cDNA.

Lezioni di
biotecnologie
Lezione 1
Il clonaggio
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Cosa sono le biotecnologie?
Le biotecnologie sono tutte
quelle tecniche utilizzate (fin
dall’antichità) per produrre
sostanze specifiche a
partire da organismi viventi
o da loro derivati.
A metà del Novecento la
biologia molecolare offre gli
strumenti per lo sviluppo
dell’ingegneria genetica.
Ceppo di batteri E. coli che produce insulina
Cos'è l'INGEGNERIA GENETICA?
L’unione dei termini Ingegneria e Genetica sta ad indicare un
atteggiamento progettuale (ingegneria), rivolto verso il
patrimonio genetico di un organismo vivente. La Biotecnologia
avanzata (che si impegna a creare nuovi organismi a partire
dal trasferimento di geni da un organismo ad un altro), si
avvale dell’Ingegneria genetica. Quest’ultima nacque circa
vent’anni fa, fondendo competenze di genetica e di biologia
molecolare. Basilare la scoperta della struttura del DNA (acido
desossiribonucleico) da parte di James Watson e Francis
Crick nel 1953 e la scoperta di D.T. Avery negli anni ’40,
riguardante il DNA come la sostanza in cui
risiedono tutte le informazioni genetiche.
Cosa sono le Tecnologie del DNA RICOMBINANTE?
Complesso insieme di tecniche di manipolazione del
DNA che consentono di isolare dei brevi segmenti di
tale molecola, per moltiplicarli, studiarne la sequenza
nucleotidica, trasferirli nel genoma di altre cellule
controllandone l’incorporazione e l’espressione.
Il clonaggio non è la clonazione
Si definisce clonaggio un sistema per ottenere molte
copie di un tratto di DNA inserendolo in un ospite
mediante l’uso di vettori molecolari.
La clonazione in biologia è invece la riproduzione
agamica, naturale o artificiale, di individui o cellule con
identico patrimonio genetico (cloni). Esempi di processi
clonogenici naturali sono la scissione binaria dei batteri
o la mitosi delle cellule eucariotiche.
Le tappe del clonaggio
Il clonaggio richiede:
• l’isolamento di una particolare sequenza di DNA
(non necessariamente codificante per una proteina)
dall’insieme di tutte le sequenze del DNA di un
organismo (genoma);
• l’inserimento della sequenza di DNA in una cellula
ospite, spesso diversa da quella da cui origina il DNA
da clonare, tramite l’utilizzo di molecole di DNA
trasportatrici (vettori molecolari);
• la moltiplicazione delle cellule riceventi;
• la selezione delle cellule che effettivamente
contengono la sequenza del DNA di interesse.
L’isolamento del DNA di partenza
Il DNA da clonare può essere un segmento del genoma
oppure una copia a DNA di un RNA messaggero
(mRNA).
Nel primo caso è possibile isolare anche sequenze non
codificanti, come i promotori o gli introni presenti all’interno
dei geni eucariotici.
Nel secondo invece si può prelevare solo la sequenza
espressa di un gene, allo scopo di fare esprimere la
proteina corrispondente in un organismo diverso da quello
originario: è questo l’approccio più usato in
biotecnologia.
Funzione dei geni
•Un gene-un carattere Gregor Mendel; seconda metà dell’800
•Un gene-un enzima
•Un gene-una proteina
Archibald Garrod; prima metà del 900 George
Beadle ed Edward Tatum
•Un gene-un polipeptide
•Un gene-un RNA
Il gene è l’unità di trascrizione, costituita da un segmento di DNA che
codifica per una molecola di RNA e dalle sequenze necessarie alla sua
trascrizione
L’unità di trascrizione
Il promotore è la regione del DNA che segnala:
•qual è la direzione della trascrizione
•qual è il sito di inizio della trascrizione
•quale dei due filamenti di DNA deve essere trascritto
In un tipico gene eucariotico, subito prima della regione codificante troviamo
un
al quale si lega l’RNA polimerasi per dare inizio al processo di
trascrizione. Tuttavia l’RNA polimerasi eucariotica, a differenza di quella
procariotica, non riconosce direttamente la sequenza del promotore, ma ha
bisogno di altre molecole.
All’estremità opposta del gene, dopo la sequenza codificante, si
trova una sequenza di DNA chiamata terminatore, che segnala il
punto di arresto della trascrizione. Il terminatore non deve essere
confuso con il codone di stop (che fa parte del gene): la
sequenza del terminatore infatti si trova fuori dal tratto
codificante, di regola dopo il codone di stop, e segnala la fine
della trascrizione a opera dell’RNA polimerasi.
Gli studi sul genoma eucariotico hanno portato ad una sorprendente
scoperta: molti geni che codificano proteine contengono anche
sequenze di basi non codificanti, dette introni, intercalate ai tratti
codificanti, definiti esoni .I geni formati da esoni e introni sono chiamati
geni interrotti; ognuno di essi inizia e finisce con un esone.
Cosa sono gli introni?
Gli introni sono sequenze di un gene che vengono trascritte in RNA, ma non
vengono tradotte in proteine
Caratteristiche degli introni
•Variano per numero (nell’uomo da 0 a 60)
•Variano per lunghezza (da 200 fino a 50000 nucleotidi)
•Sono in genere più lunghi degli esoni
•Negli eucarioti superiori il numero medio di introni per gene aumenta
all’aumentare della complessità degli organismi
•Sono presenti quasi esclusivamente nei geni eucariotici
Nei geni degli eucarioti le sequenze codificanti per
proteine (esoni) sono interrotte da sequenze non
codificanti (introni). e ricucitura Il trascritto primario,
prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad
un processo di taglio (splicing): gli introni vengono
eliminati e gli esoni riuniti uno all’altro.
