sugli avicoli è effettuata come alternativa alla
sorveglianza sulle specie sinantropiche.
Sorveglianza
Situazione epidemiologica in Italia
Zanzare
L’attività entomologica ha lo scopo di determinare la
composizione della fauna culicidica, di individuare le specie di
zanzare responsabili della trasmissione del WNV sia nel ciclo
enzootico che epizootico della malattia.
I pool di zanzare sono
analizzati tramite PCR
Controllo zanzare





Riduzione dei vettori
Protezione del personale
Controllo biologico
Larvicidi
Adulticidi
Controllo zanzare
Riduzione delle fonti
Eliminare i siti larvali
− Vasche,
pozzanghere, piscine abbandonate
Controllo zanzare
Riduzione delle fonti
Rendere i siti inospitali per la
replicazione larvale
Educazione pubblica
Controllo pozzanghere
− Scarichi fognari, drenaggio
Controllo zanzare
Protezioni per il personale
 Ridurre i tempi all’aria aperta





- Specialmente nelle ore serali
Indossare pantaloni e maniche
Usare repellenti per zanzare
Non impiegare insetticidi sugli animali
Assicurarsi che i vetri delle finestre siano intatti
Usare luci antizanzara all’esterno
Controllo zanzare
Controllo biologico
 Utilizzare predatori che si nutrono di larve e pupe
- Gambusia
- Gambusia affinis, G. holbrooki
 Altri agenti sono stati usati ma non sono facili da
reperire
- Funghi, protozoi, nematodi
 Copepodi
Controllo zanzare
Larvicidi
 Impiegare quando è impossibile usare il controllo
biologico e/o la riduzione delle fonti
 Più efficaci e target-specifici
 Applicare a piccole aree geografiche
Adulticidi
 Quando altre misure di controllo non
hanno successo
 Meno efficaci
Sorveglianza
Necroscopie uccelli morti
Gruppi di polli sentinella
Raccolta zanzare
− Test di isolamento virale
− Campioni per specie
Larve ed adulti di zanzare
− Mappatura
− Registrazione delle catture
Biosicurezza
 Precauzioni per zanzare
- repellenti, maniche lunghe, etc
 Indossare guanti per raccogliere uccelli morti
 Lavare le mani dopo manipolazioni
 Quando possibile manipolare le carcasse sotto cappe
di biosicurezza durante le necroscopie
Quindi..
L'aumento dei casi di WND rilevati in Europa e nel bacino
del Mediterraneo sia nell'uomo sia negli equidi testimonia
la grande capacità di diffusione del virus della WND, in
grado di coinvolgere nuovi territori e popolazioni di ospiti
recettivi.
Data
l'importanza
di
tale
Zoonosi,
ulteriori
approfondimenti sono necessari per chiarire i motivi
ecologici ed epidemiologici che sono alla base della
comparsa/ricomparsa dell'infezione in questi territori.
È inoltre necessario incrementare le attività di
sorveglianza al fine di monitorare la diffusione del WNV e
adottare adeguate e tempestive misure per la salvaguardia
della salute pubblica.
USUTU
Definizione
USUTU
Malattia trasmessa da zanzare sostenuta da
un virus identificato come USUTU virus
(USUV), membro del sierogruppo del virus
dell’encefalite giapponese (JEV) entro la
famiglia FLAVIVIRIDAE
Eziologia
Flavivirus
 Sferici
 Provvisti di envelope
 40-60 nm di diametro
 Singolo filamento di RNA
 Virione con 3 proteine strutturali:
- del capside (C)
- di membrana (M)
- dell’envelope (E)
USUTU
Eziologia
USUTU
Mediante studi di cross-neutralizzazione con antisieri
policlonali i Flavivirus sono stati suddivisi in 8 complessi
antigenici.
In base alle omologie nucleotidiche e all’albero
filogenetico il genere Flavivirus è stato segregato in 14
clades appartenenti a 3 cluster.
USUTU virus è stato classificato nel gruppo del virus
dell’encefalite Giapponese del cluster mosquito-borne.
