La borsa vinta nell’ambito del progetto STRAIN era finalizzata al perfezionamento del profilo
professionale di ciascun vincitore e all’acquisizione di nuove tecniche; a tale scopo, dopo un
periodo iniziale di permanenza presso l’istituto TIGEM (Telethon Institute of Genetics and
Medicine), nel laboratorio della Dott.ssa De Matteis, mi sono trasferita a Milano dove ho vissuto le
realtà di due diversi laboratori di ricerca.
Infatti, sono stata ospite per il mese di Ottobre presso il laboratorio di microscopia elettronica della
Dott.ssa Maura Francolini (Istituto di Neuroscienze, CNR, Via Vanvitelli, 32), dove ho appreso le
tecniche di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica. La preparazione dei campioni
per la microscopia elettronica consiste essenzialmente nell’inclusione del campione (tessuto) in
resina, taglio al microtomo e contrastamento delle sezioni. La fase preparativa è seguita, poi, dalla
visualizzazione al microscopio elettronico a trasmissione (o a scansione) e dall’analisi delle
immagini acquisite, mediante l’utilizzo di software dedicati. Mi sono dedicata personalmente a
ciascuna di queste fasi al fine di apprendere le peculiarità di ciascun processo. Nel laboratorio della
Dott.ssa Francolini, non mi sono occupata di un vero e proprio progetto di ricerca, ma mi sono
dedicata all’acquisizione delle diverse tecniche messe in pratica in laboratorio.
Da Novembre fino alla fine del progetto STRAIN, sono stata ospite presso il laboratorio della
Dott.ssa Patrizia D’Adamo (Istituto San Raffaele di Milano, Via Olgettina, 58). La mia permanenza
presso questo laboratorio era finalizzata all’acquisizione di competenze nell’ambito delle colture di
neuroni ippocampali derivati da modelli animali murini. Oltre all’apprendimento delle suddette
metodologie, mi sono occupata di investigare il ruolo dell’enzima OCRL (una fosfatasi studiata dal
gruppo della Dott.ssa De Matteis al TIGEM) nei neuroni ippocampali di topo.
E’ stato molto interessante, adoperare delle tecniche di immunoprecipitazione al fine di individuare
gli interattori dell’enzima OCRL nel cervello: ho prodotto, quindi, dei lisati di cervelli murini e ho
utilizzato questo materiale nei miei esperimenti per precipitare OCRL mediante l’utilizzo
dell’anticorpo diretto contro l’enzima.
In parallelo ho condotto degli esperimenti di immunofluorescenza su neuroni in coltura da 14 giorni
(14 Days In Vitro, 14 DIV), al fine di individuare la precisa localizzazione di OCRL nei neuroni
ippocampali murini. Per quanto riguarda questi ultimi esperimenti, per il momento ho solo messo a
punto le condizioni sperimentali in modo da ottenere un dato attendibile ed inequivocabile; lavorerò
personalmente per la continuazione di questo tipo di studio.
Infine ho utilizzato degli “short interfering RNA” (shRNA) virali per silenziare il gene che codifica
per la proteina OCRL, in maniera tale da investigare il ruolo dell’enzima nel cervello analizzando
gli effetti provocati dalla sua assenza, naturalmente in rapporto ad una condizione di normalità
rappresentata da cellule non trattate con gli “shRNA”, in cui, quindi, OCRL non risulta assente. Con
questa metodica ho ottenuto un silenziamento del gene di interesse del 50%.
Per quanto concerne i risultati, siamo in fase di analisi degli interattori di OCRL in modo da poterli,
poi, confrontare con gli interattori dell’enzima individuati negli altri tipi cellulari (come le cellule
HK2, di tubulo prossimale renale); relativamente alla localizzazione di quest’enzima, non ho a
disposizione dati attendibili dal momento che finora ho solo messo a punto le condizioni
sperimentali ideali per la localizzazione. Presumibilmente, considerato il ruolo del suo principale
substrato, PIP2 (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate), nell’endocitosi e nel riciclo delle vescicole
pre-sinaptiche questo enzima potrebbe essere associato alle pre-sinapsi. In ogni caso, vanno messe a
punto le condizioni e ripetuti diverse volte gli esperimenti di immunofluorescenza al fine di ottenere
un dato certo.
La struttura presso la quale sono stata ospite ad Ottobre è il laboratorio della Dottoressa Maura
Francolini, presso l’Istituto di Neuroscienze del CNR; il laboratorio era dotato di due microtomi
(per il taglio dei campioni inclusi in resina), un microscopio elettronico a trasmissione e tutte le
attrezzature necessarie per la microscopia elettronica.
Da Novembre in poi, invece, ho lavorato presso l’Istituto San Raffaele (Via Olgettina, 58), nel
laboratorio della Dottoressa Patrizia D’Adamo. La struttura è provvista di stabulario, per il ricovero
degli animali utilizzati a fini sperimentali, camere sterili e laboratori frequentati dai ricercatori. Il
laboratorio in cui ho lavorato io è essenzialmente dedicato alla messa in coltura dei neuroni, oltre
che alla biochimica, all’analisi dell’espressione genica e all’imaging. Per l’acquisizione dei dati per
l’imaging ho utilizzato un microscopio Olympus “DeltaVision” con sistema di deconvoluzione
delle immagini.
Altre attività di formazione svolte durante la permanenza a Milano:
10 Ottobre: Workshop di stereologia (presso Università Statale di Milano)
30-31 Ottobre: Corso di ultracriomicrotomia (presso Università Statale di Milano)
4-6 Marzo: Scuola di Microscopia, organizzata da Nikon (presso Istituto TIGEM)
RIFERIMENTI TUTOR:
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Dr. Antonella De Matteis, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)
Via Campi Flegrei, 34
80078 - Pozzuoli (Naples)
e-mail: [email protected]
phone: +39-081-6132-220
-
Dr. Patrizia D'Adamo, Dibit - San Raffaele Scientific Institute
Via Olgettina 58.
20132 Milano, Italy
e-mail: [email protected]
Phone: +39-02-26434604
Dr. Maura Francolini, Neuroscience Institute, CNR
Via Luigi Vanvitelli, 32
20129 Milano, Italy
e-mail: [email protected]
Phone: +39-02-50316977
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