La molecola di mRNA maturo che esce dal nucleo
sarà costituita da una sequenza codificante continua
Le biblioteche di cDNA
La copia a DNA di un mRNA viene detta DNA
complementare o cDNA. L’insieme dei cDNA clonati
viene detto biblioteca di cDNA.
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Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (I)
Per isolare gli mRNA di una cellula a partire dalla
miscela di tutto l’RNA, si sfrutta la loro caratteristica
di avere una sequenza all’estremità 3’, costituita da
circa 200 residui di adenosina (coda poli-A).
Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (II)
La miscela degli RNA cellulari viene messa in contatto
con una resina a cui sono attaccati dei corti
oligonucleotidi costituiti da timidine (poli-T).
Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (III)
Gli mRNA vengono successivamente staccati dalla resina e
raccolti in forma pura.
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (I)
Per preparare i cDNA a partire da mRNA, si utilizza un
enzima virale: la trascrittasi inversa (RT). Questa
polimerasi, la cui scoperta fruttò il premio Nobel per la
Medicina nel 1975 a David Baltimore e Howard
Temin, è l’unico enzima esistente in grado di generare
una copia di DNA a partire da una stampo di RNA e
viene usato dai retrovirus come HIV per la replicazione
del loro genoma.
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (II)
La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell’mRNA,
generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA.
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (III)
La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento
a RNA, esponendo la singola elica di DNA.
https://www.youtube.com/watch?v=lvAFbEB-El8
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (IV)
La trascrittasi inversa sintetizza il filamento
complementare di DNA, generando un cDNA a doppia
elica.
Le biblioteche di cDNA:
i vettori di clonaggio (I)
Per inserire i cDNA all’interno di una cellula ospite si
utilizzano molecole di DNA circolare: i vettori plasmidici.
Si tratta di elementi genetici naturali dei batteri (plasmidi)
modificati dall’uomo.
Le biblioteche di cDNA:
i vettori di clonaggio (II)
I vettori plasmidici
contengono un’origine di
replicazione per potersi
duplicare insieme al DNA
cellulare, un gene
marcatore (resistenza a un
antibiotico) per poter
selezionare le cellule che li
contengono e siti di taglio
unici per enzimi di
restrizione.
Le biblioteche di cDNA:
gli enzimi di restrizione (I)
Per preparare il cDNA e il vettore per il clonaggio è
necessario utilizzare le endonucleasi di restrizione,
enzimi batterici in grado di legarsi a specifiche
sequenze del DNA (generalmente di 4 – 6 paia di basi)
e tagliare la doppia elica all’interno della sequenza
bersaglio.
Le biblioteche di cDNA:
gli enzimi di restrizione (II)
Il taglio genera estremità che possono essere piatte
oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono
coesive (sticky ends).
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Le biblioteche di cDNA: le ligasi
Per inserire il cDNA all’interno di un vettore è
necessario utilizzare le DNA ligasi, enzimi presenti in
tutte le cellule e in grado di ripristinare il legame
fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in una
catena di DNA. In questo modo è possibile saldare
insieme due frammenti di DNA distinti.
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (I)
I cDNA e il vettore di
clonaggio vengono
digeriti con la stessa
endonucleasi di
restrizione. In questo
modo le estremità del
vettore e quelle dei
cDNA saranno
complementari.
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (II)
Tramite la DNA ligasi i cDNA vengono saldati all’interno
del vettore pasmidico.
La reazione della DNA ligasi (I)
La reazione della DNA ligasi ha tre passaggi. Nel primo
si ha il legame tra un gruppo NH— della lisina del sito
attivo dell’enzima e un AMP (donato dall’ATP negli
eucarioti o dal NAD+ nei procarioti) con formazione
dell’intermedio covalente enzima adenilato.
La reazione della DNA ligasi (II)
L’AMP quindi si trasferisce dalla lisina dell’enzima al 5’
fosfato del nucleotide da saldare.
La reazione della DNA ligasi (III)
Questo permette l’attacco nucleofilo da parte
dell’estremità 3’ OH del nucleotide adiacente al 5’ fosfato
legato all’AMP, che risulta nella formazione del nuovo
legame fosfodiesterico tra i due nucleotidi con rilascio di
AMP.
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (III)
I DNA ricombinanti (cioè vettori contenenti i cDNA)
vengono inseriti in cellule batteriche.
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (IV)
Le cellule geneticamente
modificate (ovvero contenenti il
vettore) acquisiranno la
resistenza all’antibiotico
portata dal vettore stesso,
quindi le cellule sopravvissute
conterranno tutti i cDNA. Ogni
singola cellula originerà un
clone di un singolo cDNA.
L’insieme dei cloni sarà la
biblioteca a DNA.
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Clonaggio diretto di una sequenza
genica: la PCR (IV)
Utilizzando inneschi che
contengono le sequenze di
taglio per endonucleasi di
restrizione, le copie del
cDNA di interesse generate
per PCR possono essere
direttamente inserite nei
vettori di clonaggio con la
DNA ligasi.