Eziologia
Tale cluster comprende inoltre:
USUTU
 Cacipacore virus (CPCV), Koutango virus (KOUV), JEV,
Murray Valley encephalitis virus (MVEV), Alfuy virus
(ALFV), St Luis encephalitis virus (SLEV), WNV, Kunjin
virus (KUNV), Yaounde virus (YAOV)
Storia
USUTU
Il primo isolamento di USUV è avvenuto nel 1959 da un
pool di zanzare (Culex univittatus) in sud Africa.
Il virus isolato venne registrato sotto il numero di
referenza SA Ar 1776.
Il virus era strettamente correlato al virus West Nile
ma antigenicamente distinto e il nome USUTU venne
dato in relazione al nome del fiume presso il quale
vennero raccolte le zanzare.
Storia
USUTU
In seguito il virus venne isolato anche da altre
specie di zanzare:
Coquillettidia aurites, Culex spp., Culex perfuscus,
Aedes minutus, Mansonia africana.
Recentemente è stato isolato da Aedes albopictus o
zanzara tigre
Storia
USUTU
Oltre alle zanzare, il virus venne isolato da almeno 3
specie di uccelli stanziali africani:
Bucero fischiatore
Tordo del Kurrichane
Little greenbul
Storia
USUTU
Il primo isolamento da mammiferi avvenne in un ratto
africano del genere Praomys spp.
Successivamente da un uomo con febbre e rash
cutanei nell’Africa centrale.
Primo isolamento di Usutu
virus associato a mortalità
in uccelli in Austria
USUTU
Nel periodo Agosto/Settembre 2001, si osservò in
Austria, la morte di un notevole numero di merli.
Contemporaneamente 5 allocchi vennero trovati morti
nello zoo di Vienna.
Questa mortalità inusuale di varie specie di uccelli
ricordò l’epidemia da WNV che avvenne negli USA.
Indagini patologiche e virologiche sull’episodio austriaco
dimostrarono USUV come agente causale.
Primo episodio di USUV fuori dai confini africani.
Primo isolamento di Usutu
virus associato a mortalità
in uccelli in Austria
USUTU
Nell’anno seguente su 72 uccelli analizzati vennero
trovati positivi ad USUV:
 28 merli
 1 cinciarella
 1 passero domestico
Contemporaneamente si osservò una
drastica diminuzione della popolazione
di merli a Vienna ed aree circostanti.
Analisi genomica e
caratterizzazione del ceppo
USUV austriaco
USUTU
Mediante RT-PCR e sequenziamento del genoma virale si
è ottenuta la completa sequenza genomica di USUV
isolato in Austria.
La sequenza genomica venne comparata con il ceppo di
referenza africano SA Ar 1776:
 Omologia nucleotidica del 97%
 Omologia aminoacidica del 99%
Comparato con gli altri Flavivirus la più alta omologia si ebbe
con i virus del gruppo JEV:
MVEV (73%), JEV (71%), WNV (68%)
Albero
filogenetico
 basato sulla correlazione
della sequenza genomica tra
Flavivirus
USUTU
Trasmissione
L'USUTU virus è trasmesso dalle zanzare
(principalmente complesso Culex pipiens)
e infetta soprattutto gli uccelli selvatici
Sintomatologia
USUTU
 Malattia clinica solo in alcune specie di uccelli selvatici
Di solito si ha morte improvvisa
Quando presenti:
- Apatia
- Piumaggio arruffato
- Incoordinazione dei movimenti
- Incapacità al volo
- Morte entro 2-24 ore
Mortalità
USUTU
L'USUTU virus può portare elevata mortalità
negli ucceli, specialmente nei merli
(Turdus merula)
Necroscopia
H = cuore
L = fegato
Epatomegalia
Lesioni miocardiche
Necroscopia
S = milza
L = polmoni
Enterite sieromucosa
Splenomegalia
Stomaco repleto
P = stomaco ghiandolare
I = intestino
Metodi diagnostici
USUTU
 Esame necroscopico
- Spleno ed epatomegalia, stomaco repleto ed enterite
sieromucosa
 Esame istologico
- Necrosi neuronale multifocale, noduli gliali nel cervello,
degenerazione miocardica, splenite ed epatite necrotica
 Isolamento virale
- Colture cellulari (VERO PK-15, fibroblasti di oca) non umane
- Inoculazione sacco allantoideo di uova embrionate di oca
- Inoculazione intracerebrale di topi lattanti
- Immunoistochimica
- Ibridazione in situ
- RT-PCR
Metodi diagnostici
USUTU
Sierologia
 ELISA
 Immunofluorescenza indiretta
 Immunoperossidasi indiretta
Poco utilizzati per la scarsa
disponibilità di anticorpi
per uccelli selvatici
 Test di neutralizzazione riduzione placche (PRNT)
 Inibizione dell’emoagglutinazione (HI)
Gold
standard
Diffusione di USUV in Europa
Prima del 2001: isolato solo in zone dell’Africa
tropicale e subtropicale
Dal 2001: Segnalato in Europa centrale (Austria)
poi in Ungheria e nelle zanzare in Catalogna
(Spagna), e in Italia
• Portato dall’avifauna migratoria ?
