Nessun titolo diapositiva - Classe L
annuncio pubblicitario
DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base • Enzimi di restrizione (Endonucleasi) •Gel elettroforesi •Ibridizzazione •PCR (Polymerase Chain •Reaction) •Sequenziamento Tecniche di base • Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) • Gel elettroforesi • Ibridizzazione • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Sequenziamento Enzimi di restrizione • Enzimi provenienti da batteri • Svolgono azione protettiva • Degradano il DNA di virus • Riconoscono specifiche sequenze di DNA • Di regola riconoscono sequenze di 4-8 pb •Premio Nobel 1978 (Arber, Nathans, Smith) Enzimi di restrizione digestione con EcoRI GAATTC G CTTAAG CTTAA AATTC G Nome Batterio di prov. Sito di ric. Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H G GATCC Eco RI Eschericia coli RY13 G AATTC Hind III Haemophilus influenza Rd A AGCTT Nae I Nocardia aerocolonigenes GCC GGC Pst I Providencia stuartii CTGCA G Sma I Serratia marcescens CCC GGG Enzimi di restrizione • Tagliano in DNA sempre nello stesso sito • Utilizzo per creare frammenti di DNA • Per inserire DNA estraneo nel genoma • Produconi frammenti di DNA di prevedibili dimensioni Tecniche di base • Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) • Gel elettroforesi • Ibridizzazione • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Sequenziamento Elettroforesi su gel • Separa i frammenti di DNA in base alla loro dimensione • Utilizza un campo elettrico • Il DNA è caricato negativamente • La separazione avviene in una matrice di gel • Permette la visualizzazione di frammenti di DNA Elettroforesi su gel ds DNA Digestione con enzima di restrizione direzione della migrazione + L’enzima taglia il tratto di DNA di interesse in corrispondenza dei siti di restrizione( ): sul cromosoma normale (HbA), con il probe utilizzato, crea un frammento di 1.15 kb; sul cromosoma col gene mutato, poiché la mutazione comporta l’abolizione del sito di restrizione intermedio, crea un frammento di 1.35 kb Applicazione diagnostica di frammento di restrizione Applicazione diagnostica di frammento di restrizione Tecniche di base • Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) • Gel elettroforesi • Ibridizzazione • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Sequenziamento Ibridizzazione Una sequenza di DNA si appaia con una sequenza nucleotidica complementare •Si denatura il DNA col calore (singola elica) • Riducendo la temperatura le sequenze complementari si appaiano (re-annealing o ibridizzazione) Probe o sonda “marcata” DNA in esame a singola elica Sonda o probe (sequenza nota) DNA in esame sequenza DNAa in esame singola elica La sonda di DNA (a singola elica) si lega (ibridizza) con la sequenza complementare se presente nel DNA in esame. Per evidenziare l’avvenuta ibridizzazione si utilizza la metodica del: Southern blotting (Ed Southern – 1975) Trasferimento dei frammenti di DNA da un gel ad una membrana di nitrocellulosa •Ibridizzazione con probe (sonda) di DNA radiomarcato •Visualizzazione di specifici frammenti di DNA Separazione frammenti in gel di agarosio Carta da filtro Nitrocellulosa Nitrocellulosa Gel Spugna Soluzione alcanina Ibridizzazione con probe radiomarcato Autoradiografia 1. 2. 3. DNA in esame Digestione con enzimi di restrizione Creazione di frammenti Tecniche di base • Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) • Gel elettroforesi • Ibridizzazione • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Sequenziamento La Polymerase Chain Reaction (PCR) La PCR è un potente strumento per amplificare il DNA , in milioni di copie, mediante la ripetizione della replicazione di una molecola stampo, in un breve periodo di tempo. Il processo utilizza sets di oligonucleotidi specifici (primers), sintetizzati in vitro, per innescare la sintesi di DNA. Il disegno dei primers (inneschi) dipende dalla sequenza del DNA che si vuole analizzare. PCR La metodica è ripetuta per una serie di cicli (usualmente 20 ­50) durante i quali lo stampo di DNA viene sottoposto a denaturazione (alta temperatura) e sintesi di nuovo DNA sullo stampo (bassa temperatura) innescata dall’azione guida dei primers sulle sequenze complementari di stampo mediata dalla DNA­polimerasi in presenza di nucleotidi. DNA pol •Il procedimento è stato automatizzato grazie all’impiego di una polimerasi termostabile, la Taq polimerasi PCR I prodotti della PCR sono poi analizzati mediante separazione su gel di agarosio seguito da colorazione con etidio bromuro e visualizzazione con transilluminatore a UV. PCR Tecniche di base • Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) • Gel elettroforesi • Ibridizzazione • PCR (Polymerase Chain Reaction) • Sequenziamento DNA sequencing automatizzato
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
![(Microsoft PowerPoint - PCR.ppt [modalit\340 compatibilit\340])](http://s1.studylibit.com/store/data/001402582_1-53c8daabdc15032b8943ee23f0a14a13-300x300.png)
