Nessun titolo diapositiva - Classe L

DNA
Metodiche di analisi del DNA
(cenni)
(Ingegneria genetica)
Principali tecniche di base
• Enzimi di restrizione
(Endonucleasi)
•Gel elettroforesi
•Ibridizzazione
•PCR (Polymerase Chain
•Reaction)
•Sequenziamento
Tecniche di base
• Enzimi di di restrizione
(Endonucleasi)
• Gel elettroforesi
• Ibridizzazione
• PCR (Polymerase Chain
Reaction)
• Sequenziamento
Enzimi di restrizione
• Enzimi provenienti da batteri
• Svolgono azione protettiva
• Degradano il DNA di virus
• Riconoscono specifiche sequenze di DNA
• Di regola riconoscono sequenze di 4-8 pb
•Premio Nobel 1978 (Arber, Nathans, Smith)
Enzimi di restrizione
digestione con
EcoRI
GAATTC
G
CTTAAG
CTTAA
AATTC
G
Nome
Batterio di prov.
Sito di ric.
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H G GATCC
Eco RI Eschericia coli RY13
G AATTC
Hind III Haemophilus influenza Rd
A AGCTT
Nae I
Nocardia aerocolonigenes
GCC GGC
Pst I
Providencia stuartii
CTGCA G
Sma I
Serratia marcescens
CCC GGG
Enzimi di restrizione
• Tagliano in DNA sempre nello stesso
sito
• Utilizzo per creare frammenti di DNA
• Per inserire DNA estraneo nel genoma
• Produconi frammenti di DNA di prevedibili
dimensioni
Tecniche di base
• Enzimi di di restrizione
(Endonucleasi)
• Gel elettroforesi
• Ibridizzazione
• PCR (Polymerase Chain
Reaction)
• Sequenziamento
Elettroforesi su gel
• Separa i frammenti di DNA in base
alla loro dimensione
• Utilizza un campo elettrico
• Il DNA è caricato negativamente
• La separazione avviene in una matrice
di gel
• Permette la visualizzazione di frammenti
di DNA
Elettroforesi su gel
ds DNA
Digestione con enzima
di restrizione
direzione
della
migrazione
+
L’enzima taglia il tratto di DNA di interesse in corrispondenza
dei siti di restrizione( ): sul cromosoma normale (HbA), con il probe
utilizzato, crea un frammento di 1.15 kb; sul cromosoma col gene
mutato, poiché la mutazione comporta l’abolizione del sito di
restrizione intermedio, crea un frammento di 1.35 kb
Applicazione diagnostica di frammento di restrizione
Applicazione diagnostica di frammento di restrizione
Tecniche di base
• Enzimi di di restrizione
(Endonucleasi)
• Gel elettroforesi
• Ibridizzazione
• PCR (Polymerase Chain
Reaction)
• Sequenziamento
Ibridizzazione
Una sequenza di DNA si appaia con una
sequenza nucleotidica complementare
•Si denatura il DNA col calore
(singola elica)
• Riducendo la temperatura
le sequenze complementari
si appaiano (re-annealing
o ibridizzazione)
Probe o sonda “marcata”
DNA in esame a
singola elica
Sonda o probe (sequenza nota)
DNA in esame
sequenza
DNAa
in esame
singola
elica
La sonda di DNA (a singola elica) si lega (ibridizza)
con la sequenza complementare se presente nel DNA
in esame.
Per evidenziare l’avvenuta ibridizzazione si
utilizza la metodica del:
Southern blotting (Ed Southern – 1975)
Trasferimento dei frammenti di DNA da un
gel ad una membrana di nitrocellulosa
•Ibridizzazione con probe (sonda) di
DNA radiomarcato
•Visualizzazione di specifici frammenti
di DNA
Separazione frammenti in gel di agarosio
Carta
da filtro
Nitrocellulosa
Nitrocellulosa
Gel
Spugna
Soluzione alcanina
Ibridizzazione
con probe
radiomarcato
Autoradiografia
1.
2.
3.
DNA in esame
Digestione con enzimi di restrizione
Creazione di frammenti
Tecniche di base
• Enzimi di di restrizione
(Endonucleasi)
• Gel elettroforesi
• Ibridizzazione
• PCR (Polymerase Chain
Reaction)
• Sequenziamento
La Polymerase Chain Reaction (PCR)
La PCR è un potente strumento per amplificare il DNA ,
in milioni di copie, mediante la ripetizione della replicazione di una molecola stampo, in un breve periodo di tempo. Il processo utilizza sets di oligonucleotidi specifici (primers), sintetizzati in vitro, per innescare la sintesi di DNA. Il disegno dei primers (inneschi) dipende dalla sequenza del DNA che si vuole analizzare.
PCR
La metodica è ripetuta per
una serie di cicli (usualmente 20 ­50) durante i quali lo stampo di DNA viene sottoposto a denaturazione (alta temperatura) e sintesi di nuovo DNA
sullo stampo (bassa temperatura) innescata dall’azione guida dei primers sulle sequenze
complementari di stampo mediata dalla DNA­polimerasi in presenza di nucleotidi. DNA pol
•Il procedimento è stato automatizzato grazie all’impiego di una polimerasi
termostabile, la Taq polimerasi
PCR
I prodotti della PCR sono poi analizzati mediante separazione su gel di agarosio seguito da colorazione
con etidio bromuro e visualizzazione con transilluminatore a UV.
PCR
Tecniche di base
• Enzimi di di restrizione
(Endonucleasi)
• Gel elettroforesi
• Ibridizzazione
• PCR (Polymerase Chain
Reaction)
• Sequenziamento
DNA sequencing automatizzato