Introduzione
Esami virologici
La scelta del materiale da indagare e del virus da ricercare deve tenere conto
della sindrome clinica e della sede probabile di infezione.
La scelta del materiale e della metodologia diagnostica ha implicazioni
importanti per la qualità e la quantità di informazione contenuta nella risposta.
A questo proposito è fondamentale:
- il momento del prelievo, cioè‚ il tempo che intercorre tra l' inizio dell'
infezione e l' esecuzione dei prelievi per la diagnosi di laboratorio.
- il tempo che intercorre tra il prelievo e l' arrivo dello stesso in laboratorio;
- la conservazione del prelievo stesso.
Norme generali per la coltura di campioni biologici.
1 - Tipo di campione: il prelievo per la diagnosi di una sindrome clinica deve
rappresentare la sede di infezione; quando questo non è possibile, occorre
tenerne conto nell' interpretazione del risultato.
2 - Tempo di prelievo: il materiale deve essere raccolto al più presto dopo l'
inizio dei sintomi; la vitalità del virus decade rapidamente per cui è ottimale un
campione prelevato subito e la possibilità di isolamento scende con il passare
delle ore; con qualche eccezione, si può considerare adeguato un prelievo
effettuato entro 4 giorni. Dopo sette giorni il prelievo non è idoneo, anche qui
con alcune eccezioni.
3 - Conservazione del campione:
- tempo: la situazione ideale è che intercorra il più breve tempo
possibile tra il prelievo e la procedura di isolamento in coltura; dal
momento del prelievo la vitalità del virus tende a calare, talora in
modo molto rapido (vedi VZV); il processo viene rallentato dalla
conservazione a +4°C fino al momento della procedura di
isolamento: per i virus che vengono comunemente isolati il campione
non è idoneo se è conservato per più di 24 ore. Se non si possono
rispettare questi tempi e non si può ripetere il campione si può
minimizzare il calo di infettività conservando a -70-80°C. Non
congelare mai a -20°C.
- mezzo di trasporto: materiali sterili (CSF, sangue, ecc.) non
necessitano di mezzo di trasporto, vanno solo mantenuti a +4°C;
materiali liquidi potenzialmente contaminati (B.A.L., urina, ecc.) non
necessitano di mezzi di trasporto, ma è tassativo minimizzare la
possibile crescita batterica, mantenendo a +4°C e facendo pervenire
il materiale al laboratorio entro una-due ore dopo il prelievo; i
prelievi eseguiti mediante tampone vanno stemperati dentro un
mezzo decontaminante di trasporto (VT), che viene mantenuto a
+4°C fino all' arrivo in laboratorio (NB il tampone va rimosso, non
mantenuto in provetta, dopo aver 'scaricato' il materiale nel liquido di
trasporto).
Esami sierologici
Considerazioni generali.
All' interno degli agenti indagati e rispettando le modalità di esecuzione (in
particolare è importante le tempistica dell' indagine) la diagnosi sierologica è in
grado di giungere sempre ad identificare la causa, almeno in modo
retrospettivo, delle infezioni acute o croniche causate da batteri, miceti,
protozoi, e virus nel soggetto immunocompetente.
Nel paziente immunocompromesso la ricerca di anticorpi è molto meno utile
perché‚ la cinetica di produzione spesso è alterata.
Nelle infezioni croniche l' interpretazione dei dati sierologici risulta complessa e
spesso non univoca.
Modalità di esecuzione.
Tutte le determinazioni di anticorpi si eseguono nel siero, la componente
solubile che si ricava dopo centrifugazione del sangue periferico intero, dopo la
formazione del coagulo. In alcune situazioni è possibile eseguire i test
utilizzando il plasma, la parte solubile del sangue intero non coagulato, privato
della componente cellulare: globuli rossi, globuli bianchi e piastrine.
Il sangue per la sierologia va prelevato a digiuno. Il sangue intero deve essere
conservato per due ore a temperatura ambiente e dopo la formazione del
coagulo può essere conservato a +4-8°C fino a un massimo di due giorni. Il
siero separato, può essere conservato a +4-8°C per una settimana, a –20°C
per diversi mesi (il ripetuto congelamento e scongelamento del siero va
evitato, perchè accompagnato da una diminuzione del titolo di anticorpi
rilevabile).
Sieri prelevati non a digiuno possono dare interferenze nei risultati, per cui
vengono utilizzati solo in caso di urgenza. E' tassativo utilizzare aghi monouso
ed è utile raccogliere il sangue in una provetta sterile, per avere maggiori
garanzie di conservazione.
La scelta della metodologia diagnostica (ricerca di anticorpi in un siero oppure
in doppio siero, determinazioni di sottoclassi, test funzionali, ecc.) è
responsabilità del laboratorio, sentito il quesito diagnostico posto dal medico
curante.
Note. 1 - Quanto scritto si riferisce alle modalità di prelievo e conservazione del
siero allo scopo di determinare la presenza e il titolo di anticorpi. Al di là degli
anticorpi, nel siero possono essere ricercati direttamente antigeni microbici e
virali o acidi nucleici di agenti infettivi. Per le modalità di preparazione e
conservazione del siero per queste ricerche si rimanda agli specifici capitoli.
2 - In linea teorica le immunoglobuline possono essere ricercate in altri
fluidi in cui siano presenti (essudati, urine, liquor), ma i relativi test sono privi
di valenza diagnostica e possono essere eseguiti solo a scopo di ricerca.
Esami per ricerca di acidi nucleici
Norme generali
La cute umana contiene DNasi e RNasi, enzimi che degradano
rispettivamente il DNA e l’RNA ed è quindi necessario evitare qualunque
contatto tra i campioni e la cute sia del paziente sia dell’operatore; per tale
motivo la manipolazione di questi campioni richiede in ogni momento (dal
prelievo al trasporto in laboratorio) l’uso di guanti puliti.
Gli acidi nucleici sono molto sensibili alla degradazione ad opera delle DNasi
e RNasi ematiche, perciò i campioni di sangue per le ricerche su siero
devono essere sollecitamente centrifugati dopo il prelievo.
Gli acidi nucleici sono estremamente labili a temperatura ambiente, per
questo motivo tutti i campioni da utilizzare per i test basati
sull’amplificazione degli acidi nucleici devono essere processati
immediatamente dopo il prelievo; se questo non fosse possibile, i campioni
possono essere refrigerati a +4°C per brevi periodi o congelati a –20°C o
preferibilmente a –80°C. Poiché ogni ciclo di congelamento e scongelamento
comporta una parziale degradazione degli acidi nucleici, è necessario
effettuare il trasporto in appositi contenitori termici (borse termiche o
scatole di polistirolo contenenti ghiaccio) per permettere che i campioni
giungano in laboratorio ancora congelati.