• Adattato alle specie vettore europee ?
Diffusione di USUV in Europa
2005-2006
 Agosto 2005 – Budapest (Ungheria)
- 7 merli positivi a USUV
 Estate 2006 – Zoo di Zurigo (Svizzera)
- su 105 uccelli (passeriformi e strigiformi) trovati morti il
maggior numero era positivo a USUV
 Estate 2006 – Allevamento strigiformi Nord Italia
- 1 allocco positivo a USUV
La sequenza genomica dei ceppi ungheresi, svizzeri ed italiani,
mostrava una omologia del 99%
Stessa percentuale di similarità si otteneva
comparandoli con il ceppo austriaco.
Infezione in altre specie animali
 La malattia clinica si evidenzia solo in alcune specie di
uccelli selvatici
 Inoculazione intraperitoneale in topi di 1 settimana
determina depressione, paraplegia, paralisi e coma 6-11 gg. p.i.
 Topi adulti sono refrattari
 Polli domestici non sviluppano la malattia clinica ma
producono risposta sierologica  sentinelle nei programmi di
sorveglianza
 Nelle oche il virus replica ma non da malattia clinica
né viremia
Infezione in uomo e mammiferi
USUTU
L’infezione di mammiferi e dell’uomo è un evento molto
raro, anche se le prove in vitro dimostrano la
moltiplicazione virale anche in cellule di mammifero
(Bakonyi T. et al, Emerging Infectious Diseases 2005)
Effetto Citopatico (CPE) di Vero cells causato
dall’infezione di Usutu virus i, 4 giorni
postinfezione
Infezione nell’uomo
USUTU
 USUV è in grado di infettare l’uomo senza provocare
malattia grave.
 Talvolta, sono stati descritti rash cutanei transitori
Infezione nell’uomo
Nel 2007 e nell’estate del 2008 la presenza del virus Usutu
viene svelata attraverso il controllo sierologico di polli
sentinella senza mortalità apparente nelle specie selvatiche.
Hanno fatto seguito due isolamenti virali in due pazienti
donne, una sessantenne in Emilia Romagna, dove nello stesso
periodo era in corso una importante epidemia di West Nile, ed
una quarantenne di ritorno da un viaggio in Egitto, colpite
rispettivamente da meningoencefalite ed encefalite gravi.
Infezione nell’uomo
Entrambe le pazienti avevano il sistema immunitario compromesso
da patologie concomitanti e questo potrebbe aver amplificato
l’effetto patogeno del virus che nell’uomo non aveva mai in passato
provocato sintomatologia grave.
In uno dei due casi, la sintomatologia nervosa si è evidenziata dopo
un trapianto di fegato.
“First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy”
Pecorari M, Longo G, Gennari W, Grottola A, Sabbatini AM, Tagliazucchi S. et al.
August-September 2009. Euro Surveill